Podcasts about modellantigen

Die Therapieerfolge bei der Behandlung von Patienten mit Pankreaskarzinom sind trotz immenser Fortschritte und Erkenntnisse auf dem Gebiet der Tumorforschung immer noch unbefriedigend. Ursache hierfür ist neben der späten Diagnostellung aufgrund unspezifischer Symptomatik die diffuse lokale Infiltration des Tumors sowie dessen frühzeitige Metastasierung. Die adjuvante Chemotherapie mit Gemcitabin bei Patienten mit diesem Tumorleiden mit operativer R0/R1-Resektion zeigt nur marginal lebensverlängernde Vorteile. Aufgrund der intrinsischen Fähigkeit des Immunsystems infizierte oder entartete Körperzellen zu erkennen und wirkungsvoll zu eliminieren, erscheinen immuntherapeutische Ansätze mit dem Ziel der Induktion einer antitumoralen Immunantwort in der Behandlung des Pankreaskarzinoms aussichtsreich. Eines der prominentesten immuntherapeutischen Verfahren ist die Vakzinierung mit Tumorantigen beladenen DC. Wie Vorarbeiten in unserer Arbeitsgruppe zeigen konnten, erwies sich dabei die Kombination von Gemcitabin mit einer DC-basierten Immuntherapie in einem subkutanen murinen Pankreaskarzinommodell mit der Tumorzelllinie Panc02 als synergistisch in Bezug auf das Überleben. Auf dieser Beobachtung aufbauend, bestand ein Teil der Zielsetzung dieser Doktorarbeit in der näheren Charakterisierung der Einflussnahme von Gemcitabin auf die DC-Vakzine selbst bzw. die durch sie induzierte Immunantwort. Unter Einführung des Ovalbumins (OVA) als immunogenem Modellantigen und nach Etablierung immunologischer Nachweismethoden, konnten zunächst verschiedene DC-Protokolle und Vakzinierungsrouten hinsichtlich ihrer Effektivität in der Generierung einer adaptiven Immunantwort getestet und systematisch miteinander verglichen werden. Von besonderem Interesse war dabei vor allem in Hinblick auf die Verwendung im späteren orthotopen Tumormodell die Effektivität der intraperitonealen DC-Gabe, die letztendlich gegenüber der s.c.-Vakzinierung deutlich höhere spezifische T-Zellantworten induzierte. In weiterführenden Studien mit paralleler Gemcitabingabe stellte sich eine deutliche Suppression der DC-vermittelten Immunantwort gegen das OVA-Antigen heraus. Diese betraf in verstärktem Ausmaß die B-Zellreihe, deren Produktion OVA-spezifischer Antikörper nahezu komplett unterdrückt wurde. Auch die induzierte T-Zellantwort war deutlich reduziert. Diese zeigte jedoch immer noch eine ausgeprägte lytische Aktivität von Surrogat-Target-Zellen in einem in vivo-Zytotoxizitätstest. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der immunsuppressive Effekt von Gemcitabin maßgeblich auf die direkte antiproliferative Wirkung von Gemcitabin zurückzuführen ist. Die T-Zellstimulationskapazität der DC-Vakzine wurde in vivo durch Gemcitabin hingegen nicht negativ beeinflusst. Das Ausmaß der beobachteten Immunsuppression war zudem stark vom Zeitpunkt des Beginns der Gemcitabingabe abhängig. Trotz deutlicher Reduktion der Immunantwort erwies sich im subkutanen Tumormodell mit transfizierten Panc02-OVA-Zellen die Kombinationstherapie von OVAProtein- gepulsten DC und Gemcitabin von Beginn an gegenüber einem modifizierten Protokoll mit verspäteter Gemcitabin-Gabe parallel zur DC-Vakzine als therapeutisch überlegen. Der Synergismuseffekt war an das Vorhandensein einer spezifischen T-Zellantwort gebunden. Ferner konnte in dem verwendeten murinen Pankreaskarzinommodell die verbesserte Migration von Immunzellen - v.a. der CD8-T-Zellreihe - sowie die Verbesserung der T-Zell-vermittelten Tumorzelllyse unter Gemcitabinexposition nachgewiesen werden. Bei der Erweiterung des Tumormodells auf die orthotope Ebene zeigt sich die subkutane Vakzinierung mittels DC, die mit apoptotischen Panc02-OVA-Tumorzellen als Antigenquelle beladen worden waren, nur in der Lage, einen prophylaktischen Impfschutz gegen den nachfolgenden intrapankreatischen Tumorchallenge zu induzieren. Sie versagte jedoch komplett in der Therapie etablierter intrapankreatischer Tumore. Demgegenüber konnten durch die Verwendung intraperitoneal verabreichter, OVA-Protein-gepulster DC – sowie in begrenztem Umfang auch durch die i.p.-Gabe LPS-aktivierter, ungepulster DC ohne Antigenbeladung – beachtliche Therapieerfolge erzielt werden. Durch die vorliegende Arbeit gelang es erstmalig grundlegende Erkenntnisse über das Zusammenspiel von DC-Immuntherapie und dabei begleitend durchgeführterGemcitabinbehandlung im murinen Panc02-OVA-System zu sammeln. Es konnten zudem eine Reihe zuvor beschriebener immunmodulatorischer Eigenschaften von Gemcitabin auch im Panc02-OVA-Tumormodell bestätigt werden. Mit der im Rahmen dieser Arbeit erfolgten Etablierung des orthotopen Pankreaskarzinommodells steht nun zudem ein System zur Verfügung, welches sich wesentlich näher an der klinischen Situation bewegt. Daran konnten neue, evtl. wegweisende Anwendungen der DC-Therapie – namhaft in Form der intraperitonealen DC-Gabe – bei diesem Tumorleiden erfolgreich getest werden, die weiterführende klinische Studien rechtfertigen könnten.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Die gezielte Generierung antigenspezifischer T-Zellinien, zum Beispiel für den Einsatz in der adoptiven Immuntherapie, erfordert die Stimulation der T-Zellen durch Kokultivierung mit anderen Zellen, die das Antigen in einem geeigneten molekularen Kontext auf ihrer Oberfläche präsentieren. Für den Spezialfall der Stimulation Epstein- Barr-Virus-(EBV)-spezifischer T-Zellen existiert ein besonders effizientes System: EBV-immortalisierte B-Zellen, genannt lymphoblastoide Zellinien (LCLs). Solche LCLs sind leicht für jeden beliebigen humanen Spender herzustellen und proliferieren unbegrenzt. Sie exprimieren mehrere virale Proteine, die in vitro wie in vivo eine starke antivirale T-Zell-Antwort hervorrufen, und stimulieren effizient spezifische T-Zellen gegen diese EBV-Antigene. EBV wurde genetisch modifiziert, um ein neues System zur rationellen Generierung antigenpräsentierender Zellen für die T-Zell-Stimulation ermöglichen. Dieses System beruht auf rekombinanten EBV-Vektoren, mini-EBVs, in die das Gen für ein beliebiges Antigen eingebaut wurde. Mini-EBVs immortalisieren B-Zellen, und in den entstehenden Zelllinien, genannt mini-LCLs, wird das gewünschte Antigen exprimiert. Zudem können mini-LCLs im Gegensatz zu LCLs kein infektiöses EBV bilden und sind daher im Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz als besonders sicher anzusehen. In dieser Arbeit sollte die Eignung von mini-LCLs gezeigt werden, effizient ein Fremdantigen zu präsentieren, um antigenspezifische T-Zellen zu restimulieren und expandieren. Schwerpunkt der Arbeiten bilden Untersuchungen mit einem mini-EBVVektor, der als Modellantigen das Gen für pp65 trägt, ein immundominantes T-Zell- Antigen aus dem humanen Cytomegalovirus. Die mini-EBV-Immortalisierung wurde so weit optimiert, daß schließlich bei acht von neun gesunden Normalspendern aus einer kleinen Blutprobe pp65mini-LCLs etabliert werden konnten. Sie waren frei von Wildtyp-EBV, exprimierten intrazellulär pp65 und auf ihrer Oberfläche essentielle Präsentations- und Kostimulationsmoleküle. Durch Restimulation mit der autologen pp65mini-LCL wurden T-Zellinien generiert. Detaillierte Zytotoxizitätsanalysen zeigten die HLA-restringierte, pp65-spezifische Zytotoxizität der pp65mini-LCL-stimulierten T-Zellinien aus vier von vier CMV-seropo-sitiven Spendern. Bei allen diesen T-Zellinien dominierte nach wiederholter Restimulation die pp65-spezifische über die EBV-spezifische Zytotoxizität. T-Zellinien aus EBV-seronegativen Spendern sowie Kontroll-T-Zellinien, die mit Kontroll-mini-LCLs ohne pp65-Expression stimuliert worden waren, zeigten dagegen lediglich eine EBVspezifische Zytotoxizität. Durch Färbung mit HLA:Peptid-Tetrameren wurde die Expansion pp65-epitopspezifischer T-Zellen in allen pp65mini-LCL-restimulierten T-Zellinien aus CMV-seropositiven Spendern nachgewiesen. Bei den drei pp65-T-Zellinien mit einer Kultivierungsdauer von mindestens 50 Tagen, die mit Tetrameren untersucht werden konnten, wurden 40% oder mehr pp65-epitopspezifische CD8+-T-Zellen nachgewiesen. Auch EBV-epitopspezifische Zellen waren nachweisbar, jedoch bestätigten die Tetramer- Analysen, daß durch Restimulation mit pp65mini-LCLs bevorzugt pp65-spezifische T-Zellen expandiert wurden. Der Vergleich mit den Resultaten verschiedener aktuell publizierter Protokolle zur invitro- Generierung pp65-spezifischer T-Zellen für die adoptive Immuntherapie zeigt, daß pp65mini-LCLs ein vorteilhaftes Werkzeug sein werden, um dieses Ziel zu erreichen. Die Erweiterung des mini-EBV-Systems auf andere therapierelevante Antigene ist die Aufgabe der Zukunft.

Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf MHC-Klasse-II-Molekülen ist von zentraler Bedeutung für eine Reihe immunologischer Prozesse. Die diesem Präsentationsweg zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum Verständnis der molekularen Abläufe zu leisten, die an diesem endogenen MHC-Klasse-II-Präsentationsweg beteiligt sind. Am Beispiel des zytoplasmatischen/nukleären Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase (NeoR) und eines Modellantigen-spezifischen, MHC-Klasse-II-restringierten CD4+ T-Zell Klons wurde der endogene Präsentationsweg in nicht-professionellen und professionellen antigenpräsentierenden Zellen untersucht. Eine Beteiligung von Schlüsselkomponenten des MHC-Klasse-I-Präsentationsweges konnte durch die Verwendung chemischer und biologischer Inhibitoren ebenso ausgeschlossen werden, wie eine vorzeitige Beladung von neu-synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen im endoplasmatischen Retikulum. Dagegen erwies sich die endogene Präsentation des Modellantigens abhängig von endosomaler/lysosomaler Prozessierung. Durch biochemische und zellbiologische Methoden konnte nachgewiesen werden, daß das Antigen als intaktes Protein in Endosomen/Lysosomen gelangt. Eine mögliche Sekretion des Antigens und anschließende Wiederaufnahme in endosomale Kompartimente konnte durch Zellkulturüberstand- Transferexperimente als Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Durch Inhibitor-Studien und der Beschreibung der Endosomen als Eintrittsort des Antigens in das endosomale/lysosomale System konnte gezeigt werden, daß ein Signalsequenz-vermittelter Import in Lysosomen durch Hitzeschockproteine nicht als Mechanismus in Frage kommt. Dagegen wies die Expression Autophagie-assoziierter Proteine in den verwendeten Zellinien auf eine mögliche Beteiligung dieses zytoplasmatischen Abbauvorganges an der Präsentation des Antigens hin. Eine Inhibition der Autophagie führte zu einer Stabilisierung und Anreicherung des Proteins im Zytoplasma sowie zu einer verminderten Aufnahme des Antigens in das endosomale/lysosomale Kompartiment. Die verminderte Aufnahme korrelierte mit einer starken Abnahme der MHC-Klasse-II-restringierten Präsentation des Antigens. Diese Ergebnisse identifizieren Autophagie am Beispiel des Modellantigens NeoR als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentation.