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Die Staupe ist eine bedeutsame, weltweit verbreitete virale Infektionskrankheit der Hunde und vieler anderer Raubtierspezies. Aufgrund ihres oft letalen Ausgangs und der fehlenden Möglichkeit zur kausalen Therapie, stellt die aktive Immunisierung empfänglicher Tiere die wichtigste prophylaktische Maßnahme dar. Bei der Impfung exotischer Tierspezies stellt sich die Verwendung von für den Hund zugelassenen, attenuierten Lebendimpfstoffen, sowie anderer experimenteller Vakzinen, problematisch dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression verschiedener Staupevirus-Antigene durch das Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) untersucht, um einen sicheren Kandidaten-Impfstoff gegen die Staupe zu erstellen. Mittels homologer Rekombination wurden die Gene des Fusionsproteins (F), des Hämagglutinin-Proteins (H) und des Matrix-Proteins (M) des Staupe-virus (Canines Distemper Virus, CDV) einzeln oder in Kombination in das MVA-Genom inseriert. Durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzmarker war eine hocheffektive Aufreinigung und klonale Isolation der verschiedenen rekombinanten MVA möglich. Bei der anschließenden genetischen Charakterisierung konnte die korrekte und stabile Insertion der Fremdgene nachgewiesen werden. Bei der Expressionsanalyse der CDV-Proteine konnte eine vom gewählten Promotor abhängige Synthese beobachtet werden. Um die Kombinations-möglichkeit verschiedener Antigene in einem MVA-Vektor zu untersuchen, wurde F/H-rekombinantes MVA erstellt, welches beide CDV-Glykoproteine zur Expression brachte. Anschließende Untersuchungen der Wachstumseigenschaften der rekombinanten MVA zeigten deren uneingeschränkte Replikationsfähigkeit in embryonalen Hühnerzellen sowie deren Replikationsdefizienz in Säugerzellen, was zum einen für die Herstellung von Impfstoffpräparationen im großen Maßstab und zum anderen für die sichere Anwendung im zu impfenden Säuger entscheidend ist. Es konnte gezeigt werden, dass mittels MVA-Vektorsystem eine effiziente Expression von CDV-Proteinen möglich ist, was die erstellten Konstrukte zu interessanten Kandidaten-Impfstoffen gegen Staupe macht. Weitere Untersuchungen über deren Potential zur Induktion einer protektiven Immunität im Tier sind anzustreben.

Für die Entwicklung einer extern regulierbaren Expression plastidärer Fremdgene wurde das bakterielle Induktionssystem des quorum sensing in Nicotiana tabacum (Tabak) getestet. Die Komponenten zur Kontrolle der Expression eines Reporterproteins, β-Glucuronidase (GUS), wurden von Vibrio fischeri entnommen und an die Expressionsmaschinerie der Plastiden adaptiert. Um die Induzierbarkeit der GUS-Expression zu testen, wurden Blattstücke der generierten stabilen Plastomtransformanten mit N-3-(Oxohexanoyl)-L-Homoserin-Lacton (VfHSL) bzw. Ethanol als Kontrolle inkubiert. Die Expression von GUS fand bereits im nicht induzierten Zustand statt, konnte jedoch durch die Auswahl geeigneter Promotorelemente auf eine Konzentration von 0,0003 % vom gesamtlöslichen Protein erheblich gesenkt werden. Mit dem Induktor VfHSL konnte hingegen keine signifikante Steigerung der GUS-Expression erzielt werden. Mögliche Ursachen dafür werden anhand der Literatur diskutiert. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein transientes Expressionssystem aufgebaut, um Vektoren auf ihre Funktionalität zu überprüfen. Mittels Polyethylenglykol (PEG) wurden dafür Tabak-Protoplasten mit einem konstitutiven GUS-Expressionsvektor transient transformiert und reproduzierbar eine signifikante GUS-Aktivität im Zellextrakt gemessen. Die plastidäre GUS-Konzentration ließ sich indessen nicht ermitteln - Ursachen und Probleme werden diskutiert. Insgesamt lassen die Ergebnisse jedoch darauf schließen, dass der Großteil der GUS-Expression im Kern/ Cytosol stattfand, während die Expressionsrate in Plastiden für einen Nachweis zu gering war.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.