Podcasts about phosphorylierungen

Desoxyribonuklerinsäure (DNA), die Erbinformation, definiert die Struktur und Funktion jeder Zelle. In Eukaryoten ist sie um Oktamere aus den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 gewunden. Sie bilden mit der DNA höhere Strukturen, das sog. Chromatin. Die Struktur des Chromatins beeinflusst direkt die Aktivität der gebundenen DNA. Eukaryoten besitzen daher viele molekulare Mechanismen zu ihrer Veränderung, z.B. posttranslationale Modifizierungen (PTMs) von Histonproteinen oder den Austausch von kanonischen Histonen mit Histonvarianten (z.B. H3.1, H3.2, H3.3, u.a.). Für einige Varianten sind ihnen eigene, charakteristische PTMs beschrieben, z.B. die Phosphorylierung des Serins 31 der Variante H3.3 (H3.3S31ph). Die Histone Code Hypothesis postuliert, dass PTMs von Histonen in festen Mustern vorliegen können. Die Switch Hypothesis beschreibt die Regulation von Bindemolekülen an Histone durch benachbarte PTMs. Auf ihrer Grundlage wurde die These der Doppelmodifizierung einer bekannten Trimethylierung der Aminosäure (AS) Lysin 79 mit einer mutmaßlichen Phosphorylierung der AS Threonin 80 auf Histon H3 aufgestellt (H3K79me3T80ph). Neben der Etablierung eines einfachen Systems zur Identifizierung bisher unbeschriebener Phosphorylierungen bestand ein zweites Ziel dieser Arbeit im Nachweis der Phosphorylierung von H3 Threonin 80 in vivo. Eine weitere Zielsetzung lag in der genaueren Charakterisierung der bereits beschriebenen Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph, deren Expression zwar eng umschrieben ist, über deren spezifische Funktionen, Kinase und mögliche Effektorproteine aber wenig bekannt ist. Um einen Überblick über Phosphorylierungen verschiedener Histonroteine zu gewinnen, wurden unterschiedliche Polyacrylamidgel-Elektrophoresen Verfahren (PAGE) etabliert. Zum Einsatz kamen A/U-, T/A/U- und 2D-T/A/U-PAGE Verfahren. Sie ermöglichten in Übereinstimmung mit der Literatur die Auftrennung bekannter PTM und stehen nun für weiterführende Studien zur Verfügung. Der massenspektrometrische Nachweis der putativen PTM H3K79me3T80ph in vivo gelang nicht. Trotz optimierter Versuchsbedingungen konnte die Phosphorylierung weder in der MALDI-ToF, noch in der Orbitrap MS/MS nachgewiesen werden. Initiale Antikörperdaten wurde aufgrund einer aufgedeckten Kreuzreaktivität in Frage gestellt. Obgleich nicht mit letzter Sicherheit gesagt werden kann, dass H3K79me3T80ph in vivo nicht existiert, wurde die These letztlich verworfen. Die molekularbiologische Untersuchung der Varianten-spezifischen PTM H3.3S31ph ergab bei verifizierter Überexpression und Chromatin-Integration punktmutierter Histone übereinstimmend Hinweise auf einen Effekt der PTM auf die Zellteilung. Es konnte gezeigt werden, dass Serin 31 bzw. ihre PTM H3.3S31ph sowohl Zellzyklus, als auch Wachstums- und Proliferationsgeschwindigkeiten von HeLa Zellen beeinflusst. Dies argumentiert für eine aktivierende Funktion von H3.3S31ph in der Mitose. Weiter konnten mithilfe eines ELISAs fünf potentielle Proteinkinasen für H3.3S31ph identifiziert werden. Vorrangig kommt dabei die nukleäre Kinase PIM1 in Betracht. Zur weiteren Untersuchung potentieller Effektorproteine wurde in vitro ein molekularbiologisches Modellsystem etabliert. Es steht nun für weiterführende Studien zur Verfügung. Erste Vorarbeiten konnten bereits zeigen, dass hier evtl. Interaktionen mit dem Linkerhiston H1 eine wichtige Rolle spielen.

Reaktive Sauerstoffspezies und ihre Interaktionen mit NO und vaskulären Signalmechanismen spielen eine fundamentale Rolle bei der Entstehung der endothelialen Dysfunktion und damit von pathophysiologischen Veränderungen innerhalb der Blutgefäße. Als Hauptquelle von reaktiven Sauerstoffspezies in Endothelzellen ist die NAD(P)H-Oxidase bekannt. Diese Arbeit klärt zugrunde liegende Signalmechanismen zur Aktivierung der NAD(P)H-Oxidase auf: Die Ergebnisse zeigen, dass die Tyrosinphosphatase SHP-1 eine wichtige Rolle bei Regulation der NAD(P)H-Oxidase spielt. Das Signal der SHP-1 wird mittels Tyrosinde- bzw. Phosphorylierungen über die Phosphatidylinositol-3-Kinase vermittelt, welche via Rac1 die NAD(P)H-Oxidase kontrolliert. Aufgrund dieser Ergebnisse könnte der SHP-1 in Endothelzellen eine zentrale Bedeutung bei der Entstehung der Endotheldysfunktion zukommen, denn ihre Aktivität ist mitverantwortlich bei der Kontrolle der NAD(P)H-Oxidase. Als physiologischen Faktor, der diesen Signalweg beeinflusst fanden wir den bekannten Wachstumsfaktor VEGF. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass Estradiol über eine Aktivierung der SHP-1 die NAD(P)H-Oxidase Aktivität reduziert. Insgesamt stellt unsere Arbeit die SHP-1 als molekularen Schalter erstmals in Zusammenhang mit der Regulierung der NADP)H-Oxidase und klärt die zugrunde liegenden Signalmechanismen auf.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Frage, ob humanes CFTR-Protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) sumoyliert wird und welche funktionelle Bedeutung die Sumoylierung des CFTRs hat. In der kaukasischen Bevölkerung gilt die Cystischen Fibrose (CF) oder Mukoviszidose als eine der häufigsten Erbkrankheiten. Mutationen im CFTR-Gen, die zu einer drastischen Beeinträchtigung der Funktion des CFTR-Proteins führen, bilden die molekulare Basis der Entstehung der CF. So sind häufig die Reifung und der Transport von CFTR an die Plasmamembran betroffen. Diese Prozesse und verschiedene Aktivitätszustände im CFTR werden u.a. durch posttranslationale Modifikationen (z.B. Phosphorylierungen) spezifischer Konsensus-Motive reguliert. In diesem Zusammenhang führte eine genaue Betrachtung der Primärsequenz von CFTR zur Identifikation von zwei hoch konservierten Motiven, die dem publizierten SUMO-Konsensus-Motiv (ψKxE, nachfolgend SUMO-Motiv genannt) an Position 447 und 1486, bezogen auf das zentrale Lysin, an welchem die Sumoylierung stattfindet, entsprachen. Die Sumoylierung, als eine Form der posttranslationale Modifikationen, wird durch kleine Ubiquitin-ähnliche Proteine (small ubiquitin-like modifier, SUMO) vermittelt. Diese stellen eine Klasse von regulatorischen Proteinen dar, die die Aktivität des Zielproteins, dessen Lokalisation oder die Interaktion mit anderen Proteinen steuern. Damit ergab sich ein relevanter Anknüpfungspunkt, die Rolle der bislang für die CFTR-Regulation noch nicht beschriebenen Form der posttranslationalen Kontrolle durch Sumoylierung zu untersuchen. Als Resultat der hier beschriebenen Untersuchungen konnte die Sumoylierung als notwendiger Bestandteil der Regulation des intrazellulären Transportes von CFTR identifiziert werden. Konkret wurde mit dem Yeast-Two-Hybrid-Verfahren gezeigt, dass CFTR-Domänen an den identifizierten SUMO-Motiven in der Nukleotid-bindedomäne 1 (NBD-1) und am C-Terminus von CFTR sumoyliert werden. Im Säugerzellsystem wurde die spezifische Sumoylierung kompletten CFTRs durch transiente Transfektion von CFTR- und SUMO-Expressionskonstrukten sowie in Zellen, welche CFTR und SUMO endogen exprimieren, verifiziert. Verhindert man weiterhin auf transiente Weise in Säugerzellen die Sumoylierung, durch Mutation der beiden SUMO-Motive oder durch Überexpression der SUMO-spezifischen Protease (SENP1), erreicht CFTR nicht die apikale Plasmamembran. Im Gegensatz zu F508, welches im ER verbleibt, wird CFTR, welches Mutationen in den SUMO-Motiven trägt, im Golgi-Apparat zurückgehalten. Diese Beobachtung konnte mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation und anschließendem Nachweis der Proteine in den entsprechenden Fraktionen über die Western-Blot-Methode gezeigt werden. Abschließend wurden am Beispiel eines zum SUMO-Motiv benachbart gelegenen Di-Leucin-Motives erste experimentelle Hinweise erhalten, wonach beide CFTR-Motive in der Interaktion mit dem für den vesikulären Transport funktionell wichtigem Adaptor-Protein (AP) Komplex zusammenwirken. Mit den vorliegenden Resultaten konnte erstmals die Hypothese formuliert werden, dass die hier beschriebene Sumoylierung eine Form der Modifikation ist, welche am Transport von CFTR an die Plasmamembran maßgeblich beteiligt ist.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Proteomstudien an Halobacterium salinarum durchgeführt, die sich generell in drei unabhängige Themenblöcke unterteilen lassen. Zunächst erfolgte die Erfassung des cytosolischen Proteoms auf standardisierten 2-D Gelen. Hierfür wurde die Auftrennung auf sogenannten Zoom-Gelen aufgrund der engen pI-Verteilung halobakterieller Proteine etabliert. Die erschöpfende Analyse der so aufgetrennten Proteine wurde mit der peptide mass fingerprinting Methode im Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. So konnten so 40% des zugänglichen cytosolischen Proteininventars identifiziert und auf Referenz 2-D Gelen kartiert werden. Des Weiteren konnten die massenspektrometrischen Proteinidentifizierungen zur intensiven Verbesserung der in vielen Fällen nicht eindeutigen Genomannotation herangezogen werden. Durch die Korrelationsanalyse von experimentellen und theoretischen pI-Werten konnten weitere Annotationsfehler behoben werden. Das Zusammenspiel von Genomik und Proteomik erlaubte die Identifizierung eines Bereichs ehemaliger Plasmid DNA, die in das Chromosom eingewandert ist. Weiter konnte für ein Plasmid gezeigt werden, dass dieser ehemalig chromosomale DNA und somit eine Reihe wichtiger und essentieller Gene enthält und deshalb eher als zweites Chromosom angesehen werden sollte. Nach der Inventarisierung folgten Analysen zur differentiellen Expression cytosolischer Proteine in Abhängigkeit unterschiedlicher Wachstumszustände. Hierbei wurde das aerobe Wachstum unter Standardbedingungen mit Wachstum unter Mangelbedingungen wie in synthetischem Medium oder unter anaeroben phototrophen Bedingungen verglichen. Bei der Analyse dieser Zustände mittels 2-DE konnten nur wenig regulierte Proteine identifiziert werden. Generell stellte sich die 2-DE aufgrund schwankender Reproduzierbarkeit und des geringen dynamischen Bereichs der gewählten Färbemethode für diese vergleichenden Analysen als wenig geeignet heraus. Die Verwendung isotopenmarkierter Sonden erlaubte hingegen einen detaillierten Einblick in die Regulationen auf Proteomebene unter besagten Bedingungen. Mit dem methodischen Ansatz der 1D-SDS PAGE LC-MALDI-TOF/TOF Analyse konnten von einem beträchtlichen Teil (ca. 40%) des cytosolischen Proteoms Regulationsinformationen erhalten werden. Auch hier zeigte sich, dass unter anaeroben phototrophen Bedingungen überraschend wenige Proteine reguliert werden müssen, damit sich der Organismus auf diese Lebensbedingung einstellen kann. Wachstum unter Nährstoffmangel in synthetischem Medium induziert überwiegend Proteine der Aminosäure- und Nukleotid-Biosynthese sowie Proteine, die am Proteinschutz und der Glykolyse beteiligt sind. Unter Standardwachstum wurden Proteine als induziert identifiziert, die bei nicht ausreichendem Vorhandensein wachstumslimitierend wirken würden. Dies waren hauptsächlich Enzyme der Thiamin und Cobalamin Biosynthese sowie des Peptid-Transportes und -Abbaues. Auch die CO2-Fixierung und die nachfolgende Gluconeogenese sind induziert. Durch die Verwendung unterschiedlicher Proteomik Ansätze konnte am Ende der Großteil der cytosolischen Proteine von H. salinarum identifiziert werden. Es scheinen nahezu alle chromosomalen Proteine auch unter Standard Wachstumsbedingungen expremiert zu werden, was starke Regulationen der Proteinkonzentrationen in Abhängigkeit unterschiedlicher Lebensbedingungen nicht notwendig macht. Der Organismus kann sich so schnell ohne großen energetischen Aufwand an wechselnde Lebensbedingungen anpassen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum untersucht. Hierbei konnten zunächst über radioaktive in vivo Markierung phosphattragende Proteine identifiziert werden. Ebenfalls gelang es, die ersten halobakteriellen Serin und Threonin Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Generell zeigte sich jedoch, dass das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum eher gering ist. Bei den identifizierten Phosphorylierungen handelte es sich ausschließlich um katalytische Zwischenprodukte. Für die Existenz von regulativen Ser/Thr oder Tyr Proteinphosphorylierungen waren keine eindeutigen Hinweise zu finden. Weiter gelang es, eine Vielzahl von N-terminal acetylierten Proteinen als eine weitere Form der posttranslationalen Modifikationen zu identifizieren.

Proteine leisten den entscheidenden Beitrag zur Struktur und Funktion der Zellen aller Lebewesen.Vieles spricht daher für eine Betrachtung des Proteoms oder einer Teilmenge davon (Subproteom), um den Zustand lebender Zellen zu beschreiben. Mit optimierten und neuen Methoden wurde das regulatorische Netzwerk, welches auf der Ebene der Trankription die Expression von Proteinen entscheidend mitbestimmt, genauer betrachtet. Hierzu wurden Zellfraktionierungsprotokolle optimiert, um die Proteine des Zellkerns und des Chromatins anzureichern und in nachfolgenden Analysen verwenden zu können. Es wurden Antikörper gegen verbreitete, funktional relevante Peptidmotive generiert. Aufbauend auf dem Konzept der Motivantikörper wurde eine Färbemethode für Zellkernproteine mit Kernlokalisationssignal entwickelt. Schließlich wurde mit den Methoden der Zellfraktionierung und spezifischeren Antikörpertechniken eine Analyse des humanen Mediator-Komplexes der RNA Polymerase II unternommen, die zur Entdeckung neuer Untereinheiten, potentiell interagierender Proteine und Phosphorylierungen im Komplex führte.

Nach der kompletten Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen des „Human Genome Project“ sind sich die Experten einig, dass die Forschung sich nun den Vorgängen der komplexen Regulationsnetzwerken auf der Proteinebene widmen muß. Die Proteomforschung bedient sich dabei der möglichst optimalen und quantitativen Auflösung von komplexen Proteingemischen. Um dies zu ereichen werden die Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) aufgetrennt. Im Rahmen der vorliegenden Promotion sollten am Beispiel ausgewählter relevanter Blutplasmaproteine das Phänomen der „ladder of spots“ untersucht werden. Dies sind Leitern von Proteinspots, die einem einzigen Protein zugeordnet werden können, sich jedoch in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF) aufgrund ihrer Nettoladung unterscheiden und aufgetrennt werden. Vor allem in 2D-Gelen von Blutplasma sind eine ganze Reihe solcher Leitern zu beobachten, und in der Regel werden sie durch posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen oder Phosphorylierungen verursacht. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch der Einfluss von Alterungsprozessen auf der Proteinebene nachgewiesen werden, der zu der Veränderung dieser Proteine in Form von Deamidierungen der Asparagin- und Glutaminaminosäuren beiträgt. Der Mechanismus der Alterung wurde ebenfalls genauer untersucht, da diese Art von Modifikationsreaktion in der Natur sowohl chemisch als auch enzymatisch ablaufen kann. Hier spielt natürlich auch die Art und Weise der Probenvorbereitung eine große Rolle bei möglichen posttranslationalen Modifikationen. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Klonierung eines der ausgewählten Proteine (ß2-Microglobulin) in E.coli mittels molekularbiologischer Techniken. Ziel der Klonierung war es festzustellen, zu welchem Zeitpunkt die zuvor entdeckten posttranslationale Modifikation im Rahmen der natürlichen Alterung von Proteinen auftritt.