Podcasts about t zell aktivierung

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine häufig in der Pferdepopulation auf-tretende Autoimmunerkrankung, bei der schubweise autoaggressive T-Lymphozyten das Auge infiltrieren. Dort führen sie zu entzündlichen Veränderungen an der Netz¬haut, die in letzter Konsequenz eine Erblindung des betroffenen Auges verursachen. Das Ziel dieser Arbeit war es, Proteine, die auf ins Auge transmigrierten Lympho-zyten im Vergleich zu peripheren Lymphozyten differentiell exprimiert sind, zu charakterisieren um dadurch zur Aufklärung der Pathogenese der ERU beizutragen. Dabei war das Protein Septin7, welches auf peripheren Blutlymphozyten von an ERU erkrankten Pferden geringer exprimiert ist als auf denen augengesunder Kontrollpferde, von besonderem Interesse, da es eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Zytoskeletts spielt und so maßgeblich an der Pathogenese der ERU beteiligt sein könnte. Zunächst wurden sieben monoklonale Antikörper gegen equines Septin7 hergestellt und in verschiedenen Methoden eingehend auf ihre Eignung zur Detektion dieses wichtigen zytoskelettalen Proteins untersucht. Dabei konnte für die proteinanalytisch relevanten Methoden Western Blot, Durchflusszytometrie, Immunzyto- und -histo¬chemie sowie Immunpräzipitation jeweils mindestens ein sehr gut an equines Septin7 bindender Antikörper identifiziert werden. Im Anschluss erfolgte die Untersuchung der Expression von Septin7 in Lymphozyten des peripheren Blutes und in aus dem Vitreus gewonnenen Lymphozyten von ERU-Patienten. Dabei ergab sich interessanterweise eine um den Faktor 4,7 verstärkte Expression von Septin7 in intraokulären Zellen gegenüber peripheren Lymphozyten. Die funktionelle Relevanz von Septin7 für die ERU wurde mittels eines Transmigrationsversuchs an Septin7-gesilencten peripheren Blutleukozyten (PBL) überprüft. Dabei zeigte sich eine Steigerung der Transmigrationsrate Septin7-gesilencter Zellen gegenüber Kontrollen um 28%, was auf eine Funktion von Septin7 bei der Transmigration hinweist. Zum Zweck der weiteren Charakterisierung der Funktion von Septin 7 in Pferde-PBL wurde eine Immunpräzipitation von Septin7 aus diesen Zellen durchgeführt. Die anschließende massenspektrometrische Analyse des Präzipitats ergab 47 Septin7-Interaktoren, die erstmals in Verbindung mit Septin7 in equinen PBL identifiziert werden konnten. Von besonderem funktionellem Interesse darunter waren Vimentin, ebenfalls ein Protein des Zytoskeletts, und Laktotransferrin, ein vielseitiger Immunmodulator. Die Expression dieser Proteine wurde dann durchflusszytometrisch in peripheren und intraokulären Lymphozyten analysiert. Vimentin war in nur 12 % der Lymphozyten im Auge im Vergleich zu 71% der peripheren Lymphozyten des ERU Pferdes exprimiert, die Expressionsstärke von Laktotransferrin war hingegen signifikant 8,8-fach höher in intraokulären als in peripheren Lymphozyten. Diese Expressionsänderungen vollzogen sich bei beiden Proteinen vorrangig auf CD4+ Zellen. Zusätzlich zur näheren Charakterisierung von Septin7 bei Lymphozyten von an ERU erkrankten Pferden lag besonderes Interesse auf der Identifikation differentiell regulierter Oberflächenmembranproteine zwischen peripheren und intraokulären Lymphozyten im Rahmen der ERU. In durch Oberflächenbiotinylierung von peri-pheren und intraokulären Lymphozyten gewonnenen Proben konnten in einem proteomischen Experiment insgesamt 146 differentiell exprimierte Proteine identifiziert werden, die nie zuvor auf ihre Rolle bei der ERU untersucht worden waren. Die Regulation zweier besonders interessanter Proteine, die auf intraokulären Lymphozyten stärker exprimiert waren, konnte durchflusszytometrisch bestätigt werden. Dabei handelte es sich um CD150, einen Stimulator der TCR-mediierten Signalkaskade, und CD166, ein an der T-Zellaktivierung und Leukozytenmigration beteiligtes Rezeptormolekül. Ein Transmigrationsversuch mit CD166-blockierten Zellen bestätigte auch für CD166, wie schon für Septin7, eine mögliche funktionelle Relevanz bei der Pathogenese der ERU. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente ergaben eine Vielzahl interessanter differenziell regulierter Kandidaten bei Lymphozyten von an ERU erkrankten Pferden. Die hier bereits bezüglich ihrer Regulation bei der ERU untersuchten Proteine Vimentin, Laktotransferrin, CD150 und CD166 sollten in Zukunft weiter auf ihre funktionelle Beteiligung an der Pathogenese der ERU untersucht werden. Zusätzlich könnten besonders der Septin7-Interaktor Cdc42, sowie die Oberflächenproteine P2X-Purinorezeptor, SIGIRR und CD6 große funktionellen Bedeutung bei der ERU haben und sollten Gegenstand künftiger Forschung sein, um die Pathogenese der häufigen und schwerwiegenden Erkrankung ERU weiter aufzuklären.

Das proinflammatorische Zytokin IL–1beta ist maßgeblich an der renalen Schädigung im Rahmen der Immunkomplex-Glomerulonephritis beteiligt. Für die Spaltung von pro-IL–1beta in seine extrazelluläre sezernierbare Form sind Inflammasome zuständig. Für das NLRP3-Inflammasom, das auf eine Vielzahl endogener Gefahrensignale (DAMPs) reagiert, wurde eine funktionelle Rolle bereits in tubulointerstitiellen Nephropathien gezeigt, wohingegen die Funktion in glomerulären Erkrankungen bis dato nicht geklärt ist. Um zu untersuchen,ob NLRP3 und sein Adaptermolekül ASC am Geschehen der Immunkomplex-vermittelten glomerulären Inflammation beteiligt sind, wurde ein T-Zell-abhängiges autologes NTN Modell induziert. Dies erfolgte in Mäusen mit einer Defizienz der Inflammasomkomponenten NLRP3 (C57BL/6-Nlrp3tm1Tsc) und ASC (C57BL/6-Pycardtm1V md). Die renale Expression von NLRP3/ASC Inflammasom-Komponenten und pro–IL–1beta stiegen während der NTN an und waren insbesondere in dendritischen Zellen (DC) vermehrt nachweisbar. Diese Tatsache war assoziiert mit der renalen Produktion von aktivem IL–1beta, was auf die Aktivierung des Inflammasoms hindeutet. Eine Defizienz für Nlrp3 oder Asc verringerte den renalen Schaden signifikant, ebenso die Leukozyteninfiltration und die T–Zell Aktivierung. Übereinstimmend mit einem ASC-abhängigen Verlust der inflammasomvermittelten IL–1beta-Aktivierung war die renale und lienale Produktion von aktivem IL–1beta in Asc-defizienten Mäusen vermindert. Überraschenderweise blieb die IL–1beta-Bildung bei Nlrp3-defizienten Tieren unverändert, was auf nicht-kanonische proinflammatorische NLRP3–abhängige Effekte im Modell der NTN hinweist. Ein solcher möglicher Effekt könnte die NLRP3-vermittelte Freisetzung von proinflammatorischem HMGB–1 als ein neuer nicht-kanonischer Mechanismus von NLRP3 und ASC während der Immunkomplex-Glomerulonephritis sein. Auf Grund dessen wäre die Blockade sowohl von NLRP3, als auch von ASC eine möglicher nutzbringender therapeutischer Ansatz im Rahmen der Behandlung von Immunkomplex-vermittelten Glomerulonephritiden.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) gehört zur Gruppe der humanen, vererbbaren Chromosomeninstabilitätssyndromen mit einem pleiotrophen Phänotyp. Betroffene Personen sind homozygot für eine Mutation im NBS1 Gen, die zu einem Ausfall der Bildung eines funktionellen Genproduktes führt. NBS Patienten reagieren u. a. empfindlicher auf ionisierende Bestrahlung, sind immundefizient und entwickeln mit erhöhter Wahrscheinlichkeit maligne Erkrankungen. Durch die vergleichende Analyse von zwei Zellpaaren mit NBS1-/- lymphoblastoiden Zelllinien und ihren entsprechenden NBS1+/- Linien, die aus Zellen von blutsverwandten Personen generiert wurden, wurden mögliche Ursachen für den auf zellulärer Ebene gut charakterisierten Phänotyp der erhöhten Strahlensensitivität der NBS1-/- Linien untersucht. Die Analyse einer möglichen differentiellen Genexpression in diesen Zelllinien mittels DNA Microarraytechnologie ergab nur ein signifikant minderexprimiertes Gen in den NBS1-/- Linien beider Zellpaare: LCK. Dieses Gen ist an der positiven Regulation der strahleninduzierten Apoptose in B- und T-Zellen beteiligt, weshalb die Rolle von NBS1 für die Regulation der strahleninduzierte Apoptose untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass NBS1-/- Zellen verglichen mit den entsprechenden NBS1+/- Zellen eine erhöhte Induktion von Apoptose nach gamma-Bestrahlung aufweisen. Die Analyse des Apoptoseweges demonstrierte die negative Regulation des CD95 vermittelten Weges durch NBS1. Die erhöhte strahleninduzierte Apoptose ist eine gute Erklärungsmöglichkeit für die beschriebene erhöhte Strahlensensitivität von NBS Zellen, da die Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) von der NBS1 Mutation nicht beeinträchtigt wird und somit keine Erklärung für diesen Phänotyp bietet. Möglicherweise beeinflusst NBS1 aber die Regulation der beiden DSB Reparaturwege homologe Rekombination oder nicht-homologe Endverknüpfung. Um zukünftig das Ausmaß der Verwendung dieser beiden Reparaturwege in NBS1 defizienten Zellen studieren zu können, wurde ein Vektorsystem entwickelt, das die Quantifizierung der Verwendung dieser DSB Reparaturwege durch Analyse von Fluoreszenzmarken nach sequenzspezifischer Induktion von DSB in vivo ermöglicht. Neben der Rolle von LCK in der Regulation der Apoptose ist LCK als T-zellspezifisches Protein insbesondere an der T-Zellaktivierung beteiligt. Deshalb wurde die Rolle von NBS1 für die Regulation der LCK Expression in einer T-Zelllinie untersucht (Jurkat), um so möglicherweise eine weitere Ursache für die Immundefizienz der NBS Patienten beschreiben zu können. Allerdings ist die LCK Expression in diesen Zellen unabhängig von NBS1.

Dendritische Zellen können in ihrer Eigenschaft als antigen-präsentierende Zellen adaptive Immunantworten induzieren. In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass DC im Menschen eine durch zytotoxische T-Zellen getragene Anti-Tumor-Immunantwort induzieren können. Im Rahmen dieser klinischen Studien ist die Frage nach der wirksamsten Tumor-Antigen-Präparation noch unbeantwortet. In der vorliegenden Arbeit wurden DC mit unterschiedlichen Antigenpräparationen der HLA-A2+ Pankreaskarzinom-Zelllinie Panc-1 gepulst und hinsichtlich ihrer Kapazität verglichen, T-Zellen zu aktivieren. Unterschiedliche Antigenpräparationen aus apoptotischem Tumormaterial wurden mit nekrotischem Tumormaterial verglichen, da für phagozytiertes apoptotisches Zellmaterial eine Kreuzpräsentation auf MHC-I-Molekülen der DC beschrieben wird. Eine solche Kreuzpräsentation könnte, so war das Ziel, zu einer gesteigerten tumorspezifischen zellulären Immunantwort führen. Apoptotisches Tumormaterial wurde durch die Behandlung der Tumorzellen mit UV-B-Licht oder Hyperthermie gewonnen und entweder als Zellsuspension oder als zellfreier Überstand (apoptotische Körperchen) zur Pulsung der DC verwandt. Als Modell für nekrotisches Tumormaterial diente durch Frier-Tau-Zyklen gewonnenes Tumorzelllysat. Monozyten-abgeleitete DC von HLA-A2+ Spendern wurden mit Tumorantigen gepulst, danach ausgereift und mit autologen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) kokultiviert. Nach drei Restimulationen im Abstand von jeweils einer Woche, wurde die T-Zell-Aktivierung mittels einer intrazellulären IFN-γ-Messung sowie Zytotoxizitätsassays bestimmt. Im Vergleich mit Lysat induzierte das Pulsen der DC mit apoptotischen Tumorzellen eine höhere Frequenz aktivierter zytotoxischer T-Zellen und T-Helferzellen sowie eine größere MHC-I-restringierte Tumorzelllyse. Es konnte dabei keine Aktivierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) oder γ/δ Zellen festgestellt werden. Wurden die DC mit ganzen apoptotischen Tumorzellen gepulst zeigte sich eine noch ausgeprägtere Tumorzelllyse. In diesem Fall jedoch konnte die lytische Aktivität nur zum Teil durch MHC-I-blockierende Antikörper unterbunden werden. Außerdem wurden die Kontrollzelllinien Kato-III und K562 ebenfalls lysiert. Beides sind Hinweise auf eine Beteiligung von NK-Zellen an der Tumorzelllyse. In der Tat konnten intrazelluläre IFN-γ-Färbungen neben einer Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen auch eine Aktivierung von NK- und γ/δ T-Zellen zeigen. Transwell-Kultivierungs-Experimente erbrachten daraufhin den Nachweis, dass die festgestellte NK-Zell-Aktivierung abhängig war von direktem Zell-zu-Zell Kontakt mit Tumorzellen und gleichzeitiger Anwesenheit von DC-produziertem IL-12. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Wahl der Antigenpräparation eine entscheidende Determinante in der therapeutischen Initiation einer Anti-Tumor-Immunantwort ist. Anti-Tumor-Vakzine, die aus DC und apoptotischen Tumorzellen bestehen, könnten in vivo sowohl Effektorzellen des adaptiven als auch des angeborenen Immunsystems aktivieren.

Das humanpathogene Bakterium H. pylori persistiert im Gastroduodenaltrakt für Jahre oder sogar Jahrzehnte und löst durch die Kolonisation der Magenmukosa eine chronische Entzündungsreaktion aus. In den meisten Fällen bleibt diese symptomlos, es können jedoch auch schwerwiegende Erkrankungen wie ein Magen- oder Zwölffingerdarm-Geschwür oder Magenkrebs daraus hervorgehen. Obwohl die Infektion eine starke zelluläre und humorale Immunantwort hervorruft, kann H. pylori durch das Immunsystem nicht eliminiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von H. pylori auf die Proliferation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass H. pylori zwei Faktoren besitzt, um die Expansion der T-Zellen zu hemmen. Der eine, nicht näher charakterisierte Faktor scheint mit der Oberfläche der Bakterien assoziiert zu sein und inhibiert die Proliferation der T-Zellen bei direktem Kontakt der Bakterien mit den Zellen. Der zweite Faktor wurde als vakuolisierendes Zytotoxin VacA identifiziert, das, wie bisher bekannt war, in Epithelzellen die Bildung saurer Vakuolen auslöst. T-Zellen produzieren, wenn sie aktiviert werden, den Wachstumsfaktor IL- 2, beginnen sich zu vermehren und setzen eine Immunreaktion gegen das Pathogen in Gang. Das VacA-Toxin hemmt jedoch die Bildung von IL-2 und bewirkt eine Hemmung des Zellzyklus bei T-Zellen, indem es die Expression der Cycline D3 und E reprimiert. Diese sind essentiell für die Aktivierung des Retinoblastom-Proteins, das den Übergang des Zellzyklus von der G1- in die S-Phase vermittelt. Durch die Hemmung der IL-2-Produktion und die Erniedrigung der Oberflächenlokalisation von CD25, der -Kette des IL-2-Rezeptors, unterbricht VacA die Signaltransduktion, die normalerweise über den IL-2-Rezeptor zur Expression der Cycline führt. Die Hemmung der IL-2-Produktion durch VacA erfolgt auf transkriptioneller Ebene, indem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) verhindert wird. Die anderen für die Transkription des IL-2-Gens essentiellen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-B werden durch VacA nicht beeinflusst. Die Stimulation der T-Zellen aktiviert zwei Haupt-Signalwege: einer führt über den MAPKinase / ERK-Kinase Weg zur Aktivierung von AP-1 und NF-B, der andere löst eine Erhöhung der Calcium-Konzentration im Zytoplasma aus, was die Ca2+-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert daraufhin den Transkriptionsfaktor NFAT und NFAT wird in den Zellkern transportiert, wo es zusammen mit AP-1 und NF-B die Transkription des IL-2-Gens initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass VacA die Translokation von NFAT in den Kern durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität von Calcineurin verhindert. Dies hat zur Folge, dass NFAT-abhängige Gene, wie das IL-2- Gen oder das für CD25 codierende Gen, nicht abgelesen werden können. Dass Calcineurin ein geeignetes Zielmolekül ist, um eine Immunantwort zu unterdrücken, zeigen auch die medizinisch bedeutsamen Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Cyclosporin A. Beide V Zusammenfassung 91 Substanzen verursachen durch Hemmung von Calcineurin eine starke Immunsuppression. In DNA-Microarray-Analysen wurde untersucht, ob VacA einen ähnlich drastischen Effekt auf die Funktion der T-Zellen hat wie FK506. Dabei zeigte der Vergleich der Genexpression von VacA- und FK506-behandelten T-Zellen, dass VacA eine Untergruppe der Gene, die auch von FK506 reprimiert werden, herunterreguliert, wie z.B. die Gene für die Zytokine Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1, MIP-1, Single C Motif-1 (SCM-1) und SCM- 1. VacA scheint also die Genaktivität von T-Zellen ähnlich wie FK506 zu modulieren, was auf einen ähnlichen Mechanismus, nämlich die Calcineurin-Hemmung schließen lässt. Da das VacA-Toxin ein sekretiertes Protein ist, das auch in den tieferen Schichten des Magengewebes nachgewiesen werden kann, erreicht H. pylori nicht nur die vereinzelt im Magenepithel vorkommenden T-Zellen, sondern auch die T-Zellen, die bei der Infektion in die Lamina propria, eine tiefere Schicht der Magenmukosa, einwandern. Durch die Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung und die Repression von Zytokin-Genen, die wichtig sind für die Modulation der Immunantwort, induziert H. pylori so vermutlich eine lokale Immunsuppression, die seine Eliminierung durch das Immunsystem verhindert und eine chronische Infektion des Magens ermöglicht. In einem zweiten Projekt wurde die Spaltung von CagA in ein 100 kD- und ein Tyrosinphosphoryliertes 40 kD- Fragment nach dessen Translokation in diverse Zelltypen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung nicht nur in Makrophagen, sondern auch in dendritischen Zellen und in T-Zellen auftritt. Die Spaltung scheint von der Tyrosin-Phosphorylierung des CagA-Proteins und von Calcium abhängig zu sein. Dabei wurde die Ca2+-abhängige Protease Calpain in einem in vitro-Ansatz als ein CagAprozessierendes Enzym identifiziert. Auch in Makrophagen kann die Spaltung von CagA in P100 und P40P-Tyr durch den Calpain-Inhibitor Calpeptin verhindert werden. Die Tatsache, dass transloziertes CagA in allen getesteten eukaryontischen Zelltypen außer der Magenepithelzellinie AGS prozessiert wird, deutet darauf hin, dass diese Prozessierung eine biologische Bedeutung hat.

Die Aktivierung naiver Lymphozyten bezeichnet einen komplexen, immunmodulatorischen Prozeß, in dessen Verlauf mitotisch inaktive B- und T-Zellen als Folge des Kontakts mit Antigen in den Zellzyklus eintreten, proliferieren und anschließend zu spezifischen Effektorzellen oder zu langlebigen Gedächtniszellen differenzieren. Die klonale Expansion von Lymphozyten ist somit einerseits bedeutsam für die Förderung der akuten Immunantwort, andererseits ist sie auch Voraussetzung für die Etablierung von dauerhafter, adaptiver Immunität, deren zelluläre Grundlage die lymphozytären Gedächtniszellen darstellen. Auf wiederholte Antigen-Exposition reagieren Lymphozyten mit unmittelbarer und effizienter Aktivierung der Effektorfunktionen, beispielsweise der Produktion von Antikörpern durch BZellen oder der zytotoxischen bzw. immunmodulatorischen Aktivität von T-Zellen. Die Spezifität der Antigen-Erkennung wird in Lymphozyten durch hypervariable Antigenrezeptoren gewährleistet, deren Stimulation ein komplexes Netzwerk von Signaltransduktionsprozessen im Zellinneren initiiert. In T-Lymphozyten des Helfertyps resultieren diese Signalkaskaden unter anderem in der transkriptionellen Induktion des IL-2 Promotors. Das Signal des Antigenrezeptors wird jedoch moduliert durch die Aktivität von Corezeptoren, im Falle von T-Helferzellen beispielsweise unter Beteiligung des CD4-Moleküls. CD4 bindet an konstante Bereiche der antigenpräsentierenden MHC-II-Moleküle und stabilisiert so deren Interaktion mit dem T-Zell-Antigenrezeptor (TCR). Detaillierte Untersuchungen zu den Mechanismen der Koordination und Integration von Signalen des T-Zell-Antigenrezeptors mit denen des CD4-Moleküls bildeten das übergeordnete Thema der vorliegenden Arbeit. Sowohl der T-Zell-Antigenrezeptor als auch CD4 gehören zu einer Klasse von Rezeptoren, deren zytoplasmatische Anteile an Proteintyrosinkinasen (PTKs) koppeln. CD4 interagiert konstitutiv und nahezu stöchiometrisch mit der src-ähnlichen Kinase p56lck, welche während der Induktion von T-Zell Aktivierung eng mit der TCR-assoziierten Syk-ähnlichen Kinase ZAP-70 zu kooperieren vermag. Die Verknüpfung beider Kinasen mit den nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden erfolgt durch die Phosphorylierung spezifischer Substrate, welche zu Beginn dieser Untersuchungen noch größtenteils unbekannt waren. Zwei unabhängige experimentelle Ansätze sollten eine Identifikation potentieller in vivo Substrate der Tyrosinkinase ZAP-70 ermöglichen. Aufgrund von Befunden mit transmembran exprimierten Kinase-Fusionsproteine konnten mehrere Phosphoproteine als wahrscheinliche Substrate von ZAP-70 bestätigt werden, die zur selben Zeit von anderen Autoren als solche diskutiert wurden. Die zweite, parallel verfolgte experimentelle Strategie zielte auf die Charakterisierung einer konstitutiv-aktiven Variante von ZAP-70, deren Expression in TZellen zu einer Entkopplung von stimulierenden Signalen und somit zur Phosphorylierung spezifisch nachgeschalteter Substrate führen sollte. Tatsächlich konnte - durch Substitution carboxyterminaler Tyrosinreste von ZAP-70 - eine funktionell konstitutiv-aktive Mutante generiert und deren Substrate in vivo analysiert werden. Dieser Ansatz resultierte in der Charakterisierung einer bislang unvermuteten, positiv-regulatorischen Rückkopplungsschleife zwischen ZAP-70 und der ζ-Untereinheit des T-Zell-Antigenrezeptors. Dieser Rückkopplungsmechanismus könnte bedeutsam sein für die Amplifikation von Signalen des T– Zell Rezeptors. Dem Carboxyterminus von ZAP-70 würde somit entscheidendes Potential zur Modulation von T-Zell Aktivierung zukommen. Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Charakterisierung des bislang unbekannten Proteins ACP33, welches im Vorfeld als ein potentieller Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne von CD4 identifiziert worden war. Verschiedene Befunde hatten zuvor darauf schließen lassen, daß - neben p56lck - alternative intrazelluläre Liganden von CD4 existieren könnten. Mittels der Two-Hybrid Methodik konnte daraufhin die cDNA des ACP33 Proteins kloniert und zudem dessen Bindungsspezifität analysiert werden. ACP33 besitzt offenbar eine peptidbindende Domäne, welche spezifisch eine Kombination zweier hydrophober, nicht-aromatischer Aminosäurereste am Carboxyterminus von Peptiden erkennt. In der zytoplasmatischen Domäne von humanem CD4 und der aller bekannter CD4-Orthologe ist ein derartiges Interaktionsmotiv konserviert. Copräzipitationsexperimente und Mutationsanalysen bestätigten, daß C-terminale Deletionen von CD4 einen Verlust der Interaktion mit ACP33 zur Folge haben. Derselbe Effekt resultierte überraschenderweise auch aus der Substitution des Serinrestes 109 in ACP33, wodurch eine zu Hydrolasen homologe Region des ACP33 Proteins als neuartige peptidbindende Domäne identifiziert werden konnte. Funktionelle Analysen der carboxyterminalen CD4-Deletionsmutanten identifizierte das Interaktionsmotiv mit ACP33 als eine inhibitorische Determinante der antigenabhängigen T-Zell Aktivierung. ACP33 könnte demnach als eine negativ-regulatorische Komponente des Signalnetzwerkes einen bedeutenden Beitrag zur Modulation von TZell Aktivierung leisten. Zusammengenommen verdeutlichen die Resultate beider Teilprojekte, daß Regulation von T-Zell Aktivierung als ein integrativer Prozeß aus stimulatorischen und inhibitorischen Signalen anzusehen ist. Detailliertere Analysen zur Koordination dieser gegensätzlichen Signale sollte in Zukunft wesentlich zu einem besseren Verständnis von T-Zell Aktivierungsprozessen beitragen.