Podcasts about Plasmid

It could be argued that biology has always boiled down to chemistry, and that chemistry has always boiled down to physics. However, not many would deny that the fields of biology and chemistry are overlapping more than ever, with both leveraging computing methods, also more than ever. This conversation with Dr. Ramesh Jha, Technical Staff Member at Los Alamos National Laboratory (LANL), crosses biology, chemistry, and computing methods. The work of his biome team at LANL uses computational tools to inform the design of enzymes that are produced via PCR-based cloning and then expressed in microbes. They use fluorescent gene circuits in these microbes, along with flow cytometry, to screen these large libraries for advantageous gain-of-function variants. When they find an interesting mutation, they isolate it, sequence it, and produce and evaluate those biocatalytic enzymes for bioremediation, biomanufacturing, and other important applications. Ramesh makes this complex and interdisciplinary science approachable and gives hope to how it could help address problems of “forever chemicals” and other environmental and manufacturing challenges. Join us for this interesting and inspiring conversation.  Subscribe to get future episodes as they drop and if you like what you're hearing we hope you'll share a review or recommend the series to a colleague.  Visit the Invitrogen School of Molecular Biology to access helpful molecular biology resources and educational content, and please share this resource with anyone you know working in molecular biology. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

You can run the perfect agarose gel to separate your nucleic acid fragments but if you don't stain and image the gel properly, it's all for not. In this second installment of Mol Bio Minutes we take a look at the staining considerations for nucleic acid gel electrophoresis with Paulius Palaima, Product Manager at Thermo Fisher Scientific. He covers the range of stains and staining approaches available while calling out pros, cons and considerations for each. How these recommendations change, depending on your sample, is also covered in this approachable but informative episode. Helpful resource links mentioned in this episode:A helpful DNA stain selection guideRNA stain options and detailsEffects of dyes on gel electrophoresis properties Subscribe to get future episodes as they drop and if you like what you're hearing we hope you'll share a review or recommend the series to a colleague.  Visit the Invitrogen School of Molecular Biology to access helpful molecular biology resources and educational content, and please share this resource with anyone you know working in molecular biology. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

Agarose gel electrophoresis is a staple method in almost all biology and biochemistry lab where separation and analysis of nucleic acids is needed. In this Mol Bio Minutes mini episode Augustė Užuotaitė, Scientist III at Thermo Fisher Scientific, covers the basics of electrophoresis with a spotlight on how different forms of DNA migrate differently in agarose gel electrophoresis.In less than 10 quick minutes, you'll learn about the many factors that affect DNA migration rate. Augustė reviews how DNA size, sequence, and conformation all affect migration rate, and she gives some beautifully simple examples to help it all make sense. Helpful resource links mentioned in this episode:Nucleic acid gel electrophoresis – summarized in 5 easy stepsFive important considerations for the nucleic acid gel electrophoresis Subscribe to get future episodes as they drop and if you like what you're hearing we hope you'll share a review or recommend the series to a colleague.  Visit the Invitrogen School of Molecular Biology to access helpful molecular biology resources and educational content, and please share this resource with anyone you know working in molecular biology. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

Plastics are a modern miracle of science that have helped deliver both convenience and life-saving solutions. However, we must now grapple with the challenge of immense amounts of plastics in our waste streams and environment. How do we best deconstruct plastics to reusable or more bio-friendly molecules? This is the exact challenge being addressed by the work of Dr. Elizabeth (Izzy) Bell and her team at the National Renewable Energy Lab. Our conversation with Izzy showcases her ability to summarize complex topics very concisely and understandably, which she says is a skill that is critically important in her field because it's so interdisciplinary. Izzy summarizes the challenges they're working to address and then walks us through the stepwise processes she and her team use to conduct directed evolution studies. These studies aim to create and characterize enzymes capable of deconstructing common plastics, first at a laboratory scale, but eventually at an industrial scale. If you've ever wondered about how directed evolution studies are done, and the role that molecular biology plays with them, this conversation will be sure to clarify. In addition to the great science of this episode, Izzy also helps outline what it takes to get into and be successful in her field – a great resource for anyone aspiring to get into this area of research. We hear about how interdisciplinary the field is, but how that means it's also ripe with opportunity for those passionate about learning and making a difference. Join us for what is sure to be an informative and inspiring episode! Subscribe to get future episodes as they drop and if you like what you're hearing we hope you'll share a review or recommend the series to a colleague.  Download Transcripts: Speaking of Mol Bio Podcast | Thermo Fisher Scientific - US Visit the Invitrogen School of Molecular Biology to access helpful molecular biology resources and educational content, and please share this resource with anyone you know working in molecular biology.

The fields of Cell and gene therapy are booming and poised to change the treatment and prevention of disease. These research areas require the transfer of genetic material to cells, and viral vectors are commonly used here. Specifically, adeno-associated virus (AAV) and lentiviral vectors (LVV) are vectors of choice. We're joined for this episode by MinGin Kim and Kimberly Gomez, both scientists at Thermo Fisher. With backgrounds and expertise in the areas of cell and gene therapy, they help explain what all the excitement is about and how AAV and LVV are used. We hear about some of the challenges associated with viral vector work and get to hear about how digital PCR (dPCR) and good assay design are helping overcome many of these challenges to enable research and the biopharmaceutical industry. As you might expect from Absolute Gene-ius, you also get to hear their respective career path journeys and some really interesting lab stories.Visit the Absolute Gene-ius page to learn more about the guests, the hosts, and the Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q Digital PCR System. 

As promised in the previous episode, we discuss V. I. Lenin's Draft Theses on National and Colonial Questions for the Second Congress of the Communist International (https://www.marxists.org/archive/lenin/works/1920/jun/05.htm). It takes us quite awhile to get to the actual text of Lenin because we end up discussing the nation, the ecumenical state, ethnicity, and many of the contradictions therein. Note: Had some pesky background noise in this one that was hard to get rid of. Sorry about that! Additional Sources: Imagined Communities by Benedict Anderson https://is.muni.cz/el/1423/podzim2013/SOC571E/um/Anderson_B_-_Imagined_Communities.pdf Age of Coexistence w/ Ussama Makdisi on The Dig https://thedigradio.com/podcast/age-of-coexistence-w-ussama-makdisi/ How the West Stole Democracy from the Arabs w/ Elizabeth Thompson on Guerrilla History https://guerrillahistory.libsyn.com/how-the-west-stole-democracy-from-the-arabs-w-elizabeth-thompson-remastered Statement on Al Aqsa Flood Battle by Popular Front for the Liberation of Palestine https://www.workers.org/2023/10/73785/ Marxism and the National Question by Joseph Stalin https://www.marxists.org/reference/archive/stalin/works/1913/03.htm Resources: Answer Coalition https://www.answercoalition.org/ The Anti-Imperialist Archive https://directory.libsyn.com/shows/view/id/4084a94f-b1ea-4146-9e99-6bd47e9ddcef Jewish Voices for Peace https://www.jewishvoiceforpeace.org/ Middle East Children's Alliance https://www.mecaforpeace.org/ The Palestine Children's Relief Fund https://www.pcrf.net/ Palestinian Youth Movement https://palestinianyouthmovement.com/ Turn Leftist Podcast (Mike): Patreon: https://www.patreon.com/turnleftist Twitter: https://twitter.com/turnleftistpod Instagram: https://www.instagram.com/turnleftist The Intervention Podcast: Twitter: https://twitter.com/intervenepod Instagram: https://www.instagram.com/intervention_pod/ Email: interventionpod@gmail.com Levi Levi: Twitter: https://twitter.com/Levi0Levi Instagram: https://www.instagram.com/levi0levi0levi Email: levi0levi@duck.com Big thanks to Plasmid for the music for the show: Instagram - https://www.instagram.com/plasmidband/ Listen / follow on Spotify https://open.spotify.com/artist/08G1F4phxjM35aTDyrzE4j

We're back with Evan of Left of the Projector for the third (maybe second?) entry in the History in Film series. This time it's 1960's Zionist epic, Exodus. Based on the novel of the same name by Leon Uris, this film aimed to convince American Jewry to consider the State of Israel (at this point, only twelve years old) as a nation deserving their investment, sympathy, and loyalty. Somehow, we've dragged along Sam and Gabe from Labor Jawn to slog our way through this three and half hour long piece of Zionist propaganda...at least we got a shirtless Paul Newman out of it. Primary Sources: In Vigilant Brotherhood by The American Jewish Committee - (see pg 64-70 for "The Blaustein-Ben-Gurion Agreement") "Is Zionism a Liberating Democratic Movement?" by Henryk Erlich "This is a struggle between the children of light and the children of darkness, between humanity and the law of the jungle" Tweet by Benjamin Netanyahu "שטיל, די נאַכט איז אױסגעשטערנט [Quiet, the Night is Full of Stars]" performed by Isabel Frey Resources: Answer Coalition The Anti-Imperialist Archive If Not Now Jewish Voices for Peace Middle East Children's Alliance The Palestine Children's Relief Fund Palestinian Youth Movement Labor Jawn: Patreon: @laborjawn Instagram: @laborjawn Tiktok: @laborjawn Left of the Projector (Evan): Patreon: @LeftoftheProjectorPod Twitter: @LOTP_Pod Instagram: @leftoftheprojectorpod Letterboxd: @lotppod Merch: https://leftoftheprojectorpod.threadless.com The Intervention Podcast: Twitter: @intervenepod Instagram: @intervention_pod Email: interventionpod@gmail.com Levi Levi: Twitter: @levi0levi Instagram: @levi0levi0levi Email: levi0levi@duck.com Big thanks to Plasmid for the music for the show: Instagram - @plasmidband. Listen / follow on Spotify --- Support this podcast: https://podcasters.spotify.com/pod/show/leftoftheprojector/support

In this week's episode, Martin talks to Dr Jon Otter, epidemiologist, scientst, blogger and Joint Director of Infection Prevention and Control at Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust in the UK. We discuss a session at the recent ICPIC conference on the problems posed by plasmids in terms of outbreak detection, increasing antimicrobial resistance and environmental reservoirs. You can read more about Jon's thoughts in his excellent blog post at https://reflectionsipc.com/2023/09/14/cpe-and-plasmid-transfer-in-hospitals-what-can-we-do-a-rapid-reflection-from-icpic-2023/#more-5141   A paper we discuss from Kalisvar Marimuthu and colleagies can be found here https://www.nature.com/articles/s41467-022-30637-5 You can listen to Kalis discussing it on a previous podcast in our genomics collection here: https://infectioncontrolmatters.com/topics/methodology/

In this week's episode, Martin talks to Dr Jon Otter, epidemiologist, scientst, blogger and Joint Director of Infection Prevention and Control at Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust in the UK. We discuss a session at the recent ICPIC conference on the problems posed by plasmids in terms of outbreak detection, increasing antimicrobial resistance and environmental reservoirs. You can read more about Jon's thoughts in his excellent blog post at https://reflectionsipc.com/2023/09/14/cpe-and-plasmid-transfer-in-hospitals-what-can-we-do-a-rapid-reflection-from-icpic-2023/#more-5141   A paper we discuss from Kalisvar Marimuthu and colleagies can be found here https://www.nature.com/articles/s41467-022-30637-5 You can listen to Kalis discussing it on a previous podcast in our genomics collection here: https://infectioncontrolmatters.com/topics/methodology/

We are joined by our theory buddy, Mike from Turn Leftist, to discuss Chapter 1 of Marx's fantastic work, The Eighteenth Brumaire of Louis Bonaparte. As always, big thanks to Plasmid for the music for the show: Instagram - @plasmidband. Listen / follow on Spotify.

Randall Carlson is a geometrician, geomythologist, geological explorer and renegade scholar. Randall investigates and documents the catastrophic history of the world and the evidence for advanced knowledge in earlier cultures. EPISODE LINKS https://www.youtube.com/therandallcarlson https://randallcarlson.com SPONSORS https://mybookie.ag - Use Code DJP when depositing $50 or more https://bluechew.com - Try BlueChew FREE when you use promo code KONCRETE at checkout. FOLLOW DANNY JONES https://www.instagram.com/jonesdanny https://twitter.com/jonesdanny JOIN PATREON: https://bit.ly/koncretepatreon OUTLINE: 0:00 - Story behind the JRE episode that was silenced 19:52 - Plasmoid technology could have been used by ancient cultures - Connection to sacred geometry 28:19 - Plasmid vacuum bubbles 36:30 - First successful buildout of a plasmid engine 46:55 - The hilsch vortex tube 51:34 - The plasmoid Unification Model 57:18 - How this technology will effect the world 59:33 - The VAJRA implosive turbine & the ancient THUNDERBOLT tool 1:06:34 - Plasma powered CAT generator 1:13:05 - Chimneys & coal stacks 1:17:12 - Aerospace engineer explains potential applications for plasmid energy 1:27:26 - When will this technology be taken seriously? 1:39:57 - Thunderstorm generator measurements match the slope of the great pyramid. 1:43:57 - Potential function of the ancient “Vajra” 1:45:42 - Zeus holding the Vajra 1:56:34 - Plasmoid technology being used at a power plant 2:03:50 - Space propulsion 2:10:22 - Summary on plasmids, ancient geometry, and the future of planet earth

We're joined by regular cooperator Mike from the Turn Leftist podcast to discuss Capital Vol. 1, Ch. 12-14. How can competitiveness be harnessed for good, if it can be at all? How have these behaviors and impulses shaped, and been shaped, by different modes of production through history? One thing we unequivocally agreed on throughout the discussion is you can never have too much jolly cooperation. Big thanks to Plasmid for the music for the show: Instagram - @plasmidband https://www.instagram.com/plasmidband/ Listen / follow on Spotify https://open.spotify.com/artist/08G1F4phxjM35aTDyrzE4j

It is time to break out our botany skills, because we need to save the trees in Rapture. In this episode Camille and Nick head to Arcadia to help out dear Dr. Langford to save her trees, so that she will let us reach the door of Andrew Ryan. We give our analysis of Atlas' mental condition, figure out whether spit from bees creates honey and what is the deal with the visions Jack is having. Also we determine what side of the Rapture battle lines we would choose if forced to. Sick of hearing all the ads? Subscribe to Soda Premium on Apple Podcasts to get rid of them!Join the Patreon squad for bonus episodes, discord access, prizes and even more goodness. Follow @autosavepodcast on Twitter. While you are there say hello to @thisiscamco and @NickAndrade, or reach out to the show over email to say hey podcast@autosavepod.com If merch is your thing, be sure to check out the store.You can also join us on twitch, because you never know when we will pop in for a live show.If you enjoyed this episode, please rate AutoSave 5-Stars on Apple Podcasts.This show is part of the Spreaker Prime Network, if you are interested in advertising on this podcast, contact us at https://www.spreaker.com/show/4744106/advertisement

Mike joined The Intervention again to discuss Chapters 10 and 11 in Capital Vol 1. We talk about the modern relevance of these chapters, working class agency, and much more! Big thanks to Plasmid for the music for the show: Instagram - https://www.instagram.com/plasmidband/ Listen / follow on Spotify https://open.spotify.com/artist/08G1F4phxjM35aTDyrzE4j

Looking 4 Healing Radio with Dr. Bryan Ardis, Nichola Burnett, Dr. Jana Schmidt, and Dr. Henry Ealy – In this episode of Looking 4 Healing Radio, natural medicine experts Nichola Burnett, Dr. Jana Schmidt, Dr. Bryan Ardis & Dr. Henry Ealy take on important questions regarding plasmid curing compounds, intimacy, and bacterial exchange, why you should never live in fear, and great ways to wake up and start your day with stillness...

Looking 4 Healing Radio with Dr. Bryan Ardis, Nichola Burnett, Dr. Jana Schmidt, and Dr. Henry Ealy – In this episode of Looking 4 Healing Radio, natural medicine experts Nichola Burnett, Dr. Jana Schmidt, Dr. Bryan Ardis & Dr. Henry Ealy take on important questions regarding plasmid curing compounds, intimacy, and bacterial exchange, why you should never live in fear, and great ways to wake up and start your day with stillness...

Looking 4 Healing Radio with Dr. Henry Ealy – In this episode of Looking 4 Healing Radio, Dr. H is joined by Monique Bilodeau-Nestmann, who works with Dr. H and leads the research on Plasmid Curing Compounds for his research team. As you learned several weeks ago, Plasmids have the capability of delivering genetic bioweapons into human cells and especially into bacteria like E. coli. Understanding that this is the primary...

Whistleblower Report – “Plasmid-Gate” is the shocking discovery by experienced genomics scientist Kevin McKernan that the COVID shot vials from Pfizer and Moderna were contaminated with bacterial DNA foreign to humans. McKernan has two forms of foreign DNA: linearized and circular in the vaccine vials he analyzed. The presence of circular – or plasmid – DNA is the complete blueprint used to...

Spring is back in Sweden, and so are we in your ears! This month of May we bring you an interview with Anna Sjöblom, director of ReAct Europe, a branch of an international organization working to promote and deliver action on antibiotic resistance. We learn about Anna's background, the path that led her to ReAct, and many of the activities that ReAct has done and have currently ongoing. In the news section, we cover the latest expert policy brief published by ReAct, a recent article looking into how antibiotic use at a country level can affect the gut microbiome, and a study revealing that the evolutionary pathways of plasmids in a clinical setting might be more difficult to predict than previously thought. Thanks for tuning in! Check relevant links in the show notes at http://www.uac.uu.se/the-amr-studio/episode48 . Follow our updates on twitter on http://www.twitter.com/uac_uu with #theAMRstudio hashtag! Theme music by Henrik Niss: http://www.tinyurl.com/henriknissspotify .

Welcome to Episode 77 of the Monday Night MasterDebaters where I am joined by Ryan from Dangerous World Podcast, Graham Dunlop from Grimerica, Ryan Aleksander, and Drew Missen from You're Missen the Point. This was one of the most interesting MNMD we talk about clean energy tech from Malcolm Bendall, Joe Rogan censorship, Vajra, Plasmid's, UFOs, Masonic Theater, Ley Lines/Song Lines, Obelisks, Eileen McKusik, Intentions, Chaos Magik, Restrict Act, UN Ped0's, ‘Mass Shootings', SSRI's, Jab push in Canada vs Australia vs US, the infertility pandemic and much more! https://randallcarlson.com/the-malcolm-bendall-lectures/ Please leave a review & share the show! Go support the great guests at: Graham Dunlop from Grimerica & Grimerica Outlawed https://www.instagram.com/grimericashow/ www.grimerica.ca/ https://adultbrain.ca https://www.youtube.com/@adultbrainaudiobookpublishing Check out Darren's book A Canadian Shame: https://acanadianshame.ca Ryan Alekszander  https://www.instagram.com/ryanaleckszander/ https://notusbooks.org https://wagthedogtheory.com My other accounts: @wallachswarriors@transcendtowers@notusfoods Drew from You're Missen the Point Podcast, Homeroom Podcast & Movie Minds/Conspiracy Theater 3000 https://www.instagram.com/missen_the_point/ drewmissen88.podbean.com Ryan from Dangerous World Podcast Patreon: https://www.patreon.com/DangerousWorldPodcast/posts IG: @dangerousworldpod linktr.ee/dangerousworldpodcast Mat from The Great Deception Podcast Linktree: https://linktr.ee/thegreatdeceptionpodcast IG: https://www.instagram.com/thegreatdeceptionpodcast/ https://www.instagram.com/thegreatdeceptionpodcast_v2/ YouTube: https://youtube.com/user/Barons44 To Make Contributions: Patreon: https://www.patreon.com/thegreatdeceptionpodcast Merch: https://my-store-cb4b4e.creator-spring.com --- Support this podcast: https://podcasters.spotify.com/pod/show/the-great-deception-podcast/support

TWiM reveals high rates of co-transformation of plasmids in E. coli overturns the clonality myth, and bacterial membrane vesicles as a novel strategy for extrusion of the antimicrobial bismuth in H. pylori. Hosts: Vincent Racaniello, Michael Schmidt, and Petra Levin Links for this episode The myth of clonality (Sci Rep) Bacterial membrane vesicles extrude bismuth (mBio) Gastric acid levels must decrease (World J Gastroenterol) Take the TWiM Listener survey! Become a patron of TWiM. Music used on TWiM is composed and performed by Ronald Jenkees and used with permission. Send your microbiology questions and comments to twim@microbe.tv

#17 — Why do some plasmids give a better protein yield than others? It may have a lot to do with the plasmid copy number. In this episode, we talk about what plasmid copy number means, why it is important and how you can manipulate it to get the most out of your experiments. To learn more about plasmid copy number, read the full article on our site. [1] Resources: 1. https://bitesizebio.com/22824/how-to-manipulate-plasmid-copy-number/

In this week's episode, Brett and Martin talk to Adjunct Assistant Prof Dr Kalisvar Marimuthu, who is currently a senior consultant in Infectious Diseases at the National Centre for Infectious Diseases and Tan Tock Seng Hospital, Singapore. We discuss his recent paper that notes that over 50% of transmissions occurring in healthcare result from plasmid and not colonal spread. Traditional IPC interventions seem to work for clonal transmission, however new thinking is required to tackle the problems of plasmids. Papers we discuss are: 1. Marimuthu K, Venkatachalam I, Koh V et al. Whole genome sequencing reveals hidden transmission of carbapenemase-producing Enterobacterales. Nat Commun 2022; 13: 3052. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9160272/ 2. Ng DHL, Marimuthu K, Lee JJ et al. Environmental colonization and onward clonal transmission of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) in a medical intensive care unit: the case for environmental hygiene. Antimicrob Resist Infect Control 2018; 7: 51. https://aricjournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13756-018-0343-z  

In this week's episode, Brett and Martin talk to Adjunct Assistant Prof Dr Kalisvar Marimuthu, who is currently a senior consultant in Infectious Diseases at the National Centre for Infectious Diseases and Tan Tock Seng Hospital, Singapore. We discuss his recent paper that notes that over 50% of transmissions occurring in healthcare result from plasmid and not colonal spread. Traditional IPC interventions seem to work for clonal transmission, however new thinking is required to tackle the problems of plasmids. Papers we discuss are: 1. Marimuthu K, Venkatachalam I, Koh V et al. Whole genome sequencing reveals hidden transmission of carbapenemase-producing Enterobacterales. Nat Commun 2022; 13: 3052. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9160272/ 2. Ng DHL, Marimuthu K, Lee JJ et al. Environmental colonization and onward clonal transmission of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) in a medical intensive care unit: the case for environmental hygiene. Antimicrob Resist Infect Control 2018; 7: 51. https://aricjournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13756-018-0343-z  

Aging-US published a Special Collection on Eye Disease which included "p62 /SQSTM1 coding plasmid prevents age related macular degeneration in a rat model" which reported that P62/SQSTM1, a multi-domain protein that regulates inflammation, apoptosis, and autophagy, has been linked to age-related pathologies. In retinal pigment epithelium (RPE), p62DNA administration slowed down development of destructive alterations of RPE cells, including loss of regular hexagonal shape, hypertrophy, and multinucleation. In neuroretina, p 62DNA prevented gliosis, retinal thinning, and significantly inhibited microglia/macrophages migration to the outer retina. Taken together, these results suggest that the p62 DNA has a strong retinoprotective effect in AMD. Dr. Alexander Shneider and Dr. Nataliya Kolosova said, "Age-related macular degeneration (AMD) is the most common cause of irreversible vision loss in industrialized countries." AMD is a multifactorial disease involving a complex interplay of genetic, environmental, metabolic, and functional factors. There are effective treatments of vascular complications of AMD by anti-VEGF therapeutics. Retinopathy that develops in OXYS rats even at a young age corresponds (in terms of clinical manifestations and morphological characteristics) to the dry atrophic form of AMD in humans. The Shneider/Kolosova Research Team concluded in their Aging-US Research Output, "our data suggests that a p62-encoding plasmid might be a novel preventive and/or therapeutic agent for AMD as it maintained retinal thickness and restored RPE morphology." Full Text - https://www.aging-us.com/article/101537/text Correspondence to: Alexander Shneider email: ashneider@curelab.com and Nataliya Kolosova email: kolosova@bionet.nsc.ru Keywords: p62/SQSTM1, age-related macular degeneration, inflammation, gliosis, OXYS rats, aging, retina About Aging-US Launched in 2009, Aging-US publishes papers of general interest and biological significance in all fields of aging research as well as topics beyond traditional gerontology, including, but not limited to, cellular and molecular biology, human age-related diseases, pathology in model organisms, cancer, signal transduction pathways (e.g., p53, sirtuins, and PI-3K/AKT/mTOR among others), and approaches to modulating these signaling pathways. To learn more about Aging-US, please visit http://www.Aging-US.com or connect with @AgingJrnl Aging-US is published by Impact Journals, LLC please visit http://www.ImpactJournals.com or connect with @ImpactJrnls Media Contact 18009220957x105 MEDIA@IMPACTJOURNALS.COM

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.11.04.368092v1?rss=1 Authors: Sinegubova, M. V., Orlova, N. A., Kovnir, S. V., Dayanova, L. K., Vorobiev, I. I. Abstract: The spike (S) protein is one of the three proteins forming the coronaviruses' viral envelope. The S protein of the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has a spatial structure similar to the S proteins of other mammalian coronaviruses, except for a unique receptor-binding domain (RBD), which is a significant inducer of host immune response. Recombinant SARS-CoV-2 RBD is widely used as a highly specific minimal antigen for serological tests. Correct exposure of antigenic determinants has a significant impact on the accuracy of such tests - the antigen has to be correctly folded, contain no potentially antigenic non-vertebrate glycans, and, preferably, should have a glycosylation pattern similar to the native S protein. Based on the previously developed p1.1 vector, containing the regulatory sequences of the Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha gene (EEF1A1) from Chinese hamster, we created two expression constructs encoding SARS-CoV-2 RBD with C-terminal c-myc and polyhistidine tags. RBDv1 contained a native viral signal peptide, RBDv2 - human tPA signal peptide. We transfected a CHO DG44 cell line, selected stably transfected cells, and performed a few rounds of methotrexate-driven amplification of the genetic cassette in the genome. For the RBDv2 variant, a high-yield clonal producer cell line was obtained. We developed a simple purification scheme that consistently yielded up to 30 mg of RBD protein per liter of the simple shake flask cell culture. Purified proteins were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in reducing and non-reducing conditions and gel filtration; for RBDv2 protein, the monomeric form content exceeded 90% for several series. Deglycosylation with PNGase F and mass spectrometry confirmed the presence of N-glycosylation. The antigen produced by the described technique is suitable for serological tests and similar applications. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

This is my speech for my organelle the plasmid. Together we can keep each other safe. Vote plasmid!

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.06.323741v1?rss=1 Authors: Panter, F., Bader, C. D., Mueller, R. Abstract: Soil dwelling bacteria such as myxobacteria defend themselves by using secondary metabolites to inhibit growth of competing microorganisms. In this work we describe a new plasmid found in Sandaracinus sp. MSr10575 named pSa001 spanning 209.7 kbp that harbors a cryptic secondary metabolite biosynthesis gene cluster (BGC). Activation of this BGC by homologous recombination mediated exchange of the native promoter sequence against a vanillate inducible system led to production and subsequent isolation and structure elucidation of novel secondary metabolites, the sandarazols A-G. The sandarazol structure contains intriguing features such as an -chlorinated ketone, an epoxyketone and a (2R)-2-amino-3-(N,N-dimethylamino)-propionic acid building block. In depth investigation of the underlying biosynthetic machinery led to a concise biosynthetic model for the new compound family, including several uncommon biosynthesis steps. The chlorinated congener sandarazol C shows an IC50 value of 0.5 M against HCT 116 cells and a MIC of 14 M against Mycobacterium smegmatis, which points at the sandarazol's potential function as defensive secondary metabolites or toxins. The sandarazols' BGC location on pSa001 is one of the very few example of large multimodular BGCs on a replicative plasmid, whose existence points at the mechanism of horizontal gene transfer events of entire multimodular BGCs to exchange chemical warfare capabilities between bacterial species. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

This month we bring you the work and career of Dr. Olof Lindahl, one of the associate senior lecturers at UAC, working in the field of business studies applied to AMR. In the news section, we present to you a new innovative method to test how antibiotics combinations work, and cover a recent article looking into the evolution of plasmid stability in relation to antibiotic treatment. We hope you enjoy this episode and looking to having you back next month. Check relevant links and material at www.uac.uu.se/the-amr-studio/episode22/. Follow our updates on twitter on www.twitter.com/uac_uu with #theAMRstudio hashtag! Theme music by Henrik Niss: www.tinyurl.com/henriknissspotify.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.07.31.230631v1?rss=1 Authors: Graaf, L. v. d., Wagenaar, J. A., Zomer, A. L. Abstract: Antimicrobial resistance (AMR) genes in bacteria are often carried on plasmids and these plasmids can transfer AMR genes between bacteria. For molecular epidemiology purposes and risk assessment, it is important to know if the genes are located on highly transferable plasmids or in the more stable chromosomes. However, draft whole genome sequences are fragmented, making it difficult to discriminate plasmid and chromosomal contigs. Current methods that predict plasmid sequences from draft genome sequences rely on single features, like k-mer composition, circularity of the DNA molecule, copy number or sequence identity to plasmid replication genes, all of which have their drawbacks, especially when faced with large single copy plasmids, which often carry resistance genes. With our newly developed prediction tool RFPlasmid, we use a combination of multiple features, including k-mer composition and databases with plasmid and chromosomal marker proteins, to predict if the likely source of a contig is plasmid or chromosomal. The tool RFPlasmid supports models for 17 different bacterial species, including Campylobacter, E. coli, and Salmonella, and has a species agnostic model for metagenomic assemblies or unsupported organisms. RFPlasmid is available both as standalone tool and via web interface. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.07.24.215889v1?rss=1 Authors: Matlock, W., Chau, K. K., AbuOun, M., Stubberfield, E., Barker, L., Kavanagh, J., Pickford, H., Gilson, D., Smith, R. P., Gweon, H. S., Hoosdally, S. J., Swann, J., Sebra, R., Bailey, M. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W., Anjum, M. F., Read, D. S., Walker, A. S., Stoesser, N., Shaw, L. P., REHAB Consortium Abstract: IncF plasmids are diverse and of great clinical significance, often carrying genes conferring antimicrobial resistance (AMR) such as extended-spectrum {beta}-lactamases, particularly in Enterobacteriaceae. Organising this plasmid diversity is challenging, and current knowledge is largely based on plasmids from clinical settings. Here, we present a network community analysis of a large survey of IncF plasmids from environmental (influent, effluent, and upstream/downstream waterways surrounding wastewater treatment works) and livestock settings. We use a tractable and scalable methodology to examine the relationship between plasmid metadata and network communities. This reveals how niche (sampling compartment and host genera) partition and shape plasmid diversity. We also perform pangenome-style analyses on network communities. We show that such communities define unique combinations of core genes, with limited overlap. Building plasmid phylogenies based on alignments of these core genes, we demonstrate that plasmid accessory function is closely linked to core gene content. Taken together, our results suggest that stable IncF plasmid backbone structures can persist in environmental settings while allowing dramatic variation in accessory gene content that may be linked to niche adaptation. The recent association of IncF plasmids with AMR likely reflects their suitability for rapid niche adaptation. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Does a given bacterial gene live on a plasmid or the chromosome? What other genes live on the same plasmid? In this episode, we hear from Sergio Arredondo-Alonso and Anita Schürch, whose projects mlplasmids and gplas answer these types of questions. Links: mlplasmids: a user-friendly tool to predict plasmid- and chromosome-derived sequences for single species (Sergio Arredondo-Alonso, Malbert R. C. Rogers, Johanna C. Braat, Tess D. Verschuuren, Janetta Top, Jukka Corander, Rob J. L. Willems, Anita C. Schürch) gplas: a comprehensive tool for plasmid analysis using short-read graphs (Sergio Arredondo-Alonso, Martin Bootsma, Yaïr Hein, Malbert R.C. Rogers, Jukka Corander, Rob JL Willems, Anita C. Schürch)

Join the Go Folk Yourself crew as they take to the sea and sky, where there is always a man...and always a lighthouse. The gang dissects the themes and mythology of the great American cities that might have been. Would you kindly equip your Sky-Hook and inject yourself with whichever Plasmid you please. Spoilers ahead for the Bioshock series. Proceed if you dare.

What effect would legalizing sports betting in Kentucky have on the thoroughbred industry there? Plus, a revolutionary procedure to heal tendon & ligament injuries.

This episode: Some bacteria living around plants can become pathogenic just by gaining a few genes! Download Episode (9.4 MB, 10.3 minutes) Show notes: Microbe of the episode: Alternanthera yellow vein betasatellite News item Journal Paper: Savory EA, Fuller SL, Weisberg AJ, Thomas WJ, Gordon MI, Stevens DM, Creason AL, Belcher MS, Serdani M, Wiseman MS, Grünwald NJ, Putnam ML, Chang JH. 2017. Evolutionary transitions between beneficial and phytopathogenic Rhodococcus challenge disease management. eLife 6:e30925. Other interesting stories: More gut microbe diversity could be good for arteries Human gut microbes have enzymes that break down specific plant toxins (paper) Gut microbes ferment fiber and modify immune response to protect mice from flu Cooperation of plants and fungi breaks down if one finds alternative lifestyle (paper) Disproven "arsenic in the DNA" bacterium actually has interesting arsenic detox strategies (paper)   Email questions or comments to bacteriofiles at gmail dot com. Thanks for listening! Subscribe: Apple Podcasts, RSS, Google Play. Support the show at Patreon, or check out the show at Twitter or Facebook

This episode: A plasmid discovered in Antarctic archaea can create virus-like particles, membrane vesicles, and transfer itself to new hosts! Thanks to Rick Cavicchioli for his contribution. Download Episode (17.7 MB, 19.4 minutes) Show notes: Microbe of the episode: Hypomicrogaster canadensis bracovirus News item Journal Paper: Erdmann S, Tschitschko B, Zhong L, Raftery MJ, Cavicchioli R. 2017. A plasmid from an Antarctic haloarchaeon uses specialized membrane vesicles to disseminate and infect plasmid-free cells. Nat Microbiol 2:1446. Other interesting stories: Probiotic bacteria good at metabolizing potentially helpful plant compounds (paper) Bacteria can harvest precious metals from waste to make catalytic particles (paper) Bacteria help mice avoid chemotherapy-induced autoimmunity (paper) Exercise could be healthy partly because it modifies gut microbe community Gut microbe community may help some bats live long (paper)   Email questions or comments to bacteriofiles at gmail dot com. Thanks for listening! Subscribe: iTunes, RSS, Google Play. Support the show at Patreon, or check out the show at Twitter or Facebook

The TWiM team provides an update on Zika virus, and reveals a plasmid on the road to becoming a virus. Hosts:  Vincent Racaniello, Michael Schmidt, and Michele Swanson. Subscribe to TWiM (free) on iPhone, Android, RSS, or by email. You can also listen on your mobile device with the Microbeworld app. Become a patron of TWiM. Links for this episode Regional Zika update, Americas (PAHO, WHO) FGCU, Zika (TWiV 454) CDC Graphic of US zika cases as of May 2017 Archaeal plasmid travels cell to cell via vesicles (Nature Micro) Letters read on TWiM 160 Send your microbiology questions and comments (email or recorded audio) to twim@microbe.tv This episode is brought to you by the Defense Threat Reduction Agency. Part of the U.S. Department of Defense, the Agency’s Chemical and Biological Technologies Department hosts the 2017 Chemical and Biological Defense Science & Technology Conference to exchange information on the latest and most dynamic developments for countering chemical and biological weapons of mass destruction. Find out more at http://www.cbdstconference.com

Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, Alan Dove, Rich Condit, and Kathy Spindler The TWiVsters explain how superspreader bacteriophages release intact DNA from infected cells, and the role of astrocytes in protecting the cerebellum from virus infection.   Become a patron of TWiV! Links for this episode Nido2017 Meeting Superspreader bacteriophages (mBio) Astrocytes, interferon, and viral infection (JCI) Viral disruption of blood brain barrier (Trends Micro) On Warts by Lewis Thomas (pdf) Letters read on TWiV 428 This episode is brought to you by Blue Apron. Blue Apron is the #1 fresh ingredient and recipe delivery service in the country. See what’s on the menu this week and get your first 3 meals free – WITH FREE SHIPPING – by going to blueapron.com/twiv Weekly Science Picks Alan - Skulls Unlimited Rich - Bernard Moss Reflection Kathy - Why vaccines don't cause autism Dickson - Honomobo Vincent - Trump vs FDA Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

The arrival in the US of plasmid-mediated resistance to colistin antibiotics, a last line of defense against many gram-negative bacilli, and a quorum sensing system in a eukaryote are topics of this episode hosted by Vincent, Michael, and Michele. Image: Etest used to determine the minimum inhibitory concentration of an antibiotic for a particular bacterium. Hosts: Vincent Racaniello, Michael Schmidt, and Michele Swanson.  Subscribe to TWiM (free) on iTunes, Stitcher, RSS, or by email. You can also listen on your mobile device with the Microbeworld app. Links for this episode E. coli with mcr-1 on a plasmid in the US (AAC) Emergence of plasmid mediated colistin resistance in China (The Lancet) Major breach in last line of defense (The Lancet) Resistance plasmid families in Enterobacteriaceae (AAC) EUCAST MIC breakpoints (ClinCalc) Role of ASM in microbial resistance one, two (bLogphase) Quorum sensing in fungi (Cell Host Microbe) Image credit Letters read on TWiM 129 This episode is brought to you by CuriosityStream, a subscription streaming service that offers over 1,400 documentaries and non­fiction series from the world's best filmmakers. Get unlimited access starting at just $2.99 a month, and for our audience, the first two months are completely free if you sign up at curiositystream.com/m​icrobe ​and use the promo code MICROBE​. Send your microbiology questions and comments (email or mp3 file) to twim@microbe.tv 

This episode: Deep-sea thermophile bacteriophage is pirated by another scurvy genetic element!! Download Episode (10.2 MB, 11.2 minutes)Show notes:Journal Paper Other interesting stories: Viral remnants are important for human stem cells and development One Clostridium (scindens) defies overgrowth of another (difficile) Mosquito bacteria hurt dengue and malaria and mosquitoes Mitochondria (and thus eukaryotes) might've come from a parasite Studying phages that kill bee-killing bacteria Post questions or comments here or email to bacteriofiles at gmail dot com. Thanks for listening! Subscribe at iTunes, check out the show at Twitter or Facebook

This episode: Salmonella strain engineered to induce our cells to immunize us against diseases! Download Episode (4.5 MB, 5 minutes)Show notes:Journal Paper Other interesting stories: Microbes found thriving in salty, noxious, sub-zero oxygen-free buried Antarctic lake Using a dog virus to make vaccines for human diseases Scientists produce electricity from plant-microbe team Newly discovered bacterium could help break down more of plant wastes for biofuels Researchers find bacteria to help degrade soil contaminants Post questions or comments here or email to bacteriofiles at gmail dot com. Thanks for listening! Subscribe at iTunes, check out the show at Twitter or SciencePodcasters.org

We had the original version of this conversation back in Podcast 111. (Towards the end) This podcast is basically us crafted it into the comic before you. So, I guess you probably know if that’s the kind of thing you want to listen at.

Stephen Farrand, University of Illinois at Urbana, USA speaks on "Sensing the Right Place, Sensing the Right Time: Variations on the Quorum-Sensing System that Regulates Plasmid Transfer in the Alpha-Proteobacteria". This seminar has been recorded by ICGEB Trieste

H. pylori kolonisiert die Magenmukosa von etwa 50% der Bevölkerung und ist die Ursache von vielen schweren Erkrankungen, wie z.B. chronischer Gastritis, Magengeschwüren und Magenkrebs. Lange Zeit wurde angenommen, dass das Milieu des Magens aufgrund der dort herrschenden Bedingungen steril sei. H. pylori hat Strategien entwickelt, um dieses Habitat zu besiedeln und stellt den dominierenden Bestandteil der Mikroflora im Magen dar. Eine entscheidende Voraussetzung für die erfolgreiche Kolonisierung ist die genetische Diversität und die damit verbundene Anpassung an die verschiedenen Mikronischen des Magens. Die Pathogenität von H. pylori wird nicht nur durch Toxine vermittelt, sondern resultiert aus der komplexen Interaktion zwischen dem Bakterium, dem Wirt und der Umwelt. Eine wichtige Bedeutung hierbei hat der Austausch von genetischem Material. Während die natürliche Kompetenz eine entscheidende Rolle für die Aufnahme von genetischem Material spielt, wird auch ein konjugativer Mechanismus zum Transfer von DNA diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals der DNaseI-resistente Transfer der intrinsischen, kryptischen Plasmide pHel4 und pHel12 zwischen H. pylori-Stämmen nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass für diesen Mechanismus sowohl die Plasmid-, als auch die chromosomal-kodierten Relaxasen nicht essentiell sind. Möglicherweise wird die Rezirkularisierung der Plasmid-DNA im Rezipienten durch RecA durchgeführt. Um Informationen über die Maschinerie, welche den DNaseI-geschützten Transfer der intrinsischen Plasmide vermittelt zu erhalten, wurden alle in H. pylori P12 identifizierten T4SS mit Hilfe einer Kontraselektionsstrategie sequentiell deletiert und Kokultivierungsexperimente mit den entsprechenden Mutanten durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass außer dem ComB-System keines der T4SS für den DNA-Transfer zwischen H. pylori-Stämmen essentiell ist. Dieses ist für die Aufnahme von DNA im Rezipienten verantwortlich und spielt auch eine Rolle für den DNA-Export durch den Donor. Das ComB-System stellt somit das entscheidende T4SS für den Transfer von DNA dar und hat eine duale Funktion hinsichtlich Transformation und einem Konjugations-ähnlichen Mechanismus im Donor und Rezipienten. Bemerkenswert ist, dass auch nach Deletion aller T4SS in H. pylori P12 DNA-Transfer stattfindet. Mögliche Kandidaten für einen alternativen DNA-Übertragungsweg, stellen Membranvesikel dar. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Tfs4 Plasmid-DNA in das umgebende Milieu sekretiert. Durch die Sekretion des Modul-artig aufgebauten kryptischen Plasmids pHel12 kann die Verbreitung von genetischem Material zwischen Stämmen unterstützt werden. Die Unabhängigkeit des DNA-Transfermechanismus von den Relaxasen, sowie die Resistenz gegenüber dem Angriff durch DNaseI lassen einen neuartigen, Konjugations-ähnlichen DNA-Transfermechanismus vermuten, der von der konventionellen Konjugation abgrenzt werden kann. Neben der Charakterisierung der DNA-Transfer-Mechanismen in H. pylori P12 wurden im Rahmen dieser Arbeit auch die kryptischen Plasmide pHel4 und pHel12 und die mögliche Funktion ihrer Genprodukte untersucht. Etwa 50% aller klinischen Isolate enthalten kryptische Plasmide. Ihre Funktion ist bisher allerdings nicht klar. Die Anwesenheit einer mob-Region deutete auf eine konjugative Übertragung der Plasmide hin. Darüber hinaus lässt die Struktur der Plasmide eine Rolle bei der Verbreitung von genetischem Material als Orte des „gene shufflings“ vermuten. Zudem konnten erste Hinweise bezüglich der mit den Plasmiden verbundenen Zytotoxizität bestätigt werden. So beeinflusst die Expression von orf4M aus pHel4 und orf12M aus pHel12 in eukaryotischen Zellen die zelluläre Integrität und führt schließlich zum Zelltod. Die kryptischen Plasmide stellen eine interessante Möglichkeit für H. pylori dar, genetische Information auszutauschen und möglicherweise die Wirtszelle zu beeinflussen.

Plasmid based gene therapy approaches often lack long term transgene expression in vivo due to silencing or loss of the vector. One way to overcome these limitations is to combine non-silenced promoters with strong viral enhancers. Here we combine cytomegalovirus (CMV) derived enhancer elements with the strong, human elongation factor 1 alpha (EF1a) promoter in a plasmid backbone devoid of potentially immunostimulating CpG sequences. The transgene expression of plasmids containing either the murine or human immediate early enhancer were monitored in vivo. The human CMV enhancer led to an enhanced and prolonged transgene signal compared to the murine enhancer. The elevated expression in the case of the human enhancer correlated with a higher plasmid copy number found in the liver two months after gene delivery. The transgene expression could be even further increased by using a new synthetic promoter, SCEP (shuffled CMV EF1 promoter) instead of the EF1 promoter, in combination with the human CMV enhancer. Secondly, to reach a tissue specific and high expression in liver carcinoma a plasmid with the AFP promoter was combined with the human CMV enhancer.

Trotz verbesserter Therapiemöglichkeiten ist die Prognose beim Fibrosarkom der Katze noch immer ungünstig. In der vorliegenden Arbeit sollte die Verträglichkeit eines neuen Therapieansatzes zur Behandlung des felinen Fibrosarkoms untersucht werden. Verwendet wurde ein nonviraler Gentransfer mittels Magnetofektion, um eine Transfektion mit dem felinen Zytokingen GM-CSF zu erreichen. Ziel der durchgeführten Phase-I-Studie war die Festlegung einer maximalen tolerierten Dosis. In die prospektive Dosis-Eskalations-Studie wurden Katzen, die definierte Einschlusskriterien erfüllten, aufgenommen. Die Steigerung der Dosis des Plasmids, das für feGM-CSF kodiert, erfolgte in vier festgelegten Schritten (50, 250, 750 und 1250 µg Plasmid). Jeweils vier Katzen wurden in eine Dosisgruppe aufgenommen. Die Plasmide wurden in wässriger Lösung in einem 1:1-Verhältnis mit magnetischen Nanopartikeln gemischt, die zur besseren Bindung an die DNA mit Polyethylenimin beschichtet waren. Die Plasmidlösung mit einem Volumen von 500 µl wurde intratumoral injiziert. Danach wurde durch Applikation eines Neodymium-Eisen-Bor-Magneten auf das Tumorgebiet ein Magnetfeld für die Dauer einer Stunde angelegt. Durch diese Magnetofektion wurde die Transfektion auf das Tumorgebiet beschränkt, sowie die Effektivität des Gentransfers verbessert. Das Behandlungsprotokoll umfasste zwei intratumorale Injektionen an den Tagen -14 und -7 sowie die großräumige en-bloc-Resektion des Fibrosarkoms an Tag 1. Eine Kontrollgruppe bestehend aus vier Katzen wurde ohne Zusatztherapie einer Operation unterzogen. Aus ethischen Gründen wurde dabei auf eine Verzögerung der chirurgischen Entfernung durch Placebo-Applikationen im Zeitraum von 14 Tagen verzichtet. Eine Untersuchung auf mögliche auftretende Toxizitäten erfolgte an den Tagen -7, 0, 14, 45, 90 und 180. Zwei weitere Untersuchungen an den Tagen 270 und 360 dienten zur Kontrolle auf Rezidiv- und Metastasenbildung. Aufgetretene klinische oder hämatologische Toxizitäten wurden anhand eines speziellen Nebenwirkungskatalogs (VCOG-CTCAE-Tabelle) erfasst und in Korrelation zur durchgeführten Therapie gestellt, um über eine Zuordnung als Nebenwirkung entscheiden zu können. Ein statistischer Vergleich erfolgte für die Parameter Körpergewicht, Leukozytenzahl und das Differentialblutbild zwischen Kontrollkatzen, behandelten Katzen und den Katzen der verschiedenen Dosisgruppen. Sieben weitere Katzen wurden mit derselben Gentherapie mit humanem GM-CSF behandelt, bei denen der Expressionsachweis von huGM-CSF mittels ELISA in den Zellkulturüberständen der angezüchteten Tumore gelang. In den ersten drei Dosisgruppen traten keine schwerwiegenden Nebenwirkungen auf. Da bei drei der vier Katzen der höchsten Dosis leichte Nebenwirkungen beobachtet wurden, wurden zwei weitere Katzen mit der höchsten Dosis behandelt. Dabei traten jedoch keine Toxizitäten auf, so dass die Dosis von 1250 µg für feGM-CSF kodierendes Plasmid als sichere, gut verträgliche Dosis für nachfolgende Phase-II-Studien festgelegt werden konnte. Auch die beobachteten Ergebnisse bezüglich Rezidivrate sind als sehr viel versprechend einzustufen.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen aufgrund ihres Differenzierungspotentials einen großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin dar. Entsprechend zahlreicher zell- und tierexperi-menteller Untersuchungen scheint die klinische Anwendung dieser adulten Stammzellpopulation im Rahmen einer Zelltherapie in greifbare Nähe zu rücken, wobei MSC als Basis für einen Patien-ten-spezifischen Zell- und Gewebeersatz dienen könnten. In welcher Weise die regenerative Kapazität der MSC durch spezielle Signaltransduktionsmechanismen gesteuert wird, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Wnt/β-Catenin-Signaltrans-duktionsweg sowohl in humanen (hMSC) als auch in murinen (mMSC) mesenchymalen Stamm-zellen untersucht. Diesem komparativen Ansatz lag das Ziel zugrunde, Gemeinsamkeiten und Unterschiede in diesen beiden Zellentitäten zu evaluieren, um damit langfristig den Grundstein für die Übertragbarkeit von Daten aus nachfolgend geplanten murinen in vivo-Modellen auf die klinische Situation legen zu können. Hierzu wurden zunächst die Basis-Komponenten des Wnt/β-Catenin-Signalweges vergleichend analysiert. Eine Aktivierung des Wnt-Signalweges wurde über Stimulation mit Wnt3a bzw. LiCl in beiden Zellspezies sowie in einem RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Ansatz durch Knockdown der für den β-Catenin-Abbaukomplex essentiellen Proteine APC und Axin2 in hMSC erreicht, während eine Inhibtion durch die Transfektion von small interfering RNAs (siRNAs) gegen das transkrip-tionsaktivierende Protein β-Catenin bzw. den Wnt-Korezeptor LRP5 induziert wurde. Dabei zeigten sich neben zahlreichen Gemeinsamkeiten unter anderem hinsichtlich der Proliferation auch klare Unterschiede zwischen hMSC und mMSC. Dies betraf insbesondere die Steuerung von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-mediierten Invasionsprozessen, die im Falle von hMSC eine deutliche Wnt-Abhängigkeit aufwiesen, während die Invasionsfähigkeit von mMSC nicht durch den Wnt-Signalweg reguliert wurde. Diese Unterschiede in den zellulären Phänotypen spiegelten sich vorwiegend in einer Spezies-divergenten Regulation der Matrix-Metalloproteinase MT1-MMP wider, da nur in hMSC die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade mit einer vermehrten MT1-MMP-Expression einherging. Darüber hinaus konnte das Tcf/Lef-Reporter-System in mMSC etabliert werden, das die Quanti-fizierung β-Catenin-abhängiger Expression ermöglicht. Dies erfolgt mit Hilfe eines Reporter-proteins, dessen Expression nur nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern induziert wird. Mit diesem System konnte unter anderem auch der Nachweis der funktionellen Plasmid-kodierten Wnt3a-Expression erbracht werden. Derartig generierte Reporter-mMSC könnten vor allen Dingen hinsichtlich einer Anwendung im in vivo-Mausmodell von großem Vorteil sein, da Wnt-aktive MSC mittels eines in vivo-Imaging-Systems visualisiert werden können, um ihre Rolle bei Geweberegenerationsprozessen aufzuklären. In einem weiteren Teilprojekt wurde die Wirkung von Dkk-1, einem Inhibitor des kanonischen Wnt-Signalweges, in hMSC eingehend untersucht. Dabei stand die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Dkk-1 und seinem Rezeptor LRP6 im Vordergrund. Versuche zum LRP6-Knockdown brachten ein komplexes Regulationssystem zutage, das eine feinjustierte Balance zwischen akti-vierenden und inhibierenden Signalen impliziert. Die Ergebnisse zusätzlicher RNAi-basierter Experimente wiesen außerdem auf eine funktionelle Divergenz von LRP5 und LRP6 hin. So vermittelt der Wnt-Korezeptor LRP5 vornehmlich aktivierende Signale, wie sie z.B. durch Wnt3a ausgelöst werden, während LRP6 hauptsächlich eine repressive Funktion beispielsweise durch Bindung von Dkk-1 zuzuordnen ist. Da neben den LRP-Rezeptoren auch Frizzled-Rezeptoren (Fzd) eine wesentliche Rolle bei der Wnt-Signalerfassung spielen, wurde zunächst das Fzd-Expressionsprofil in hMSC und mMSC mittels semiquantitativer RT-PCR-Analysen näher untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle bisher bekannten 10 Fzds auch in MSC exprimiert werden, dieses jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Zudem ergaben Wnt3a-Stimulationsexperimente in hMSC, dass die Expression von Fzd8 negativ durch Wnt3a beeinflusst wird. Um die Bedeutung von Fzd8 näher zu evaluieren, wurden daher Fzd8-Knockdown-Experimente durchgeführt. Diese ließen erkennen, dass die hMSC-Proliferation maß-geblich von der Fzd8-Expression abhängt, wobei allerdings Fzd8 keinen direkten Rezeptor für Wnt3a darstellt. Zusammenfassend spiegeln die in der vorliegenden Promotionsarbeit erhobenen Daten zum Teil eindeutige Unterschiede zwischen basalen Wnt-regulierten Prozessen in hMSC und mMSC wider, denen insbesondere bei der präklinischen Validierung von therapeutischen Strategien in Maus-modellen eine tragende Rolle zukommt. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg maßgeblich an der Steuerung des invasiven Verhaltens von hMSC beteiligt ist, wie dies in ähnlicher Weise von anderen Forschergruppen auch für die Metastasierung von Tumorzellen nachgewiesen werden konnte, erscheint es zukünftig von vorrangigem Interesse, die hier erhobenen in vitro-Daten in einem in vivo-Mausmodell zu evaluieren. In diesem Kontext kann allerdings nur durch einen komparativen Ansatz, wie er dieser Arbeit zugrunde liegt, die Basis für ein Spezies-relevantes drug design bezüglich des Wnt-Signalweges entwickelt werden, um schließlich aussagekräftige Stamm-zelltherapien bzw. Anti-Tumorstrategien entwickeln zu können.

EBV ist ätiologisch eng mit verschiedenen malignen Erkrankungen des Menschen verbunden Die meisten Erkenntnisse über die Funktionen viraler Proteine, die z. B. bei der B-Zell-Trans-formation eine Rolle spielen, stammen aus Zellkulturexperimenten, denen allerdings die Komponenten und die Komplexität eines lebenden Organismus fehlen, weswegen ein Tiermodell wünschenswert ist. Eine Möglichkeit nähere Informationen über die Machbarkeit eines Tiermodells zu bekommen, führt über die genetische Manipulation von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus. Dazu wurde die genetische Information des Epstein-Barr Virus direkt in EBNA1-positive ES-Zellen der Maus einbracht und die Aufrechterhaltung des Gesamtgenoms als extrachromosomales Plasmid nachgewiesen werden. Die ES-Zellen wurden dann in vitro zu B-Zellen differenziert, um den transformierenden Phänotyp dieses Virus in murinen B-Zellen zu analysieren. Sowohl in den ES-Zellen als auch in den in vitro differenzierten B-Zellen wurde eine Expression der Gene LMP1 und LMP2A gefunden, nicht aber eine Expression des Gens EBNA2. Dieses Expressionsmuster ist charakteristisch für die Latenz II des Virus. Die viralen EBNA-Promotoren waren in beiden Zellarten aktiv, aber eine genaue Analyse ergab Hinweise auf Probleme bei der Transkription bzw. bei der mRNA-Prozessierung. Dies ist vermutlich der Grund für das Fehlen einer EBNA2-Genexpression.

Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein bedeutender Lebensmittelkeim, der vorwiegend in Schweinefleisch vorkommt. Kulturell ist er sehr schwer nachzuweisen, da er auf Selektivagar sehr schnell von anderen Keimen überwuchert wird. Zudem sind die kulturellen Isolierungsmethoden sehr zeitaufwendig und eine Aussage über pathogene oder apathogene Stämme kann aufgrund der Ergebnisse ohne weitere Diagnostik nicht getroffen werden. Aus diesen Gründen wird in der Diagnostik von Y. enterocolitica aus Lebensmitteln vermehrt der PCR-Nachweis eingesetzt, welcher innerhalb von Stunden, bei vorheriger Anreicherung nach einem Tag, ein zuverlässiges Ergebnis liefert. Abhängig von der Wahl des Zielgenes werden nur pathogene Keime detektiert. Die Sensitivität einer PCR ist in großem Maße von der Aufreinigung abhängig, deshalb sollte ein PCR-Protokoll immer einschließlich Probenvorbereitung etabliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time PCR-basiertes Nachweisverfahren, zusammen mit der Probenvorbereitung, für Y. enterocolitica in Lebensmitteln entwickelt. Nachgewiesen wurde das chromosomale ail-Gen, sowie das auf dem Plasmid lokalisierte virF-Gen. In Vorversuchen erfolgte die Optimierung von verschiedenen Bedingungen für eine PCR, wie die Mastermix-Konzentration, Primer-Konzentration und Annealing-Temperatur. Anschließend erfolgte die Untersuchung von gezielt kontaminierten Rinderhackfleischproben. Diese Proben wurden nach Anreicherung mit sechs verschiedenen Extraktionsverfahren aufgereinigt und anschließend mit drei PCR-Methoden, davon eine Real-Time PCR mit SYBR Green und eine TaqMan Real-Time PCR sowie eine konventionelle Multiplex-PCR mit Gelelektrophorese, auf Y. enterocolitica untersucht. Parallel dazu wurde der klassische kulturelle Nachweis mit Anreicherung in TSB und ITC und Ausstrich auf CIN-Agar durchgeführt. Abschließend erfolgte die Untersuchung von 150 Schweinefleischproben aus dem Handel. Diese wurden ebenfalls mittels der drei PCR-Methoden und kulturell untersucht. Die Aufreinigung der Proben erfolgte nach Anreicherung mit drei Extraktionsmethoden, welche in den Versuchen mit den beimpften Proben die besten Ergebnisse lieferten. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Stämme der Spezies Arcanobacterium (A.) pyogenes gelten allgemein als empfindlich gegenüber Penicillinen. Hauptsächlich aus diesem Grund gibt es bisher keine etablierte Methode zur Empfindlichkeitsbestimmung von A. pyogenes. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für A. pyogenes eine Methode zur Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) mittels Bouillonmikrodilution erarbeitet, die sich an der Vorgehensweise des CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA)-Dokumentes M31-A2 orientiert. Mit Hilfe der erarbeiteten Methode wurden die MHK-Werte zweier Bakterienkollektive mit insgesamt 115 Bakterienstämmen [53 süddeutsche Isolate sowie 62 deutschlandweit im Rahmen eines Monitoringprogramms (Bft-GermVet) gesammelte Stämme] bestimmt. Zusätzlich wurde die genetische Grundlage der dabei häufig zu beobachtenden Tetracyclinresistenz untersucht. Bei Anwendung der vom CLSI-Dokument empfohlenen Verdünnung der Bakteriensuspension im Medium im Verhältnis 1:200 wurde die Inokulumsdichte von A. pyogenes im Vergleich zum vorgeschriebenen Dichtebereich etwa um das Dreifache über-schritten. Daher wurde eine Verdünnung im Verhältnis 1:667 vorgenommen, wodurch valide Inokulumsdichten erreicht wurden. In der vom CLSI-Dokument empfohlenen kationenadjustierten Müller-Hinton-Bouillon (CaMHB) konnte ohne weitere Zusätze kein ausreichendes Bakterienwachstum erreicht werden, unter Zusatz von 2 % fetalem Käl-berserum (FKS; aufgrund des Vorhandenseins von Thymidin nur für die Testung nicht-sulfonamidhaltiger Antibiotika verwendbar) oder 2 % lysiertem Pferdeblut konnte die MHK nach 24 Stunden gut abgelesen werden. Aerob (von der CLSI-Norm empfohlen) und unter Zusatz von 3 Vol% CO2 bebrütete Mikrotiterplatten wiesen nach 24 Stunden keine relevanten Unterschiede in der MHK der untersuchten Wirkstoffe auf. Aufgrund der besseren Ablesbarkeit wurde der Inkubation unter Zusatz von CO2 der Vorzug gegeben. Die aus dem süddeutschen Raum stammenden A. pyogenes-Stämme wurden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Tetracyclin, Penicillin G und Erythromycin untersucht. Im Rahmen des BfT-GermVet-Projekts wurden die Isolate auf ihre Empfindlichkeit gegenüber 24 verschiedenen Wirkstoffen geprüft. Eine qualitative Bewertung als „resistent“ oder „sensibel“ konnte anhand der im Dokument M31-A2 vorhandenen Grenzwerte nur für wenige Wirkstoffe (Amoxicillin/Clavulansäure, Cephalothin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Sulfa-methoxazol/Trimethoprim, Sulfamethoxazol; Ampicillin und Penicillin unter Vorbehalt) vorgenommen werden. Gegenüber den getesteten β-Lactam-Antibiotika, Aminoglykosiden, Fluorchinolonen und Phenicolen wurden generell niedrige MHK-Werte beobachtet, die - soweit Grenzwerte vorhanden waren - im sensiblen Bereich lagen. Bei der Testung von Sulfonamiden und potenzierten Sulfonamiden kam es zu großen Unterschieden zu früheren Studien, was jedoch eher auf methodische Unterschiede zurückzuführen ist als auf Änderungen der Resistenzraten. Gegenüber Sulfamethoxazol/Trimethoprim waren alle Stämme empfindlich, gegenüber Sulfamethoxazol waren die porcinen Isolate ebenfalls empfindlich, die bovinen Stämme wiesen je nach Indikation eine Resistenzrate von 24 bis 32 % auf. Insgesamt waren 9,5 % der untersuchten Isolate resistenzverdächtig gegenüber Makrolid-Antibiotika. Diese im Vergleich zur Literatur niedrige Zahl ist entweder durch die unterschiedlichen Isolatzahlen bedingt oder tatsächlicher Ausdruck eines Resistenzrückgangs, der mit dem Verbot von Tylosin als Futtermittelzusatzstoff in den 1990er Jahren assoziiert sein könnte. Bei der Untersuchung von Tetracyclin erwiesen sich unabhängig von der Tierart über 60 % der Isolate als resistenzverdächtig, wobei die MHK90 beim Schwein bei 8 µg/ml und beim Rind bei 64 µg/ml lag. Bei der genetischen Untersuchung von 36 tetracyclinresistenten Isolaten aus Süddeutschland auf das Vorkommen von acht verschiedenen tetracyclinresistenzvermittelnden Genen konnte bei 66,7 % der Isolate das für ein ribosomales Schutzprotein kodierende Resistenzgen tet(W) detektiert werden, das in der Literatur als hauptverantwortlich für die Tetracyclinresistenz bei A. pyogenes gilt. Neben diesem konnte auch die strukturelle Einheit eines für ein Effluxprotein kodierenden Gens, tet(33), bei 22,2 % der Isolate nachgewiesen werden. Bei keinem Stamm konnte tet(33) ohne gleichzeitig vorhandenes tet(W) isoliert werden. Die in der Literatur beschriebene Lokalisation von tet(33) auf einem Plasmid konnte für die untersuchten Stämme nicht bestätigt werden. Bei allen tet(W)- und tet(33)-positiven Isolaten handelte es sich um Stämme boviner Herkunft. Der MHK-Wert der tet(W)-positiven Isolate lag zwischen 8 und 64 µg/ml, die Mehrheit der Stämme hatte eine MHK von 16 µg/ml. In Anwesenheit von tet(33) lag die MHK bei sieben von acht Isolaten bei 32 µg/ml, ein Isolat wies eine MHK von 64 µg/ml auf. Bei einem Isolat boviner Herkunft (4371-03), bei dem weder tet(W) noch tet(33) detektiert werden konnte, konnte erstmals für Arcanobakterien die regulatorische Einheit des Gens tet(Z), das bisher nur bei Corynebacterium glutamicum beschrieben wurde, identifiziert werden. Das Strukturgen tetA(Z), das ebenfalls für ein Effluxprotein kodiert, konnte nur partiell nachgewiesen werden. Es ist daher nicht bekannt, ob die bei 4371-03 beobachtete MHK von 8 µg/ml auf das identifizierte tet(Z) zurückzuführen ist. Insgesamt blieben elf Isolate einschließlich aller Stämme porciner Herkunft (N = 8) ohne zugeordnete tet-Determinante.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Proteomstudien an Halobacterium salinarum durchgeführt, die sich generell in drei unabhängige Themenblöcke unterteilen lassen. Zunächst erfolgte die Erfassung des cytosolischen Proteoms auf standardisierten 2-D Gelen. Hierfür wurde die Auftrennung auf sogenannten Zoom-Gelen aufgrund der engen pI-Verteilung halobakterieller Proteine etabliert. Die erschöpfende Analyse der so aufgetrennten Proteine wurde mit der peptide mass fingerprinting Methode im Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. So konnten so 40% des zugänglichen cytosolischen Proteininventars identifiziert und auf Referenz 2-D Gelen kartiert werden. Des Weiteren konnten die massenspektrometrischen Proteinidentifizierungen zur intensiven Verbesserung der in vielen Fällen nicht eindeutigen Genomannotation herangezogen werden. Durch die Korrelationsanalyse von experimentellen und theoretischen pI-Werten konnten weitere Annotationsfehler behoben werden. Das Zusammenspiel von Genomik und Proteomik erlaubte die Identifizierung eines Bereichs ehemaliger Plasmid DNA, die in das Chromosom eingewandert ist. Weiter konnte für ein Plasmid gezeigt werden, dass dieser ehemalig chromosomale DNA und somit eine Reihe wichtiger und essentieller Gene enthält und deshalb eher als zweites Chromosom angesehen werden sollte. Nach der Inventarisierung folgten Analysen zur differentiellen Expression cytosolischer Proteine in Abhängigkeit unterschiedlicher Wachstumszustände. Hierbei wurde das aerobe Wachstum unter Standardbedingungen mit Wachstum unter Mangelbedingungen wie in synthetischem Medium oder unter anaeroben phototrophen Bedingungen verglichen. Bei der Analyse dieser Zustände mittels 2-DE konnten nur wenig regulierte Proteine identifiziert werden. Generell stellte sich die 2-DE aufgrund schwankender Reproduzierbarkeit und des geringen dynamischen Bereichs der gewählten Färbemethode für diese vergleichenden Analysen als wenig geeignet heraus. Die Verwendung isotopenmarkierter Sonden erlaubte hingegen einen detaillierten Einblick in die Regulationen auf Proteomebene unter besagten Bedingungen. Mit dem methodischen Ansatz der 1D-SDS PAGE LC-MALDI-TOF/TOF Analyse konnten von einem beträchtlichen Teil (ca. 40%) des cytosolischen Proteoms Regulationsinformationen erhalten werden. Auch hier zeigte sich, dass unter anaeroben phototrophen Bedingungen überraschend wenige Proteine reguliert werden müssen, damit sich der Organismus auf diese Lebensbedingung einstellen kann. Wachstum unter Nährstoffmangel in synthetischem Medium induziert überwiegend Proteine der Aminosäure- und Nukleotid-Biosynthese sowie Proteine, die am Proteinschutz und der Glykolyse beteiligt sind. Unter Standardwachstum wurden Proteine als induziert identifiziert, die bei nicht ausreichendem Vorhandensein wachstumslimitierend wirken würden. Dies waren hauptsächlich Enzyme der Thiamin und Cobalamin Biosynthese sowie des Peptid-Transportes und -Abbaues. Auch die CO2-Fixierung und die nachfolgende Gluconeogenese sind induziert. Durch die Verwendung unterschiedlicher Proteomik Ansätze konnte am Ende der Großteil der cytosolischen Proteine von H. salinarum identifiziert werden. Es scheinen nahezu alle chromosomalen Proteine auch unter Standard Wachstumsbedingungen expremiert zu werden, was starke Regulationen der Proteinkonzentrationen in Abhängigkeit unterschiedlicher Lebensbedingungen nicht notwendig macht. Der Organismus kann sich so schnell ohne großen energetischen Aufwand an wechselnde Lebensbedingungen anpassen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum untersucht. Hierbei konnten zunächst über radioaktive in vivo Markierung phosphattragende Proteine identifiziert werden. Ebenfalls gelang es, die ersten halobakteriellen Serin und Threonin Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Generell zeigte sich jedoch, dass das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum eher gering ist. Bei den identifizierten Phosphorylierungen handelte es sich ausschließlich um katalytische Zwischenprodukte. Für die Existenz von regulativen Ser/Thr oder Tyr Proteinphosphorylierungen waren keine eindeutigen Hinweise zu finden. Weiter gelang es, eine Vielzahl von N-terminal acetylierten Proteinen als eine weitere Form der posttranslationalen Modifikationen zu identifizieren.

Das feline Fibrosarkom hat mit einer Rezidivneigung von bis zu 70 % nach alleiniger chirurgischer Entfernung eine ungünstige Heilungsprognose. Auch adjuvante Chemo- oder Strahlentherapien führen nur in 42 % der Patienten zu einer rezidivfreien Zeit von über einem Jahr. In der vorliegenden Arbeit soll ein nonvirales Gentransfersystem etabliert werden, bei dem erstmalig eine Kombination aus drei felinen Zytokin-Genen zur adjuvanten Immunstimulation nach Tumorexstirpation beim Fibrosarkom der Katze eingesetzt wird. Ziel dieser Studie ist die Festlegung einer maximal tolerierten Dosis. Mit Hilfe eines Nebenwirkungskataloges, der auf der Common-Toxicity-Criteria-Tabelle des National Cancer Instiute basiert, werden klinische wie auch labordiagnostische Parameter objektiv erfasst und in Relation zur Therapie gestellt. Nach definierten Aufnahmekriterien werden Katzen mit Fibrosarkomen von prak-tischen Tierärzten an die Medizinische Kleintierklinik überwiesen. Es werden nur Tiere in die Studie aufgenommen, deren Tumoren (Primärtumor oder Rezidiv) am Rumpf lokalisiert sind. Die Tumorexstirpation muss in einer Sitzung möglich sein und darf dabei weder zu einer Gliedmaßenamputation noch zur Eröffnung einer Körperhöhle führen. Katzen, bei denen Hinweise auf Metastasen oder eine andere schwere Krankheit vorliegen, sowie Tiere, die bereits zuvor mit einer Chemo-, Strahlen- oder Gentherapie behandelt wurden, können nicht in die Studie aufge-nommen werden. Nach Tumorexstirpation wird den Tieren ein Kollagenschwamm in das Tumorbett implantiert. Dieser Kollagenschwamm trägt Plasmide, die jeweils für feIL-2, feIFNγ und feGM-CSF kodieren. Die Plasmid-DNA ist zusätzlich an Polyethylenimin (PEI) assoziiert und mit einem Hüllpolymer (P6YE5C) ummantelt. Insgesamt werden 15 Tiere in vier verschiedenen Dosisgruppen therapiert. Gruppe I (n=3) mit 75 μg je Plasmid, Gruppe II (n=3) mit 150 μg je Plasmid, Gruppe III (n=6) mit 300 μg je Plasmid und in Dosisgruppe IV (n=3) mit 600 μg je Plasmid. Als Ver-gleichsgruppe gelten vier Katzen, die unter gleichen Bedingungen nur mit einer en bloc Resektion behandelt werden. In die Studie werden 15 Katzen (mk=9, wk=6) im Alter zwischen drei und 15 Jahren aufgenommen. Die Fibrosarkome sind häufiger im Interscapularbereich lokalisiert. Bei keinem Patienten kommt es zu therapiebedingten Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens. Drei Katzen entwickeln postoperativ ein Serom, das ohne thera-peutisches Eingreifen resorbiert wird. Systemische Veränderungen, die auf die Therapie zurückgeführt werden, manifestieren sich erst in Dosisgruppe IV mit einem Abfall der Lymphozytenpopulation. Dabei fallen in einem Zeitraum bis 45 Tage nach Implantation des Kollagenschwammes die Lymphozyten bis zu 70 % des Ausgangs-wertes ab. Bei dieser Phase I-Studie handelt es sich um eine Dosisfindungsstudie. Diese wird durch das Auftreten erster Nebenwirkungen, die auf das Transgen oder auf dessen Expressionsprodukt zurückgeführt werden können, beendet. Die maximal tolerierte Dosis wird somit in vorliegender Studie auf 600 μg je Zytokin-Plasmid festgesetzt.

Die chronische lymphatische Leukämie ist die häufigste Leukämie im Erwachsenenalter in den westlichen Ländern. Erkenntnisse der letzten Jahre haben das Spektrum verfügbarer Therapien deutlich erweitert, kurativ ist bisher nur die allogene Knochenmarkstransplantation. Im Blut der betroffenen Patienten treten die Zellen des malignen Klons in Kontakt mit autologen Immuneffektorzellen. Gentherapeutische Strategien basierend auf dem Transfer immunstimulatorischer Moleküle eröffnen deshalb neue Perspektiven für die Therapie der B-CLL. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals die Eignung eines Helfervirus-freien EBV-Genvektorsystems für den Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen beschrieben. Durch Optimierung der Vektorverpackung für ein eGFP kodierendes Plasmid konnte gezeigt werden, dass sich mit Hilfe einer Helfervirus-freien Verpackungszelline infektiöse Titer bis zu 2 x 106 infektiöse Partikel/ml generieren lassen. Das untersuchte Vektorsystem eignet sich für einen effizienten Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen. Auf eine CD40L-Stimulation, wie sie zur Verbesserung der Transfereffizienz von Adenoviren zur Anwendung kommt, kann dabei verzichtet werden. Der Gentransfer lässt sich mit Hilfe eines monokonalen Antikörpers gegen CD21 weitgehend neutralisieren. In Kontrollexperimenten mit Überständen aus der Verpackung TR-deletierter Genvektorplasmide sinkt die Gentransferrate auf Werte nahe der Nachweisgrenze. Nach Verpackung des therapeutischen Moleküls CD40L sinkt die Transfereffizienz gegenüber dem eGFP kodierenden Genvektor und vermehrt unspezifische Effekte werden beobachtet. Zu den charakteristischen Eigenschaften EBV abgeleiteter Genvektoren zählen ein Tropismus für B-Lymphozyten und eine grosse Verpackungskapazität, die den Transfer von Gensequenzen bis zu einer Grösse von 160 kb erlaubt. Als essentielle EBV-Elemente enthalten die Genvektoren nur die Verpackungssignale TR und den lytischen Replikationsorigin oriLyt. Zukünfte Entwicklungen des Vektorsystems haben zum Ziel das Risiko von Rekombinationsereignissen zu reduzieren, die zur Freisetzung replikationsfähiger Virusmutanten oder potentiell onkogener viraler Gene führen könnten.

Impfstoffe gelten als effektive und günstige Arzneimittel. Jedoch stehen für viele Infektionskrankheiten wie AIDS, Tuberkulose, Hepatitis C oder Malaria keine oder keine wirksamen Impfmöglichkeiten zur Verfügung. Um gegen intrazelluläre Erreger oder auch Tumore wirksam zu sein, muß ein potentieller Impstoff eine humorale und eine starke zelluläre Immunantwort induzieren. Diese Vorraussetzung kann vor allem durch genetische Immunisierungen mit DNA oder viralen Vektoren erfüllt werden. Vor diesem Hintergrund wurde im Rahmen dieser Arbeit das Potential einer DNA-Vakzine und eines HSV-1-basierten Vektors untersucht, Mäuse vor Infektionen mit dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes zu schützen. Zunächst wurde die Immunantwort untersucht, welche durch Immunisierung mit einem OVA-kodierenden Plasmid induziert wurde. Dabei konnte erstmals in vivo gezeigt werden, daß die Form (sezerniert oder membrangebunden) des exprimierten Antigens nach einer DNA-Immunsierung mittels Gene Gun sowohl das Ausmaß der humoralen Immunantwort beeinflußt, als auch die Expansion antigenspezifischer CD4- und CD8-T-Zellen. Desweiteren stellte sich heraus, daß replikationsinkompetente, rekombinante HSV-1- (rHSV-1) Vektoren und HSV-1-Amplikons in der Lage sind, eine sehr starke CTL-Antwort, aber nur eine schwache Antikörper- und CD4-T-Zellantwort zu induzieren. Eine starke, antigenspezifische CTL-Antwort konnte ebenso durch Immunisierung mit rekombinanten MVA-Vektoren generiert werden. In Vakzinierungsexperimenten konnte nachgewiesen werden, daß mit rHSV-1 immunisierte Mäuse vor Infektionen mit hohen Dosen an rekombinanten Listerien geschützt waren, wohingegen DNA-immunisierte Mäuse nur vor Infektionen mit einer mittleren, aber dennoch letalen Dosis geschützt waren. Der Immunschutz war in beiden Fällen von langer Dauer. Im Rahmen dieser Arbeit konnte demonstriert werden, daß die DNA-Immunisierung per Gene Gun eine einfach anzuwendende, verläßliche und effektive Methode ist, eine humorale und zelluläre protektive Immunantwort in Mäusen zu induzieren. Besonders im Hinblick auf neue Vakzinierungsstrategien gegen intrazelluläre Erreger, die vor allem durch starke zytotoxische T-Zellantworten bekämpft werden können, erscheinen Immunisierungen mit rHSV-1-Vektoren als sehr geeignete Methode, die es gilt, sorgfältig zu untersuchen und weiterzuentwickeln.

In dieser Arbeit wurden drei Aspekte der Reifung der Hydrogenasen in E. coli näher untersucht: 1. Eine Deletion im carAB-Locus führt zum Verlust der Synthese aktiver Hydrogenasen in E. coli. Die Aktivität kann wiederhergestellt werden, wenn der Stamm mit einem carAB-tragenden Plasmid transformiert oder wenn er in Anwesenheit von Citrullin angezogen wird. Da der carAB-Locus für das Enzym der Carbamoylphosphat-Synthese kodiert und Citrullin in der Zelle in Carbamoylphosphats umgewandelt werden kann, ist Carbamoylphosphat die Ausgangssubstanz für die Synthese der Liganden des Metallzentrums. Aufgrund seiner Struktur wurden Reaktionsmechanismen postuliert, über die es in CN- und/oder CO-Einheiten umgewandelt werden kann. 2. Dem HypF-Protein konnte die biochemische Funktion einer Carbamoylphosphat-Phosphatase zugeschrieben werden, zusätzlich besitzt es eine an die Anwesenheit von Carbamoylphosphat gekoppelte ATP-hydrolysierenden Aktivität. Die ATP-Hydrolyse durch HypF führt zur Bildung von AMP und PPi und sie geht parallel mit der Ausbildung eines adenylierten Reaktionsintermediats wie über die Pyrophosphat-ATP-Austausch-Reaktion gezeigt wurde. Beim adenylierten Intermediat handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um Carbamoyl-Adenylat. Es wird postuliert, dass dieses Substrat vom HypE-Protein zur Bildung des CN-Liganden durch einen Wasserentzug über eine PurM-ähnliche Reaktion verwendet wird. Durch spezifische Mutagenisierung konnten HypF-Varianten konstruiert werden, die zur Bildung aktiver Hydrogenasen unfähig waren. Die drei strukturell auffälligsten Motive des HypF-Proteins (Acylphosphat-Phosphatase-, Zink-Finger- und O-Carbamoyl-Transferase-Motiv) sind wichtig für die optimale Reifung der Hydrogenasen. Diese in vivo Unfähigkeit der Mutanten aktive Hydrogenasen zu synthetisieren geht mit dem Verlust der Carbamoylphosphat-Phosphatase einher. 3. Die kristallographische Analyse des HybD-Proteins als Beispiel einer spezifisch an der Hydrogenasen-Reifung beteiligten Protease, zeigte die Anwesenheit einer essentiellen Metallbindetasche, an deren Ausbildung Glu, Asp und His beteiligt sind und die in einer Peptidbindungsfurche liegt. Die Metalltasche fungiert spezifisch als Nickelerkennungsstelle in der Prozessierung, da nur Nickel-enthaltendes Apo-Protein prozessiert werden kann

Sat, 1 Jan 1994 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8643/1/rescue_of_synthetic_genomic_rna_analogs_of_rabies_virus_8643.pdf Schnell, M.-J.; Conzelmann, Karl-Klaus d

The plasmid-encoded outer membrane protein YadA of enteropathogenic yersiniae is associated with pathogenicity. Recently, collagen binding of YadA-positive yersiniae was reported without detailed characterization (L. Emödy, J. Heesemann, H. Wolf-Watz, M. Skurnik, G. Kapperud, P. O'Toole, and T. Wadström, J. Bacteriol. 171:6674-6679, 1989). To elucidate the nature of collagen binding to YadA, we used a recombinant Yersinia strain expressing the cloned YadA gene. Direct binding of YadA-positive yersiniae to collagens was demonstrated in affinity blot experiments on nitrocellulose filters. A spectrum of collagen types in a wide concentration range were tested for their ability to block binding of 125I-labeled collagen type II to YadA-positive yersiniae. The results indicate a specific binding site(s) for YadA in collagen types I, II, III, IV, V, and XI. In contrast, collagen type VI did not bind to YadA. To characterize the binding site(s) more precisely, isolated collagen chains and cyanogen bromide fragments were investigated. These studies revealed that binding of YadA to collagen type I is confined to the alpha 1(I) chain, whereas the binding site within collagen type XI is localized in the alpha 3(XI) chain. alpha 2(I), alpha 1(XI), and alpha 2(XI) did not bind to YadA. Most interestingly, in the alpha 1(II) chain the specific binding site for YadA resides in the cyanogen bromide fragment CB10. The latter might indicate a binding site that does not depend on conformation. Based on these findings, further fragmentation and the synthesis of peptides may allow definition of the peptide sequence(s) relevant for YadA binding.

Sun, 1 Jan 1989 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8584/1/8584.pdf Scriba, Peter Christian; Heesemann, Jürgen; Franke, T. F.; Wenzel, B. E.

Fri, 1 Jan 1988 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8571/1/8571.pdf Scriba, Peter Christian; Grammerstorf, S.; Heesemann, Jürgen; Wenzel, B. E.

Fri, 1 Jan 1988 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8501/1/Scriba-Peter_C._8501.pdf Scriba, Peter Christian; Wenzel, K. W.; Heesmann, Jürgen; Wenzel, B. E.

Fri, 1 Jan 1988 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8555/1/Scriba-Peter_C._8555.pdf Scriba, Peter Christian; Wenzel, K. W.; Heesemann, Jürgen; Wenzel, B. E.

Fri, 1 Jan 1988 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8560/1/8560.pdf Scriba, Peter Christian; Wenzel, K. W.; Heesemann, Jürgen; Wenzel, B. E.

Plasmid clones containing up to 94 kilobases of single-copy DNA from band q22.3 of chromosome 21 and a complete pool of insert DNA from a chromosome 21 recombinant library have been used to rapidly detect numerical and structural aberrations of chromosome 21 by in situ hybridization in both metaphase and interphase cells. A trisomic karyotype, diagnostic of Down syndrome, is readily detected in nonmitotic cells because the majority of their nuclei exhibit three discrete foci of hybridization, in contrast to normal diploid cells, which show two foci. Chromosomal translocations involving chromosome 21 sequences were also detected with these probes, and the intranuclear location of 21q22.3 DNA sequences in "normal" human brain neurons was established with the plasmid DNA probe set. These results suggest that chromosome 21-specific probes may have utility in clinical diagnostics, especially by facilitating the direct analysis of interphase cells.

Fri, 1 Jan 1988 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8928/1/8928.pdf Scriba, Peter Christian; Grammerstorf, S.; Heesemann, Jürgen; Wenzel, B. E.

Thu, 1 Jan 1987 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8543/1/8543.pdf Scriba, Peter Christian; Gutekunst, R.; Wenzel, K. W.; Heesemann, Jürgen; Wenzel, B. E.