Podcasts about antigene

"Überprüft das darmassoziierte Immunsystem auch Flüssigkeiten, die in meinen Verdauungstrakt gelangen?" "Ist es möglich Autoimmun-Erkrankungen (wie Leaky Gut) über den Weg der Darmgesundheit zu heilen oder wesentlich zu verbessern?" "Was passiert mit meinem Immunsystem, wenn ich einen Kaugummi kaue?" "Wie sollte ich als Vegetarier das RE'SET Darmsanierungsprogramm umsetzen?" "Welche Auswirkungen hat der Candida Pilz auf das Immunsystem?" "Wie wirkt sich eine hohe Ballaststoffaufnahme (über 60g pro Tag) auf die Darmgesundheit aus?" "Was ist verantwortlich für chronische Entzündungen im Darm?" - vielen Dank für Eure Fragen zu unserer aktuellen Podcast-Episode "Darmassoziiertes Immunsystem: Lernende Immunzellen richtig trainieren". Matthias Baum aus dem art'gerecht Wissenschaftsteam liefert hier in der HEALTH NERDS Sprechstunde Antworten. -- Zur Hauptfolge: Das darmassoziierte Immunsystem ist ein wichtiger Teil unseres Immunsystems, das den Darm vor Krankheitserregern schützt und eine Immunantwort koordiniert. Es umfasst spezialisierte Strukturen wie die Peyer-Plaques und mesenteriale Lymphknoten, die Antigene erkennen und bekämpfen. Gleichzeitig erhält es die Toleranz gegenüber harmlosen Stoffen wie Nahrungsmitteln und nützlichen Darmbakterien: "Vereinfacht gesagt entscheidet dieser Teil unseres Immunsystems, ob die Dinge, die in unserem Verdauungstrakt landen, Freund oder Feind sind." - Matthias Baum aus dem HEALTH NERDS Wissenschaftsteam liefert erstaunliche Einblicke in unser Immunsystem und erklärt, wie wir es aktiv und bewusst beeinflussen können: "Unser darmassoziiertes Immunsystem lernt, und das ein Leben lang. Falsch ist die Formulierung, dass wir unser Immunsystem 'stärken' sollten. Es geht vor allem darum unsere Abwehr in Balance zu halten, damit sie nicht ständig und massiv auf alle Stoffe anspringt, die in unserem Darm landen." HEALTH NERDS. Mensch, einfach erklärt. -- Sichere Dir Dein RE'SET-Paket zur wissenschaftlich fundierten Darmsanierung - exklusiv für unsere HEALTH NERDS Community 15% günstiger mit dem Code: RESET15 im Warenkorb eingeben auf https://artgerecht.com/reset-darmsanierung-ernaehrungskonzept-paket-single -- Ein ALL EARS ON YOU Original Podcast.

Das darmassoziierte Immunsystem (auch als GALT bezeichnet, für “gut-associated lymphoid tissue”) ist ein wichtiger Teil unseres Immunsystems, das den Darm vor Krankheitserregern schützt und eine Immunantwort koordiniert. Es umfasst spezialisierte Strukturen wie die Peyer-Plaques und mesenteriale Lymphknoten, die Antigene erkennen und bekämpfen. Gleichzeitig erhält es die Toleranz gegenüber harmlosen Stoffen wie Nahrungsmitteln und nützlichen Darmbakterien: "Vereinfacht gesagt entscheidet dieser Teil unseres Immunsystems, ob die Dinge, die in unserem Verdauungstrakt landen, Freund oder Feind sind." - Matthias Baum aus dem HEALTH NERDS Wissenschaftsteam liefert erstaunliche Einblicke in unser Immunsystem und erklärt, wie wir es aktiv und bewusst beeinflussen können: "Unser darmassoziiertes Immunsystem lernt, und das ein Leben lang. Falsch ist die Formulierung, dass wir unser Immunsystem 'stärken' sollten. Es geht vor allem darum unsere Abwehr in Balance zu halten, damit sie nicht ständig und massiv auf alle Stoffe anspringt, die in unserem Darm landen." Ein Zeichen, dass mit unserem Darm etwas nicht in Ordnung ist, können z.B. plötzlich auftretende Nahrungsunverträglichkeiten, Allergien oder Reizdarmsyndrome sein. Wie eine wissenschaftlich fundierte Darmsanierung wie das art'gerecht RE'SET-Programm unser darmassoziiertes Immunsystem in Balance halten kann - auch darüber sprechen wir in dieser Episode. HEALTH NERDS. Mensch, einfach erklärt. -- Sichere Dir Dein RE'SET-Paket zur wissenschaftlich fundierten Darmsanierung - exklusiv für unsere HEALTH NERDS Community 15% günstiger mit dem Code: RESET15 im Warenkorb eingeben auf https://artgerecht.com/reset-darmsanierung-ernaehrungskonzept-paket-single -- Ein ALL EARS ON YOU Original Podcast.

Das Komplementsystem ist als Teil des angeborenen humoralen Immunsystems eines unserer wichtigsten Abwehrmechanismen gegen zelluläre Antigene.1 Aber nicht immer macht das Komplementsystem was es soll und verschiedene Erkrankungen können die Folge sein. In diesem Podcast erfahren Sie das Wichtigste über diesen komplexen Bereich der Immunologie, einfach und anschaulich dargestellt. Gast: PD Dr. Christoph Schmidt, Institut für Naturheilkunde und Klinische Pharmakologie am Universitätsklinikum Ulm. Moderator: Prof. Dr. med. Martin Grond, Chefarzt der Neurologie im Kreisklinikum Siegen 1. Merle NS et al. Complement system part II: role in immunity. Front Immunol. 2015 May 26;6:257. doi: 10.3389/fimmu.2015.00257. DE/UNB-U/0016

CoV-Tests: Wie die Biomedizinische Analytik zum Ergebnis kommt.Wie viele Personen sind mit dem Corona-Virus infiziert? Eine Zahl, die wir alle wohl sehr genau beobachten. Denn ihre Bedeutung ist enorm, für uns persönlich und für uns als Gesellschaft. Gewissheit darüber, ob das Ergebnis negativ oder positiv ist, bringen Biomedizinische Analytiker*innen ans Tageslicht. Sie führen labordiagnostische Untersuchungen durch, analysieren und validieren. Sie wissen genau, worauf es bei den Untersuchungen und Analysen ankommt. „Test ist nicht gleich Test“, so Susanne Bauer-Rupprecht und Sabine Enzinger, beide Lehrende und Forschende im Bachelorstudiengang Biomedizinische Analytik der FH Campus Wien, und erklären Begriffe wie PCR-Test, Schnelltest, Antikörper, Antigene. Wir werfen einen genauen Blick auf den Alltag in der Biomedizinischen Analytik und ihre Rolle in Zeiten der Corona-Pandemie.

✘ Werbung: https://www.Whisky.de/shop/ mRNA #Impfstoff ist die große #Innovation. Mit dieser Technik lassen sich nicht nur Antigene im Körper erzeugen, man kann auch ganz gezielt gegen #Krebs vorgehen. Der eigene Körper kann damit lernen, den eigenen Krebs zu erkennen und dann zu bekämpfen. Parallel dazu steht die #DNA-Impfung, die noch einen Schritt weiter geht und nicht RNA, sondern DNA in die Zelle einbringt. 50% der sich aktuell in Entwicklung befindlichen Impfstoffe sind mRNA oder DNA basierend. Ärztezeitung Schweiz ► https://saez.ch/article/doi/saez.2020.18982 Artikel nature ► https://www.nature.com/articles/d41586-019-03072-8 Video 1 ► https://youtu.be/xuupVgPeFIg

Heute im Podcast „Nimm die rosarote Brille ab“ zu Gast Michael Benze Michael Benze ist Zahnarzt. Des weiteren ist Michael Besitzer von Zertifikate und Diplome in folgenden Bereichen : A-, B-, C-Diplom Akupunktur Diplom Zahnarzt für Naturheilkunde incl. Homöopathie Diplom Störherd-Diagnostik und Störherd-Therapie Zertifikate Laserschutzbeauftragter Seine Tätigkeitsschwerpunkte liegen in der - Akupunktur - Homöopathie incl. Spagyrik - Laser In diesem Podcast geht es um Allergien. Du wirst die wichtigsten Begriffe, den Ablauf, Beispiele und Therapiemöglichkeiten kennenlernen. Eine Allergie ist eine überempfindliche Reaktion unseres Körpers auf Allergene. Allergene sind Antigene aus unserer Umwelt, zum Beispiel auf der Oberfläche von Pollen, Metallen oder Tierhaaren. Diese können entweder durch Berührung unsere Haut reizen, sogenannte Kontaktallergene oder über das Verdauungssystem und die Atemwege aufgenommen werden. Viel Spaß beim Podcast „ Nimm die rosarote Brille ab“. Dein Podcast für Gesundheit, Schönheit und Fitness. Deine Susanne P.S. Hinterlasse mir gerne einen Kommentar oder schreibe mir welches Thema dich brennend interessiert.

In questa puntata dal nome ambiguo parliamo di case automobilistiche che comprano cause automobilistiche, piloti di F1 che progettano automobili e diverse altre cose. Spoiler alert: le voci potrebbero non essere quelle naturali.

Mon, 13 Jul 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18883/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18883/1/Karch_Florian.pdf Karch, Florian ddc:540, ddc:

Das Mammakarzinom ist weltweit mit über 508.000 Sterbefällen die häufigste krebsbedingte Todesursache. Um dennoch eine Heilung erzielen zu können, existiert ein multimodales Therapiekonzept mit kurativer Absicht. Zu diesem Konzept gehört unter anderem auch die gezielte Krebstherapie, bei welchem sich ein Pharmakon spezifisch gegen Tumorantigene richtet. Da viele Tumorantigene jedoch nicht von allen Mammakarzinomen exprimiert werden, ist die Suche nach weiteren potentiellen Zielen für dieses Konzept sinnvoll. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Expressionsverhalten einiger relevanter Antigene analysiert. Dabei wurden die Antigene Mucin1, sein Epitop, das Thomsen-Friedenreich Antigen und die Tyrosinkinase Her4, beziehungsweise seine aktivierte, phosphorlierte Form phospho-Her4 untersucht. Mucin1, einem beim Mammakarzinom überexprimierten Transmembranprotein wird dabei eine wichtige Rolle in der Tumorprogression zugeschrieben, indem es sich während der Tumorgenese anreichern und somit die Genexpression beeinflussen kann. Das TF-Antigen wird hauptsächlich von Karzinomen und embryofetalem Gewebe gezeigt. Als Oberflächenepitop wird ihm Einfluss auf Adhäsions- und damit Metastasierungsprozesse zugeschrieben. Die Rolle von Her4 in der Tumorprogression dagegen ist trotz Verwandschaft zum bekannten Onkogen Her2/neu nicht ganz geklärt. Sowohl tumorsupressives, wie auch onkogenes Potential sind beschrieben. In der vorliegenden Studie wurden nun die genannten Antigene zu ihrem Verhältnis zur Zelldifferenzierung und zu ihrer Verteilung bezüglich des histologischen Subtyps, sowie der Herdverteilung untersucht. Des Weiteren wurden die Korrelationen der Antigene untereinander analysiert. Dabei wurde Tumorgewebe von 235 operierten Mammakarzinompatientinnen untersucht. Die in Paraffin eingebetteten Gewebeproben wurde dabei per ABC-Methode immunhistochemisch gefärbt, mittels IRS-Score nach Remmele und Stenger bewertet und danach mit dem Kruskal-Wallis Test, dem Mann-WhitneyTest und der Korrelationsanalyse nach Pearson statistisch ausgewertet. Des Weiteren wurde das Überleben der Patientinnen in Abhängigkeit ihres Mucin1-Expressionsmusters mittels Kaplan Meier Analyse und Cox-Regression untersucht. 6. Zusammenfassung - 69 - Bei der optischen Auswertung von Mucin1 fallen zwei verschiedene Färbereaktionen auf, sodass bei der weiteren Analyse eine membranständige von einer zytoplasmatischen Expression differenziert werden konnten. Auch bei Her4/phospho-Her4 ist die Expression vor allem intrazellulär auszumachen, trotz der Tatsache, dass es sich bei Her4 um ein Transmembranprotein handelt. Eine Erklärung hierfür könnten Veränderungen der Zellstruktur bei Tumoren liefern. Verschiedene Autoren konnten diesbezüglich zeigen, dass in Karzinomen sowohl Mucin1 als auch Her4/phopho-Her4 ihre Lokalisation von der Zellmembran ins Zellinnere verlegen können, um sich dadurch über Beeinflussung der Genexpression am Tumorwachstum zu beteiligen. Das Thomsen-Friedenreich Antigen befindet sich dagegen wie bei einem Oberflächenepitop zu erwarten an der Zellmembran. Die statistische Auswertung beschreibt vor allem bei schlecht differenzierten (G3), duktal-klassifizierten Mammakarzinomen hochsignifikante, positive Korrelationen des zytoplasmatischen Mucin1 mit dem TF-Antigen und mit phosho-Her4. Jenes zytoplasmatische Mucin1 zeigt dabei ein schlechteres Überleben als die membranständige Mucin1-Expression. Diese signifikanten Korrelationen und die Erkenntnis, dass zytoplasmatisch-exprimiertes Mucin1 die Genexpression zu beeinflussen vermag, könnten einen Erklärungsansatz für die TF-Expression bei Karzinomen liefern, deren Regulation noch nicht vollständig geklärt ist. Genauer gesagt, eine Interaktion der beiden Akteure untereinander bei schlecht differenzierten, duktalen Karzinomen ist durchaus denkbar. Die Regulation der proteolytischen Verlagerung von Her4/phospho-Her4 ins Zellinnere, welche Her4 erst ein onkogenes Potential verleiht, ist ebenfalls auf weiten Strecken unerforscht. Auch hier könnte durch die beschriebene Korrelation eine Interaktion mit Mucin1 mitverantwortlich gemacht werden. Wenn eine Zusammenarbeit der beschriebenen Antigene auch auf molekularer Ebene nachgewiesen werden könnten, würden diese ein denkbares, potentes Ziel für die beschriebene „targeted therapy“ darstellen. Denn eine antagonisierende Therapie gegen Proteine, die sich gegenseitig beeinflussen lässt eine Verstärkung der Therpiewirkung, im Sinne eines pharmakodynamischen Synergismus erhoffen. Die intrazelluläre Lage der Antigene könnte dagegen ein pharmakokinetisches Hindernis bei einer monokloalen Antikörpertherapie darstellen.

Die Staupe ist eine bedeutsame, weltweit verbreitete virale Infektionskrankheit der Hunde und vieler anderer Raubtierspezies. Aufgrund ihres oft letalen Ausgangs und der fehlenden Möglichkeit zur kausalen Therapie, stellt die aktive Immunisierung empfänglicher Tiere die wichtigste prophylaktische Maßnahme dar. Bei der Impfung exotischer Tierspezies stellt sich die Verwendung von für den Hund zugelassenen, attenuierten Lebendimpfstoffen, sowie anderer experimenteller Vakzinen, problematisch dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression verschiedener Staupevirus-Antigene durch das Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) untersucht, um einen sicheren Kandidaten-Impfstoff gegen die Staupe zu erstellen. Mittels homologer Rekombination wurden die Gene des Fusionsproteins (F), des Hämagglutinin-Proteins (H) und des Matrix-Proteins (M) des Staupe-virus (Canines Distemper Virus, CDV) einzeln oder in Kombination in das MVA-Genom inseriert. Durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzmarker war eine hocheffektive Aufreinigung und klonale Isolation der verschiedenen rekombinanten MVA möglich. Bei der anschließenden genetischen Charakterisierung konnte die korrekte und stabile Insertion der Fremdgene nachgewiesen werden. Bei der Expressionsanalyse der CDV-Proteine konnte eine vom gewählten Promotor abhängige Synthese beobachtet werden. Um die Kombinations-möglichkeit verschiedener Antigene in einem MVA-Vektor zu untersuchen, wurde F/H-rekombinantes MVA erstellt, welches beide CDV-Glykoproteine zur Expression brachte. Anschließende Untersuchungen der Wachstumseigenschaften der rekombinanten MVA zeigten deren uneingeschränkte Replikationsfähigkeit in embryonalen Hühnerzellen sowie deren Replikationsdefizienz in Säugerzellen, was zum einen für die Herstellung von Impfstoffpräparationen im großen Maßstab und zum anderen für die sichere Anwendung im zu impfenden Säuger entscheidend ist. Es konnte gezeigt werden, dass mittels MVA-Vektorsystem eine effiziente Expression von CDV-Proteinen möglich ist, was die erstellten Konstrukte zu interessanten Kandidaten-Impfstoffen gegen Staupe macht. Weitere Untersuchungen über deren Potential zur Induktion einer protektiven Immunität im Tier sind anzustreben.

In dieser Arbeit wurden Mikrovesikel, die von Tumor-Zelllinien in hohen Konzentrationen sekretiert wurden, zur Immunisierung von Ratten verwendet, um auf diese Weise monoklonale Anti-körper gegen membranständige Proteine zu generieren, die auf Tumorzellen vorhanden sind. Der Grund für diesen Ansatz ist, dass Mikrovesikel verschiedenste Membranproteine enthalten, die in Tumorzellen in hohem Maße exprimiert werden. Diese Mikrovesikel sind etwa hundertfach kleiner als die Zellen, denen sie entstammen und daher deutlich weniger komplex. Gleich-zeitig enthalten sie aber überproportional viele Membran-proteine. Viele, aber nicht alle dieser Proteine sind in der Onko-logie und Tumorimmunologie bereits als Tumor-assoziierte Antigene bekannt, weshalb diese Mikrovesikel hier als Onko-somen bezeichnet werden. Es hat sich herausgestellt, dass sich Onkosomen hervorragend zur Immunisierung verwenden lassen und durch ihre Immunogenität die Möglichkeit bieten, mono-klonale Antikörper gegen zunächst unbekannte, aber onko-logisch relevante Membranproteine zu generieren. Aus solchen Immunisierungen war in der Arbeitsgruppe der Antikörper 6A10 hervorgegangen, der mit hoher Spezifität und Effizienz die Tumor-assoziierte Carboanhydrase XII (CA XII) er-kennt und inhibiert. CA XII ist ein membranständiges Enzym, das auf einer Vielzahl hypoxischer Tumoren exprimiert ist und für die Homöostase des leicht alkalischen intrazellulären pH-Wertes vieler Tumorzellen entscheidend ist. Mit dem inhibitorischen Antikörper 6A10 konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass eine spezifische Hemmung der CA XII-Enzymaktivität zu einem ver-zögerten Wachstum dreidimensionaler Tumorzellverbände in vitro und in vivo führt. Bei den in-vivo-Versuchen konnte ich dabei das Wachstum von Luziferase-exprimierenden Tumoren in immundefekten NSG-Mäusen durch Biolumineszenz-basierte Bildgebung (BLI) über lange Zeiträume exakt verfolgen und quantifizieren. Mittels Fluoreszenz-basierter Bildgebung konnte ich zudem die spezifische Bindung eines 6A10-Infrarotfarbstoff-Konjugates an Tumorzellen in vivo visualisieren. Da es zuvor keinen spezifischen Inhibitor gegen die CA XII gab, waren dies die ersten Untersuchungen, die speziell die CA XII als Ziel-struktur behandelten und für die klinische Onkologie als relevantes Tumor-assoziiertes Antigen validieren konnten. In einem zweiten Teil meiner Arbeit ermittelte ich die Spezifität weiterer Tumor-reaktiver Antikörper, die aus Immunisierungen mit Onkosomen hervorgegangen sind. Diese Antikörper erkann-ten nativ gefaltete Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen und könnten zur Beantwortung verschiedener onkologischer Fragestellungen Verwendung finden. Neben dieser unspezi-fischen „reversen“ Immunisierungsmethode, verwendete ich Onkosomen erfolgreich auch zur gezielten Generierung von Antikörpern gegen ein definiertes membranständiges Protein, die humane Carboanhydrase IX. Die CA IX ist ein weiteres be-kanntes membranständiges Tumor-assoziiertes Antigen, das oft mit der Carboanhydrase XII auf invasiven soliden Tumoren ko-exprimiert ist. Damit konnte ich belegen, dass sich Mikrovesikel nicht nur für die Generierung neuartiger Tumor-reaktiver Anti-körper, sondern auch für die Entwicklung von Antikörpern gegen ein Molekül der Wahl eignen. Die Immunisierung mit nativ ge-falteten Proteinen im Kontext immunogener Mikrovesikel könnte sich zukünftig als Möglichkeit zur Generierung von Antikörpern erweisen, die mit klassischen Immunisierungsmethode nicht oder nur schwer zu erhalten sind.

Tue, 12 Mar 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15647/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15647/1/Pfister_Heike.pdf Pfister, Heike ddc:570, ddc:

Eine kritische Vorraussetzung für eine effektive Krebstherapie stellt die Identifizierung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) dar. Diese Antigene sollten Peptidsequenzen besitzen, die an MHC-Moleküle binden. Auch sollten diese von Tumorzellen prozessiert und auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Ein weiteres TAA-Kriterium stellt die Überexpression im Tumor dar, was eine Erkennung durch T-Zellen ermöglicht und folglich eine Tumor-spezifische Immunantwort nach sich ziehen soll. Bei der B-chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) wurden bislang nur wenige Tumorantigene identifiziert, die als potentielle Zielstrukturen für eine Generierung einer spezifischen T-Zellantwort in Frage kommen. Daher sind die Bestrebungen groß, neue B CLL-assoziierte Antigene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die Moleküle hTERT, CD23 und CD229 hinsichtlich ihrer Möglichkeiten untersucht, als TAAs bei der B-CLL zu fungieren. Die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase Reverse Transkripase (hTERT), stellt ein universelles Tumorantigen dar, das in einer Vielzahl verschiedener Krebstypen, einschließlich hämatopoetischer Erkrankungen, exprimiert wird, jedoch nicht oder nur in geringem Maße bei adulten, gesunden, differenzierten Zellen detektierbar ist. Der humane Niedrig-Affinitätsrezeptor für IgE, auch bekannt als CD23, ist auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu finden. Bei der B-CLL wird CD23 konstitutiv exprimiert und atypisch auf den malignen B-Zellen reguliert im Vergleich zu normalen B-Lymphozyten. Dies hat eine starke Überexpression des Moleküls zur Folge. Das Humane Ly9 oder CD229, das Homolog zum murinen Ly9, ist ein Mitglied der SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) Familie, die Singnalrezeptoren repräsentieren. CD229 interagiert mit Antigen-spezifischen Rezeptoren und vermittelt so die Zelladhäsion zwischen Lymphozyten und anderen Zellen. Die Überexpression von CD229 auf hämatopoetischen Zellen wurde in einer Publikation beschrieben, die gezeigt hat, dass 12/15 B-CLL Patienten positiv für das Molekül waren. Ein Merkmal eines Tumorantigens/TAAs stellt die Überexpression in einem Tumor im Vergleich zum Normalgewebe dar. Alle drei Antigene wurden bezüglich ihres Expressionsprofils untersucht, und es konnte eine eindeutige Überexpression verglichen mit normalen Zellen nachgewiesen werden (RT-PCR, FACS-Analysen). Die Immunogenität und MHC-Restriktion (hier HLA-A0201) der ausgewählten Peptide wurde mit Hilfe in vitro generierter zytotoxischer T-Zellen (CTLs) von gesunden Spendern gezeigt, die Antigen-spezifisch durch Stimulation mit autologen, Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs) expandiert wurden. Die endogene Prozessierung und Präsentation der potentiellen Tumorantigene, genauer der verschiedenen hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide, konnte mit Hilfe Antigen-spezifischer CTLs von gesunden Spendern nachgewiesen werden, da diese spezifisch die HLA-A0201+ B-Zell-abstammende Zelllinie Ramos, HLA-A0201+ naive B-CLL Zellen und Peptid-beladene T2-Zellen in MHC-I-restringierter Weise erkannten (IFN-γ-ELISPOT Assays, [Cr51]-release Assay). Diese Experimente lassen auf eine natürliche Prozessierung und Präsentation der hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide via HLA-A0201 auf den B-CLL Zellen schließen. Des Weiteren konnten autologe hTERT-, CD23- and CD229-spezifische T-Zellen von B-CLL Patienten in Gegenwart von autologen CD40L-aktivierten B CLL Zellen und interessanterweise auch durch autologe, naive, maligne B-Zellen expandiert werden, die einen deutlichen Anti-leukämischen Effekt zeigten (IFN-γ-ELISPOT Assays, Dimerfärbungen). Ein möglicher Grund für die Generierung einer T-Zellantwort mit autologen naiven B-CLL Zellen als Stimulatoren scheinen das von den B-CLL Zellen vermittelte Mikromilieu (Zytokinprofil) darzustellen. Anhand der Quantität und Qualität der erzielten CTL-Reaktivitäten gegen die drei unterschiedlichen Moleküle zeigte sich, dass vor allem die Oberflächenmoleküle CD229 und CD23 als neue TAAs bei der B-CLL geeignet scheinen. hTERT ist ebenfalls in der Lage, eine Antigen-spezifische T-Zellreaktion zu induzieren, jedoch mit geringerer Effizienz. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD229 und CD23 natürlich prozessiert und als TAAs bei der B-CLL präsentiert werden, die die Expansion autologer Tumor-spezifischer T-Zellen erlauben. Daher stellen sie geeignete Zielstrukturen für T-Zellbasierte, immuntherapeutische Strategien und ein Immunmonitoring bei dieser hämatologischen Erkrankung dar. Für hTERT gilt dies jedoch nur bedingt.

I recettori dei linfociti Il recettore dei linfociti B Le immunoglobuline: i

Il processamento degli antigeni Le cellule APC Presentazione di proteine citosoliche Il trasportatore

Chronische inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP) ist eine erworbene Erkrankung des peripheren Nervensystems (PNS), an deren Entstehung sowohl zellvermittelte als auch humorale Immunmechanismen gegen bisher unbekannte Antigene beteiligt sind. Um neue Erkenntnisse über die Rolle humoraler Faktoren bei der CIDP zu erlangen, wurde der Effekt von aufgereinigtem IgG von elf Patienten mit klassischer CIDP auf die neuromuskuläre Transmission untersucht. Mit Hilfe der durchströmten Macro-Patch-Clamp-Elektrode konnte die Wirkung dieser Antikörper an Zwerchfellpräparaten der Maus erforscht werden. Neben den elektrophysiologischen Untersuchungen wurde der Effekt verschiedener CIDP-IgGs auf den Calciumeinstrom in kultivierte Neurone des Bulbus olfactorius der Maus mittels Calcium-Imaging-Experimenten getestet. Die Frage nach dem möglichen Zielantigen wurde durch ELISA, Westernblots und die Applikation von monoklonalen Anti-P0-Antikörpern genauer betrachtet. Die Applikation der CIDP-IgG-Fraktionen führte zu einer irreversiblen, signifikanten Reduktion der Transmitterausschüttung an der motorischen Endplatte. Ein postsynaptischer Effekt konnte nach der Applikation von acht CIDP-IgGs nicht beobachtet werden, was die präsynaptische Natur der Blockade bestätigte. Durch die Koinkubation der CIDP-IgGs mit therapeutischem IVIg konnte die präsynaptische Blockade fast vollständig neutralisiert werden. Sowohl das Ausmaß als auch der zeitliche Verlauf der präsynaptischen Blockade variierte zwischen den IgG-Fraktionen verschiedener Patienten, was erstmals auf verschiedene Mechanismen hinwies, die der Abnahme der Acetylcholinfreisetzung zu Grunde liegen könnten. Unterstützt wurde diese Annahme durch die unterschiedlichen Effekte der CIDP-IgGs auf den Calciumeinstrom in kultivierte Neurone. Die durch drei CIDP-IgG-Fraktionen hervorgerufene präsynaptische Blockade korrelierte mit einer signifikanten Reduktion des Calciumeinstroms in die Zellen, was auf eine Interaktion der Antikörper mit spannungsabhängigen Calciumkanälen hindeutete. Zwei CIDP-IgG-Fraktionen hatten keinen Effekt auf den Calciumeinstrom. Das IgG eines weiteren Patienten verursachte sogar einen Anstieg des Calciumeinstroms in kultivierte Neurone, obwohl es gleichzeitig zu einer verminderten Transmitterausschüttung an der motorischen Endplatte führte. Antikörper gegen Ganglioside, die als mögliche Zielantigene bei der CIDP diskutiert werden, konnten in keiner der hier getesteten IgG-Fraktionen nachgewiesen werden. Dagegen führte die Applikation von monoklonalen Antikörpern gegen das periphere Myelinprotein 0 (P0) zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion der neuromuskulären Übertragung. Wie bei CIDP-Antikörpern, war dieser Effekt präsynaptischer Natur und eine Beeinträchtigung postsynaptischer Strukturen konnte nicht nachgewiesen werden. Ein solcher Mechanismus wäre für Anti-P0-positive CIDP-Patienten denkbar, jedoch konnte hier nur bei der CIDP-IgG-Fraktion eines Patienten eine Bindung an ein Zwerchfellprotein im Bereich von P0 beobachtet werden. Die vorliegende Studie spricht für eine pathophysiologische Bedeutung von humoralen Faktoren bei der CIDP. Autoantikörper, die zu einer komplementunabhängigen, irreversiblen, rein präsynaptischen Blockade der neuromuskulären Transmission führen, könnten eine Ursache der Muskelschwäche bei CIDP-Patienten darstellen. Des Weiteren erklären Autoantikörper, die über eine Veränderung der neuromuskulären Transmission wirken und nicht zwangsläufig zur komplementvermittelten Schädigung des PNS führen, den schnellen Therapieerfolg durch Plasmapheresen.

Aspergillus fumigatus ist der häufigste zum Tode führende opportunistische Erreger invasiver Mykosen des Menschen. Durch den zunehmenden Einsatz von Immunsuppressiva und agressiverer Chemotherapieschemata, aber auch durch Zunahme von Organ- und Stammzelltransplantationen, steigt die Zahl abwehrgeschwächter Patienten stetig an und mit ihnen die Zahl der Invasiven Aspergillosen. Bei steigender Inzidenz blieb die Letalität trotz weiterentwickelten Therapiemöglichkeiten in den letzten Jahren nahezu konstant. Einer der Hauptgründe dafür ist die meist späte Diagnostik der Erkrankung, welche bei Entdeckung häufig so weit fortgeschritten ist, dass jeder Therapieversuch zu spät kommt. Diese Situation erfordert dringend die Einführung von neuen diagnostischen Methoden zur Früherkennung der Invasiven Aspergillose. Ein Ansatz in dieser Arbeit sollte sein, herauszufinden welche Makromoleküle von A. fumigatus sezerniert, und damit beim Patienten in den Blutkreislauf oder Urin gelangen. Anschließend sollte untersucht werden, ob diese Pilz-Makromoleküle auch unter Infektionsbedingungen im Menschen exprimiert werden und letztendlich im Serum detektierbar sind. Dazu wurde A. fumigatus in unterschiedlichen Medien kultiviert und sezernierte Proteine analysiert. Pilzproteine sind für die Diagnostik so wichtig, da sie als erregerspezifische Antigene mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen werden können. Umgekehrt können diese Antigene auch im Patienten eine Antikörperantwort induzieren, die mittels Antigen nachgewiesen werden kann. Von den elf sezernierten Proteinen, die in dieser Arbeit identifiziert wurden, wurden zwei Proteine näher charakterisiert: Die Protease Aspergillopepsin1 (PEP1) und das Toxin Hämolysin (Hly). Gegen diese beiden Proteine wurden monoklonale Antikörper (mAk) generiert, wofür Hly zuerst rekombinant hergestellt werden musste. Mithilfe monoklonaler Antikörper wurden sowohl die Sekretionsbedingungen von PEP1 und Hly genauer charakterisiert als auch versucht, in Patientenserum diese zwei Proteine nachzuweisen. Leider konnte weder PEP1 noch Hly im Serum detektiert werden. Grund dafür könnte ein vorzeitig stattgefundener Verdau durch serumeigene Proteasen sein, oder eine zu geringe Konzentration der beiden Proteine im Serum. Die Sensitivität dieses Test könnte verbessert werden, in dem diese monoklonalen Antikörper z.B. innerhalb eines Sandwich-ELISAS eingesetzt werden. Neben Proteinen haben sich in der Vergangenheit auch Polysaccharide von A. fumigatus als geeignete diagnostische Marker einer invasiven Aspergillose erwiesen. Zwar haben sie den Nachteil, als Zellwandbestandteil von Pilzen nicht Aspergillus spezifisch zu sein. Dagegen haben sie für den Nachweis im Serum andere Vorteile: Sie sind sehr stabile Moleküle (z.B. hitzebeständig) und werden in größeren Mengen von A. fumigatus produziert und freigesetzt, sodass sie bereits mit weniger sensitiven Methoden detektierbar sind. In dieser Arbeit wurden nach Immunisierung zweier Mäuse mit A. fumigatus-Kulturüberstand u.a. zwei Antikörper gegen Galaktofuranose (Galf) identifiziert. Galaktofuranose kommt nicht nur als Seitenkette des Galaktomannans, einem Hauptbaustein der Aspergillus-Zellwand, vor, sondern ist auch Bestandteil vieler sezernierter Pilz-Glykoproteine. Das Vorkommen sowohl als fester Bestandteil der Zellwand und gleichzeitig als in die Umgebung abgegebenes Molekül macht den Zuckerrest Galaktofuranose nicht nur zu einem brauchbaren Marker für histopathologische Untersuchungen sondern auch für die Serologie. Anhand einer Galf-Deletionsmutante von A. fumigatus konnte die Spezifität zweier monoklonaler Antikörper (L-10-1 und L-99-13) gezeigt werden. Diese Antikörper wurden im Folgenden genutzt, um die Expressionsbedingungen von Galaktofuranose-Resten in A. fumigatus näher zu untersuchen. Es fiel auf, dass die Freisetzung von Zellwandbestandteilen mit Galaktofuranose-Resten stark von der Zusammensetzung des Kulturmediums abhängig ist und erst mit Auskeimung der Sporen einsetzt. Des weiteren sollte mit Hilfe der beiden α-Galf-Antikörper versucht werden in Patientenserum Galaktofuranose-Reste zudetektieren. Hierzu wurde ein Sandwich-ELISA aufgebaut, der in zwei Varianten jeweils einen der beiden α-Galf-Antikörper als Fänger-Ak nutzte und den mAk L-10-1 (nach Konjugation mit Peroxidase) als Detektor-Ak. Es konnte gezeigt werden, dass dieser ELISA in Patientenseren sehr sensitiv Galaktofuranose-haltige Bestandteile nachweist und damit die Differentialdiagnostik einer invasiven Infektion durch A. fumigatus verbessern könnte. Nach den in dieser Arbeit erhobenen Daten kann die Sensitivität gegenüber dem kommerziell verfügbaren ELISA vermutlich noch erhöht werden. Bezüglich der Spezifität konnten die Probleme mit Galaktofuranose-Reste enthaltenen Antibiotika (wie Augmentan®) jedoch nicht beseitigt werden. Die guten Ergebnisse, die in dieser Arbeit mit dem L-10-1-ELISA erzielt wurden, führten dazu, dass dieser ELISA zur Zeit für den Einsatz in der Routinediagnostik am Max-von-Pettenkofer-Institut validiert wird.

Wed, 14 Jul 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11855/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11855/1/Petermann_Sabine.pdf Petermann, Sabine ddc:570, ddc:500, Fakult

CD8+ T-Zellen spielen in der Bekämpfung von EBV eine essentielle Rolle. Zur Kontrolle dieser infizierten B-Zellen besitzt der EBV-Träger ein Repertoire an EBV-spezifischen CD8+ T-Zellen, dessen Zusammensetzung sich oft vorhersagen läßt. Neben den CD8+ T-Zellen gegen latente Proteine von EBV spielen dabei CD8+ T-Zellen gegen lytische Proteine und darunter die immundominanten IE-antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen eine wichtige Rolle. Der Grund für diese Dominanz ist bisher nicht geklärt worden, obwohl es bereits Hypothesen dazu gibt. EBV etabliert über die ersten Tage hinweg die latente Infektion in der B-Zelle und so prozessiert die frühinfizierte B-Zelle latente Antigene, die durch die entsprechenden CD8+ T-Zellen erkannt werden. Erst kürzlich wurde bekannt, dass auch die IE-Proteine des lytischen Zyklus von EBV von der frühinfizierten B-Zelle transient exprimiert werden. Ich konnte zeigen, dass die IE-Proteine in dieser frühen Phase der Infektion von der B-Zelle präsentiert und durch IE-antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen erkannt werden. Ein später im lytischen Zyklus erwartetes E-Protein wurde jedoch nicht präsentiert. Dies bestätigt die Annahme eines abortiv-lytischen Zyklus in der frühinfizierten B-Zelle. In dieser Arbeit wurde auch gezeigt, dass die Erkennung der IE-Proteine im Mittel zeitlich vor der Erkennung der latenten Proteine von EBV in der Frühphase der Infektion lag. Da dies mit einer gegenüber den Latenzantigenspezifischen T-Zellen gesteigerten Proliferation der IE-antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen einherging, stellt eine frühere Antigenerkennung durch die IE-antigen-spezifischen T-Zellen einen plausiblen Grund für die Immundominanz dieser T-Zellen dar.

Die Reaktivierung von Herpesviren, wie EBV, CMV und HHV-6, kann bei Patienten nach einer allogenen Stammzelltransplantation zu schwerwiegenden Erkrankungen und sogar zum Tod führen. Zur Behandlung von EBV- oder CMV-assoziierten Komplikationen hat sich in der Vergangenheit der adoptive Transfer von virusspezifischen T-Zellen, die aus dem T-Zellgedächtnis des Stammzellspenders isoliert wurden, als wirksam und gut verträglich erwiesen. Patienten mit einem CMV-negativen Transplantatspender haben ein erhöhtes Risiko für CMV-assoziierte Erkrankungen, und gerade in diesem Fall fehlt eine adoptive Therapie, weil CMV-spezifische T-Zellen von einem solchen Spender nicht verfügbar sind. Um dieses Problem zu lösen, habe ich in meiner Arbeit die Herstellung von CMV-spezifischen T-Zellen mittels retroviralem Transfer des spezifischen T-Zellrezeptors untersucht. Zuerst habe ich CD4+ und CD8+ T-Zellklone mit verschiedenen HLA-Restriktionen, die die endogen prozessierten und präsentierten CMV-Antigene pp65 und IE-1 erkennen, aus dem T-Zellgedächtnis von CMV-positiven Spendern generiert und charakterisiert. Für den retroviralen Transfer wurden vier pp65-spezifische T Zellrezeptoren unterschiedlicher HLA-Restriktionen ausgewählt. Die Gene der TCRs wurden kloniert und auf primäre T-Zellen CMV-negativer Spender übertragen. CMV-TCR-transgene T Zellen zeigten ein breites Spektrum an wichtigen Effektorfunktionen wie die Freisetzung von IFN-γ und IL 2 sowie Zytotoxizität und Proliferation gegenüber endogen prozessiertem pp65, und die Zellen konnten durch strikt antigenspezifische Stimulation angereichert und expandiert werden. Die Expansion der TCR-transgenen Zellen war von einem Anstieg der spezifischen Effektorfunktionen begleitet, was zeigt, dass die übertragene Spezifität stabil und voll funktionsfähig war. Deshalb erwarte ich, dass diese CMV-TCR-transgenen T-Zellen sich für die effektive Kontrolle einer akuten CMV-Infektion eignen und darüber hinaus für ein antivirales Gedächtnis sorgen werden. Auch die Reaktivierung von HHV-6 führt in immunsupprimierten Patienten zu ernsthaften Erkrankungen. Leider ist es allerdings bisher nicht möglich, HHV-6-spezifische T Zellen für den adoptiven Transfer herzustellen, weil die Antigene und Epitope der HHV-6-spezifischen Immunantwort nicht bekannt sind. Durch die Stimulation mit Peptiden aus den HHV-6-Tegumentproteinen U11 und U54, die aufgrund von konservierten HLA-Bindungsmotiven als CD8-T-Zellepitope vorhergesagt wurden, ist es mir gelungen, HHV-6-spezifische CD8+ T-Zellen von gesunden Virusträgern in vitro anzureichern. Ich konnte T-Zellklone spezifisch für mehrere HLA-A*0201-restringierte Epitope herstellen: die U11-Peptide GIL, MLW und SLM sowie die U54-Peptide ILY und LLC. Ich zeigte, dass ILY und LLC bei der intrazellulären Antigenprozessierung entstehen. ILY-spezifische T-Zellen erkannten virusinfizierte Zellen in vitro. Damit habe ich die ersten CD8-T Zellepitope von HHV-6 charakterisiert und gezeigt, dass sich auch die HHV-6-spezifische T Zellantwort, ähnlich wie die CMV-spezifische, gegen virale Tegumentproteine richtet. Durch Multimerfärbung von peripheren Blutzellen konnte ich zeigen, dass diese HHV-6-spezifischen T Zellen im T-Zellgedächtnis gesunder Virusträger im Vergleich zu anderen herpesvirusspezifischen T-Zellen selten sind. Diese Erkenntnisse liefern eine Grundlage für weitere Untersuchungen des HHV-6-spezifischen T-Zellrepertoires und helfen, Strategien für die Herstellung von HHV-6-spezifischen T-Zellen für die Immuntherapie zu entwickeln.

Über die Hälfte aller malignen Pleuraergüsse sind durch solide Tumore des Mamma- und Bronchialkarzinoms bedingt und stellen eine Fernmetastasierung dar. Trotz therapeutischer Maßnahmen wie der Pleurodese mit Talkum ist die Prognose der Patienten schlecht und ihre mittlere Überlebenszeit beträgt nur wenige Monate. Deswegen sind innovative und effiziente Therapiestrategien für die Therapie der Pleurakarzinose dringend notwendig. In dieser Arbeit wurden maligne Pleuraergüsse (MPE) von Mamma- und Bronchialkarzinompatienten auf zellulärer und molekularer Ebene charakterisiert. Die zelluläre Zusammensetzung der malignen Pleuraergüsse und die Expression prognose-, therapie- und chemoresistenzassoziierter Antigene wurden mittels immunhistochemischer Methoden nachgewiesen. Die Charakterisierung der Ergüsse zeigte eine patienten- und tumorbedingte zelluläre und molekulare Heterogenität. Dabei unterschieden sich die malignen Pleuraergüsse bezüglich der Ergussmenge, der aus den Ergüssen isolierten Zellzahl, ihrer zellulären Zusammensetzung, der Beschaffenheit der Pleurakarzinomzellen (Einzelzellen, Aggregate) und ihrer Antigenexpression. Die Analyse des Hormonrezeptorstatus ergab einen signifikanten Verlust des Östrogen- (p=0,002) und Progesteronrezeptors (p=0,0005) auf den Pleurakarzinomzellen im Vergleich zum korrespondierenden Primärtumor. Therapierelevante Antigene aber wie z.B. das epitheliale Antigen EpCAM, das Glykoprotein MUC-1 und der Wachstumsfaktorrezeptor EGF-R waren auf mehr als 70 % der MPE beim Mamma- und Bronchialkarzinom vertreten. In dieser Arbeit wurde daraufhin in einer ex vivo Studie die Wirksamkeit des bispezifischen Antikörpers MT110 gegen das Antigen EpCAM und den T-Zellrezeptor CD3 als Therapiestrategie für die Behandlung maligner Pleuraergüsse gestestet. Der Anteil der antikörpervermittelnden spezifischen Lyse der EpCAM-positiven Pleurakarzinomzellen wurde mit Hilfe der Durchflußzytometrie (FACS) bestimmt. Die MT110 abhängige Aktivierung der CD4- und CD8-positiven T-Zellen wurde über die Antigene CD25, Granzym B und die Ausschüttung immunmodulierender Zytokine nachgewiesen (FACS). Die ex vivo Therapie der MPE beim Mammakarzinom ergab eine dosisabhängige signifikante spezifische Lyse der Targetzellen nach 48 h und 72 h mit 10 ng/ml und 1000 ng/ml MT110 (48 h, p = 0,03; 72 h, p = 0,016). Bei einer Behandlungsdauer von 72 h erzielte MT110 in einer Konzentration von 1000 ng/ml eine spezifische Lyse der EpCAM-positiven Zellen von 57 % ± 29.5 % (MW ± stabwn). Die ex vivo Therapie der MPE beim Bronchialkarzinom führte zu einer durchschnittlichen spezifischen Lyse von 30 ± 38 %, die nicht signifikant war (72h, 1000 ng/ml). Der späte Aktivierungsmarker CD25 war nach 48h und 72h mit 1000 ng/ml MT110 auf den CD4- und CD8-positiven Pleuraergusszellen der Mammakarzinompatienten (p=0,03; p=0,016) und Bronchialkarzinompatienten (nicht signifikant) verstärkt exprimiert. Der erhöhte Nachweis von TNF-α (p = 0,016) und IFN-γ (p = 0,03) in den Mediumüberständen der MPE beim Mammakarzinom deutete auf eine TH-1 vermittelte Immunantwort hin. Die ex vivo Therapie der MPE mit MT110 zeigte, dass das epitheliale Antigen EpCAM ein geeignetes Zielantigen für die molekulare Therapie der Pleurakarzinose darstellt. Der bispezifische Antikörper MT110 bewirkte eine zielgerichtete spezifische Lyse der Pleurakarzinomzellen durch die Stimulation der autologen Immunzellen im malignen Erguss. Mögliche Einflüsse auf die Höhe der antikörperspezifischen Lyse sind das Vorhandensein von Aggregaten im Erguss, das Verhältnis der Effektor- und Targetzellen, sowie die Stimulierbarkeit der T-Lymphozyten. Die Wirkungsweise des Antikörpers MT110 muss in Zukunft für ein größeres Patientenkollektiv getestet werden. Der Antikörper befindet sich seit April 2008 in einer klinischen Phase I und wird bei Patienten mit EpCAM-positiven, lokal fortgeschrittenen, rezidivierten oder metastasierten Karzinomen auf Verträglichkeit und Antitumoraktivität hin untersucht. Zukünftige klinische Studien sind nötig, um die Wirksamkeit von MT110 bei Patientinnen mit MPE beim Mamma- und Bronchialkarzinom zu bestätigen.

Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Hintergrund Humane mesenchymale Stammzellen sind ein viel versprechendes Ziel für die ex vivo Gentherapie, und Lentiviren sind exzellente Vehikel für den Gentransfer in hMSCs, da sie hohe Transduktionsfrequenzen mit langfristiger Genexpression erreichen. Dennoch könnte die Seneszenz von hMSCs die therapeutische Anwendung, infolge von zeitaufwendiger Zellselektion und Virus Titration, limitieren. Diese Arbeit beschreibt optimierte Protokolle für hoch effizienten ex vivo lentiviralen Gentransfer in hMSCs und eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu bestimmen. Methoden EGFP wurde als Markergen/-protein verwendet, um verschiedene lentivirale Expressionsvektoren herzustellen. Die Produktion von Lentiviren wurde mit verschiedenen Verpackungssystemen getestet. Der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde durch Polybrene und Blasticidinselektion erhöht. hMSCs von verschiedenen Spendern wurden mittels PCR und Western Blot analysiert. Regulierte Genexpression wurde durch Herstellung eines Tet-On selbstregulierten Expressionsvektors erreicht. Mit einem p24 ELISA-Test wurden übrig gebliebene virale Partikel im Zellkulturüberstand detektiert. Die Effizienz des lentiviralen Gentransfers wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet und mittels qRT-PCR und FACS-Analyse quantifiziert. Die lentiviralen Titer wurden mit qRT-PCR der exprimierten Transgene bestimmt. Die hMSC Differenzierung wurde histologisch untersucht. Ergebnisse Selbstinaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation zeigten hoch effizienten Gentransfer in hMSCs bei der Verwendung von Polybrene. Die Blasticidinselektion hat den Prozentsatz der transgenen Zellen weiter erhöht unter Selektion von Zellen die mehrere Transgenkopien tragen. Die positiven Effekte von Polybrene und der Blasticidinselektion sind nicht von hMSCs eines speziellen Spenders abhängig. Präzise Regulation der Genexpression wurde durch Herstellung eines selbstregulierten Tet-On-Expressionssystems erreicht. Keine viralen Antigene wurden im Zellkulturüberstand nach aufeinander folgenden Medienwechseln detektiert, was auf die Abwesenheit von infektiösen Partikeln nach einigen Tagen hindeutet. In dieser Arbeit wurde ein starker linearer Zusammenhang zwischen der Virusverdünnung und der Stärke der Transgenexpression mittels qPCR Analysen beobachtet, wodurch die Virustitration durch Quantifizierung der Transgenexpression ermöglicht wird. Abschließend wurde durch Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung gezeigt, dass transduzierte hMSCs ihren Stammzellcharakter beibehalten haben und dass die Transgenexpression durch die Differenzierung nicht beeinflusst wurde. Schlussfolgerungen Die Quantifizierung der Transgen-Kopienanzahl durch qRT-PCR ist eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer nach dem ex vivo Gentransfer in hMSCs zu bestimmen. Die in dieser Arbeit optimierte und charakterisierte Methode für die effiziente lentivirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen, in Verbindung mit regulierbarer Transgenexpression, ist ein sicheres, verlässliches und leistungsstarkes Verfahren und bildet eine aussichtsreiche Grundlage für zukünftige Gentherapie und Tissue Engineering Anwendungen in hMSCs.

Unsere Untersuchungen zeigen erstmalig eine Vierfach-Immunfluoreszenz auf humanen mesenchymalen Stammzellen. Dieses Verfahren ermöglicht es, die Zellen auf Einzelzellebene zu analysieren und die Lokalisation der nachgewiesenen Antigene zu untersuchen. Die markierten Proteine Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV und CD 44 gehören dabei zum typischen Expressionsmuster von mesenchymalen Stammzellen. Durch die Kombination von Filtersets und dem Einsatz des spektralen Bildanalyseprogramms SpectraView (ASI, Israel) gelang es selbst Wellenlängen, die näher als 20nm beieinander lagen, voneinander zu unterscheiden. Bei der Auswertung bestätigte sich, dass hMSC aus einem heterogenen Zellpool bestehen. Dies zeigte sich unter anderem in der unterschiedlichen Expression des Markers Kollagen IV. Erweitert man nun das Färbeprofil um zusätzlichen Marker, so können diese Zellen auf Einzelzellebene eingehender untersucht und von anderen Zellarten und Vorläuferstufen abgegrenzt werden. Die in dieser Arbeit neu für diese Applikation etablierte Methode stellt einen erfolgsversprechenden Ansatz zur Identifikation und Charakterisierung von humanen mesenchymalen Stammzellen dar.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen und indu-ziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der Wachstumstransformation stellt ein Modellsystem dar, das die pathogenen Mechanismen in der Tumorentsteh-ung widerspiegelt. Die Epstein-Barr Virus nukleären Antigene 3A und 3C (EBNA-3A und EBNA-3C) werden in Publikationen aus dem Zeitraum von 1993 bis 1996 als essentiell für den Prozess der B-Zellimmortalisierung eingestuft. In dieser Arbeit wurde mit einer neuen Technologie, der Maxi-EBV Methode, die Rolle der EBNA-3A und -3C Proteine erneut untersucht. Sowohl mit EBNA-3A negativen als auch mit EBNA-3C negativen Viren konnten erstmals Kulturen von infizierten B-Zellen etabliert werden. Während sich aus EBNA-3A negativen B-Zellkulturen Langzeitkulturen etablieren ließen, starben EBNA-3C negative B-Zellkulturen in der Regel nach 40-70 Tagen ab. Die Effizienz der B-Zellimmortalisierung von EBNA-3A negativen Viren war im Vergleich zur Wildtyp infizierten B-Zellen 24-fach, die der EBNA-3C negativen Viren 140-fach erniedrigt. Sowohl EBNA-3A negative, als auch EBNA-3C negative LCLs sind in ihrer Viabilität eingeschränkt, weisen jedoch unveränderte Zellteilungsraten auf. Die weitere Charakterisierung der EBNA-3A negativen LCLs ergab, dass diese eine Variante des viralen LMP1-Proteins exprimieren. Offen blieb, ob diese Variante das Auswachsen der EBNA-3A negativen B-Zellkulturen begünstigt hat. In der Folge wurden die EBNA-3A negativen LCLs zur Identifizierung von EBNA-3A-Zielgenen eingesetzt und zahlreiche aktivierte und reprimierte Kandidatengene identifiziert. Eines dieser Kandidatengene, Matrix-Metalloproteinase 7 (MMP-7), das durch EBNA-3A induziert wird, wurde im Rahmen dieser Arbeit validiert. Auch mit EBNA-3C negative Viren konnten wider Erwarten LCLs erzeugt werden, die für einen begrenzten Zeitraum in Kultur gehalten werden können. Aus dem Material eines Spenders war es auch möglich, EBNA-3C negative Langzeitkulturen zu etablieren. Die Mehrzahl der EBNA-3C negativen infizierten B-Zellkulturen durchlaufen jedoch zwischen Tag 40 und 70 eine Krise und sterben. Mit der Generierung eines konditionalen EBNA-3C Systems, durch Transfektion eines Tetrazyklin-regulierbaren EBNA-3C Expressionsvektors in frisch isolierte primäre B-Zellen und anschließender Infektion mit EBNA-3C negativen Viren, wurde ein neuer Weg geschaffen, um EBNA-3C-Funktionen zu untersuchen. Dieses 2-Schrittsystem kann nun im Prinzip für jede Virusmutante eingesetzt werden.

Bei Patienten mit malignen gastrointestinalen Tumoren kommt es auch nach erfolgter R0-Resektion des Primärtumors häufig in der Folgezeit noch zur Ausbildung von Fernmetastasen. Ursächlich hierfür sind disseminierte Tumorzellen, die sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Tumorentstehung vom Primärtumor absiedeln, anschließend jedoch in eine Art Ruhephase als „dormant cells“ fallen und erst zu einem späteren Zeitpunkt wieder in die Proliferationsphase eintreten. Hinsichtlich der Evaluation des Rezidivrisikos stellen diese disseminierten Zellen zwar einen unabhängigen Prognosefaktor dar, sind jedoch im Einzelfall mit bisher zur Verfügung stehenden Nachweismethoden nur unzureichend zu identifizieren. In dieser Arbeit haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein diagnostisches Verfahren zu entwickeln, das es uns einerseits erlaubt, disseminierte Tumorzellen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu charakterisieren und quantifizieren, andererseits dem Patienten eine permanente Verlaufskontrolle durch einen einfachen Zugang zu ermöglichen. Hierfür entwickelten wir eine quantitative Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), die hinsichtlich der Zielstruktur auf die außerordentlich spezifische Familie der Melanom-Antigen-Gene (MAGE)-A ausgerichtet war. Die Expression dieser Antigene konnte bisher in vielen verschiedenen Tumortypen nachgewiesen werden, nicht jedoch in nicht-tumorösen, adulten Geweben mit Ausnahme des Hodens. Eine hohe Sensitivität der Methode war durch die Identifikation einer Consensus-Sequenz der MAGE-A-Gene gewährleistet, wodurch wir in der Lage waren, unsere Primer so zu konstruieren, dass in einem Ansatz die MAGE-Subtypen A1-A6 gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Zum einen führten wir damit Zellverdünnungs-Experimente mit der Kolonkarzinom-Zelllinie HT 29 durch, bei denen jeweils 10 ml zentralvenöses Vollblut mit einer unterschiedlichen Anzahl HT 29-Zellen versetzt wurden. Ebenfalls wurden zur Kontrolle 14 Vollblutproben von Patienten ohne Tumorerkrankung aufgearbeitet. Zum anderen untersuchten wir 22 zentralvenöse prä- und postoperative Vollblutproben von Patienten mit operablen gastrointestinalen Tumoren und 19 intraoperativ gewonnene Peritoneallavagen auf das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen. Die Zellverdünnungs-Experimente erbrachten das Ergebnis, dass mit dem verwendeten Analyseverfahren das Vorhandensein von fünf einzelnen Tumorzellen in zehn Millilitern zentralvenösen Vollblutes nachgewiesen werden kann. Dies entspricht einer Empfindlichkeit des Nachweises von einer malignen Zelle in 107 bis 108 mononuklären Zellen. Alle 14 untersuchten Negativkontrollen wurden korrekt als MAGE-A-negativ identifiziert. Von den 22 Vollblutproben der Tumorpatienten konnte präoperativ bei 10 (= 45,5%), postoperativ bei 13 (= 59,1%) eine Disseminierung nachgewiesen werden. Fünf der 19 analysierten Peritoneallavagen erbrachten ein MAGE-A-positives Ergebnis. Dabei zeigte sich keinerlei Abhängigkeit der Disseminierung von der Tumorausdehnung (pT), der Lymphknotenbeteiligung (pN), Fernmetastasen (M), Grading (G), Tumortyp, Alter oder Geschlecht der Patienten. Ob und in welcher Art und Weise die Expression von MAGE-Genen möglicherweise Zellen überhaupt erst dazu befähigt, sich vom Primärtumor abzusiedeln und welchen Einfluss die Operation selbst am Auftreten einer Disseminierung maligner Zellen hat, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausreichend untersucht und sollte Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein. Hierfür haben wir ein hochsensitives und –spezifisches Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen entwickelt, auf dessen Grundlage es gelingen könnte, geeignete Patienten spezifischen adjuvanten Immuntherapiekonzepten mit MAGE als Zielstruktur zuzuführen und so das späte Auftreten von Metastasen zu verhindern.

Unter den Prognosefaktoren beim kolorektalen Karzinom hat das Tumorstaging den größten Stellenwert und dient der weiteren Therapieplanung. In den letzten Jahren wurden zunehmend auch Tumormarker hinsichtlich der prognostischen Aussagekraft untersucht, es existieren aber kaum Studien, die an großer Fallzahl mehrere Tumormarker im Vergleich zu den etablierten Prognosefaktoren multivariat evaluiert haben. In der vorliegenden Arbeit wurden die Tumormarker CEA, CA 19-9, CA 242, CA 72-4, CYFRA 21-1, hCGß, S100 und HGF hinsichtlich ihrer prognostischen Wertigkeit beim kolorektalen Karzinom analysiert. Die präoperativen Tumormarkerwerte von CEA und CA 19-9 lagen bei 1089 Patienten (Kollektiv I) vor. Bei einem Teil dieser Patienten (n=450) waren Restproben vorhanden, so dass retrospektiv zusätzlich die Tumormarker CA 242, CA 72-4, CYFRA 21-1, hCGß, S100 und HGF analysiert werden konnten (Kollektiv II). Es zeigte sich bei allen Tumormarkern eine höhere Freisetzung mit zunehmender Tumorinfiltrationstiefe. Bei CEA und CA 19-9 wurde außerdem ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Serumkonzentration und dem Lymphknotenstatus festgestellt. Bezüglich der Korrelation der Tumormarker untereinander wurde der höchste Koeffizient für CA 19-9 und CA 242 errechnet (rs=0.79). Basierend auf den aktuellen Empfehlungen für adjuvante Therapien beim kolorektalen Karzinom wurde eine Unterteilung in Prognosegruppen vorgenommen: In der günstigen Prognosegruppe (GPG) befanden sich Patienten mit einem Kolonkarzinom Stadium I-II oder Rektumkarzinom Stadium I, in der ungünstigen Prognosegruppe (UPG) befanden sich Patienten mit einem Kolonkarzinom Stadium III oder einem Rektumkarzinom Stadium II oder III. In Anlehnung an eine Studie von Harrison et al wurden zusätzlich alle Patienten mit einem Kolonkarzinom ohne Lymphknotenbefall gesondert betrachtet. Ziel unserer Studie war es zu untersuchen, ob durch Berücksichtigung von Tumormarkern innerhalb der Prognosegruppen eine detailliertere prognostische Einschätzung mit entsprechender therapeutischer Konsequenz erfolgen kann. Dabei war unser primäres Zielkriterium das rezidivfreie Intervall, zusätzlich untersuchten wir das tumorbedingte Gesamtüberleben. 161 In der statistischen Auswertung wurde zunächst überprüft, ob eine lineare Abhängigkeit zwischen der Serumkonzentration der Tumormarker und dem Rezidivrisiko besteht. Eine solche Linearität konnte nur für CEA gezeigt werden, es ging daher in logarithmierter Form in die multivariate Analyse ein. Bei den übrigen Tumormarkern musste ein Cut-Off gesucht werden, wobei in der vorliegenden Arbeit weder die herstellerüblichen Cut-Off-Werte verwendet wurden, noch nach dem für das Kollektiv optimalen Cut-Off gesucht wurde. Vielmehr wurde versucht, mittels Bootstrapverfahren reproduzierbare Cut-Offs zu ermitteln. Nach unseren Ergebnissen ist CEA zu Recht als Kategorie I Prognosemarker klassifiziert worden. Dies konnte an großer Fallzahl und unter Berücksichtigung verschiedener anderer Tumormarker bestätigt werden. Auch in der Gruppe der Patienten mit einer günstigen Prognose sowie der N0-Kolontumoren erwies sich CEA als unabhängiger Prognosefaktor. Die Patienten dieser Gruppen erhalten laut dem aktuellen Konsensus keine adjuvante Therapie. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit sollte CEA jedoch in den Leitlinien der American Society of Clinical Oncology als prognostisch relevanter Parameter berücksichtigt werden und auch in die Therapieplanung mit eingehen. In der multivariaten Analyse hat sich darüber hinaus beim Kollektiv I gezeigt, dass neben CEA auch CA 19-9 ein stadienunabhängiger Prognosefaktor ist, jedoch nur für die ungünstige Prognosegruppe. Innerhalb des Kollektivs II erreichten die Tumormarker CEA, CA 19-9, CA 242, CA 72-4, S100 und HGF Signifikanz. Die beiden neuen und wenig erforschten Tumormarker S100 und HGF waren starke unabhängige Prädiktoren in der günstigen Prognosegruppe dieser Auswertung, sogar stärker als CEA. Dieses Ergebnis muss durch prospektive große Studien bestätigt werden. Im Gegensatz zu S100 erreichte HGF auch in der ungünstigen Prognosegruppe Signifikanz, war aber bezüglich der prognostischen Aussagekraft dem CA 242 bzw. CA 19-9 unterlegen. Gerade im Rahmen kommender Therapiestudien, bei denen der Einfluss neuer Medikamente auf die Angiogenese untersucht wird, könnte HGF von grossem Interesse sein. Der Tumormarker CA 242 kann als äquivalenter Marker zum CA 19-9 gesehen werden, so dass die parallele Bestimmung beider Tumormarker primär nicht sinnvoll ist. CA 72-4 erreichte in der uni- und multivariaten Analyse nur für das Überleben innerhalb der ungünstigen Prognosegruppe Signifikanz. 162 Die beiden Tumormarker hCGß und CYFRA 21-1 zeigten in dieser Arbeit keinerlei prognostische Bedeutung. Um unsere Ergebnisse für die klinische Anwendung zusammenzufassen, wurde für alle prognostisch relevanten Faktoren ein Prognoseindex entwickelt und zwar zunächst anhand des großen Kollektivs I. In der günstigen Prognosegruppe beinhaltet dieser Score derzeit lediglich T und logCEA, in der ungünstigen Prognosegruppe T, N, Lokalisation des Primärtumors, logCEA und CA 19-9 (Cut-off 55 U/ml). Eine Einteilung der Patienten bezüglich dieser Prognose-Scores zeigt eine deutliche Überlappung der ursprünglichen Prognosegruppen im Bezug auf das rezidivfreie Intervall. Daraus geht eindeutig hervor, dass die Bestimmung und Bewertung beider Tumormarker, also von CEA und von CA 19-9, sinnvoll ist und eine sehr viel genauere Prognoseabschätzung ermöglicht.

Vorratsmilben sind in der Humanmedizin als Auslöser von allergischem Asthma und allergischer Rhinitis bekannt. Insbesondere Landwirte und Bäcker sind diesen Milben ausgesetzt, somit sind Personen dieser Berufsgruppen häufig gegen Vor-ratsmilben¬antigene sensibilisiert. Verschiedene Studien zeigen jedoch, dass Vor-ratsmilben auch unter sehr feuchten Wohnbedingungen in Haushalten auftreten und somit an der Hausstauballergie des Menschen beteiligt sein können. In der Tiermedizin werden Vorratsmilben und ihre Antigene neben Allergenen anderer Herkunft als Auslöser der atopischen Dermatitis des Hundes angesehen. Sowohl atopische als auch gesunde Hunde zeigen häufig erhöhte vorratsmilben¬spezifische IgE-Spiegel im Serum oder vorratsmilbenpositive Intrakutantests. Da Vorratsmilben in Trockenfutter vermutet werden, sind häufige Empfehlungen an Besitzer mit sensibilisierten Hunden ein kompletter Verzicht auf Trockenfutter oder Einfrieren desselbigen, um einen Allergenkontakt der Hunde zu minimieren und die Milbenkonzentration im Futter niedrig zu halten. Ziel dieser Studie war es herauszufinden, ob Hunde durch ihr Trockenfutter oder in ihrer direkten Umgebung Vorratsmilben ausgesetzt sind. Im ersten Teil dieser Studie wurden 23 Säcke mit Hundetrockenfutter von neun verschiedenen Herstellern auf eine Kontamination mit Vorratsmilben untersucht. Die Probennahme begann am Tag der ersten Öffnung des Sackes und wurde wö¬chentlich über einen Zeitraum von bis zu sechs Wochen fortgesetzt. Zusätzlich wurden acht Proben von alten Futterresten aus Futtertonnen und aus über ein Jahr lang gelagerten Futtersäcken in die Untersuchungen einbezogen. Die Proben wur¬den innerhalb der ersten 24 Stunden nach Entnahme zerkleinert und mikrosko¬pisch untersucht. Darauf folgte eine weitere Untersuchung in Form einer Flotation und anschließender mikroskopischer Untersuchung. Im zweiten Teil der Studie wurden Staubproben aus 20 unterschiedlichen Haus¬halten mit gesunden Hunden auf eine Kontamination mit Vorratsmilben unter¬sucht. Die Staubproben repräsentierten jeweils den Fressplatz und den Schlafplatz des Hundes in jedem Haushalt. Für die Probennahme wurde ein handelsüblicher Staubsauger mit einem Filteraufsatz eingesetzt. Die gewonnenen Staubproben wurden mittels Flotationsverfahren und anschließender mikroskopischer Untersu¬chung auf eine Kontamination mit Milben überprüft. Es wurden insgesamt 154 Futterproben untersucht. Sowohl die wöchentlich unter¬suchten Trockenfuttersäcke als auch die zusätzlich untersuchten Futterreste zeig¬ten keine Kontamination mit Vorratsmilben. In fünf der insgesamt 40 untersuchten Staubproben waren Milben verschiedener Spezies vorhanden. Jede positive Probe zeigte eine Kontamination mit mindestens einer Milbe. Sie wurden in vier Proben als Hausstaubmilben Dermatophagoides pteronyssinus, in einer Probe als Demodex sp. (kurzschwänzige Art) und in einer Probe als Vorratsmilbe identifiziert. Letztere Probe stammte von einem Fressplatz des Hundes eines Haushaltes. Diese Studie lässt vermuten, dass kommerzielles Hundtrockenfutter nicht mit Vorratsmilben kontaminiert ist. Ein geringer Gehalt an Vorratsmilben in Haus¬staub zeigt, dass Hunde Vorratsmilben eher durch Staub in der Umgebung ausge¬setzt sind. Da hohe vorratsmilbenspezifische IgE-Spiegel und positive Intrakutantests beim Hund keine Seltenheit darstellen, sind weitere Studien notwendig, um Vorratsmil-benanti¬gene in Trockenfutter und in der Umgebung zu bestimmen. Darüber hin-aus müssen zukünftige Untersuchungen Aufschluss darüber geben, ob bei positiv getesteten Hunden eine wirkliche Sensibilisierung gegen Vorratsmil¬ben vorliegt oder ob eine mögliche Kreuzreaktion zu Hausstaubmilben besteht.

Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) haben, vor allem im fortgeschrittenen Stadium, wegen einer hohen Rate an lokalen Lymphknotenmetastasen und Fernmetastasen eine schlechte Prognose. Aus diesem Grunde ist man auf der Suche nach effektiven adjuvanten Therapiemöglichkeiten. Das Prinzip der Radioimmuntherapie scheint hierfür sehr viel versprechend zu sein. Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs exprimieren die tumorassoziierten Antigene EpCAM und CK8. Ziel dieser Arbeit war es, die Biodistribution und die therapeutische Wirksamkeit der an 131I bzw. 123I gekoppelten Antikörper gegen EpCAM und Cytokeratin 8 (C215 und HK-8) in vivo im SCID-Mausmodell zu untersuchen. Zunächst wurden Studien zur Biodistribution durchgeführt. Zu definierten Zeitpunkten nach i.v.-Applikation von 131I-markierten IgG2a-Antikörper C215 bzw. HK-8 wurden Mäuse euthanasiert und der prozentuale Anteil der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (%ID/g) in den einzelnen Organen sowie im Tumor bestimmt. Szintigraphiestudien mit 123I-C215 und 123I-HK-8 ergaben ebenfalls Aufschlüsse über die systemische Verteilung der Radioimmunkonjugate (RIK). Zudem wurde die therapeutische Wirksamkeit von 131I-C215 untersucht. Hierzu wurden den xenotransplantierten Mäusen 25, 15 oder 5 MBq des RIK systemisch verabreicht. Die Kontrollgruppen erhielten entweder den unmarkierte Antikörper oder sterile Kochsalzlösung. In den Untersuchungen zur Biodistribution und in der Szintigraphie ließ sich eine spezifische Anreicherung der markierten Antikörper im Tumor nachweisen. Die erreichten Tumor/Nicht-Tumor- (T/NT-) Verhältnisse waren bei Vergleich beider RIK ähnlich. Durch Anstieg der T/NT-Verhältnisse nahezu aller Proben, konnte in beiden Fällen eine stetige Zunahme der RIK-Anreicherung im Tumor nachgewiesen werden. Das Nicht-Blut/Blut-Verhältnis zeigte ebenfalls sowohl für 131I-CK8 als auch 131I-C215 eine spezifische Anreicherung im Tumor. Das Problem eines relativ hohen Anteils beider RIK in Milz und Leber konnte durch zusätzliche Applikation von unspezifischem CD20-IgG2a verhindert werden, da dieser Effekt unter anderem auf einen Mangel an endogenem IgG2a in SCID-Mäusen zurückzuführen ist. In der Therapiestudie zeigten die Mäuse, denen 15 MBq injiziert worden waren, 24 Tage p.i. ein im Vergleich zum Applikationszeitpunkt relatives Tumorvolumen von 0,38. Bei den Mäusen, die 25 MBq erhalten hatten war an Tag 17 p.i. ein relatives Tumorvolumen von 0,56 zu verzeichnen. Es war also zu einer deutlichen Reduktion des Tumorvolumens um 44 bzw. 62 Prozent gekommen. Dies konnte jedoch nur auf Kosten einer hohen Toxizität erreicht werden. In der Therapiegruppe, die 5 MBq erhalten hatte und in den beiden Kontrollgruppen (NaCl oder unmarkierter Antikörper) war kein antitumoraler Effekt festzustellen. Hier zeigte sich erwartungsgemäß ein exponentielles Tumorwachstum. Die vorliegenden Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Antikörper gegen EpCAM gut geeignet sind für eine radioimmuntherapeutische Behandlung von HNSCC, da die applizierten Antikörper in ausreichender Menge ihr Target, d. h. die Tumorzellen erreichten. Allerdings erwiesen sich die gewählten Dosierungen von 15 und 25 MBq 131I-C215 bei tumortragenden Mäusen als radiotoxisch.

Maligne Erkrankungen sind in den Industrieländern, nach Herz-Kreislauferkrankungen, die zweithäufigste Todesursache. Aufgrund der Erfolge bei der Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird Schätzungen zufolge Krebs in den nächsten Jahren die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern sein. Trotz des klinischen und wissenschaftlichen Fortschritts ist die Prognose der meisten Tumorentitäten unverändert schlecht. Eine der Hauptursachen ist der Mangel an spezifischen Markern, um eine geeignete Frühdiagnostik, Vorsorge und Therapie zu ermöglichen. Biomarker, wie tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene, werden als potente Strukturen diskutiert, Karzinome bereits im Frühstadium zu diagnostizieren und im Rahmen von Therapien als Zielstrukturen eingesetzt zu werden. Seit einigen Jahren werden daher systematische Techniken zur Identifizierung neuer Tumorantigene entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine bestehende Technologie zur Identifizierung von Tumorantigenen weiterentwickelt und optimiert werden. Die in der Arbeitsgruppe etablierte Technik namens AMIDA (Autoantibody-mediated Identification of Antigens) basiert auf der spezifischen Autoantikörper-vermittelten Selektion und Aufreinigung potenzieller Tumorantigene und deren anschließender zweidimensionaler Auftrennung und Isolierung. AMIDA ermöglicht prinzipiell die Identifizierung von Tumorantigenen, die durch posttranslationale Modifikationen immunogen wurden, wobei für die Isolierung das komplette Proteom zur Verfügung steht. Es wurde eine allogene Variante etabliert, welche die Technik unabhängig von autologen Tumorbiopsien macht (allo-AMIDA). Neben der Einführung geeigneter Kontrollen kann allo-AMIDA nun im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Der Vorteil von allo-AMIDA gegenüber AMIDA und anderen Strategien ist, neben der schnellen und reproduzierbaren Durchführung, die nunmehr universelle Einsetzbarkeit der Methode. Zur Identifizierung von Tumorantigenen werden lediglich Seren von Tumorpatienten und eine geeignete Tumorzelllinie benötigt. Allo-AMIDA wurde am Beispiel von Karzinomen des Kopf-Hals-Bereiches eingesetzt und führte zur Identifizierung von insgesamt 12 potenziellen Tumorantigenen. Neun der 12 Tumorantigene wiesen zum Zeitpunkt der Identifizierung eine Assoziation mit Tumoren auf, fünf davon sind etablierte Tumorantigene, was die Eignung von allo-AMIDA zur Identifizierung von TAs beweist. Für die allo-AMIDA-Antigene Grb-2 und Hsp-27 konnte eine starke Expression in Tumorzellen der Kopf-Hals-Entität gezeigt werden. Drei der allo-AMIDA Antigene waren bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen assoziiert. Eines dieser Proteine – hnRNP H (heterogeneous ribonucleoprotein H) – stellte sich als geeigneter Marker für Tumorzellen des Kopf-Hals-Bereiches heraus. Es konnte auf Transkript- und Proteinebene gezeigt werden, dass hnRNP H bereits in hyperplastischem Epithelien vermehrt gebildet wird und mit zunehmender Karzinogenese in den meisten primären Tumoren bzw. Metastasen dieser Tumorentität stark überexprimiert ist. Interessanterweise war diese starke Expression auf Tumorzellen beschränkt. In anderen Tumorentitäten (Kolon-, Pankreas-, Mamma-Karzinom) war hnRNP H ebenfalls stark über-exprimiert, die Expression in humanen nicht-malignen Geweben war sehr heterogen. Da bis dato wenige Informationen über die Funktion dieses nukleären Proteins bekannt sind, wurde hnRNP H detaillierter analysiert. In der Literatur wird diskutiert, dass hnRNP H am alternativen Spleißen von prä-mRNAs bzw. an der Regulation dieses Prozesses beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von hnRNP H durch RNAi zur Apoptose von Tumorzelllinien führt. Mittels Genexpressionanalyse konnten potenzielle Zielgene im Bereich Apoptose identifiziert werden, die von hnRNP H durch alternatives Spleißen reguliert werden. hnRNP H ist an der Regulation des Bcl-X-Gens beteiligt, was von Garneau und Kollegen (2005) kürzlich ebenfalls gezeigt werden konnte. Die Regulation von ARAF1 durch hnRNP H wurde erstmals gezeigt; ein potenzieller Weg, wie die Deregulation von ARAF1 Apoptose induzieren kann, wird vorgeschlagen. Die Validierung der Zielgene von hnRNP H im Kontext von Tumorzellen ist Gegenstand laufender Projekte und weiterer Analysen.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von in der EU-weit geltenden Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 reglementierten Chinolonen. Zur Gewinnung gruppenspezifischer Antikörper wurde Ciprofloxacin-Ethylendiamin an Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) gekoppelt und drei Kaninchen intracutan immunisiert. Nach einer Restimulierung waren bei allen drei Kaninchen spezifische Antikörper nachweisbar. Die zur Erstellung eines direkten und indirekten kompetitiven enzymimmunologischen Nachweisverfahrens notwendigen markierten Antigene wurden durch Kopplung von Ciprofloxacin, Ciprofloxacin-Ethylendiamin, Clinafloxacin sowie Norfloxacin an Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase oder Ovalbumin hergestellt. Dabei kamen verschiedene Kopplungsmethoden (aktive Estermethode, Perjodatmethode und Carbodiimidmethode) zum Einsatz. Mit dem spezifischen Serum eines Tieres wurden verschiedene kompetitive Enzymimmun-testsysteme entwickelt. Von den direkten Enzymimmuntests wies das empfindlichste System eine Nachweisgrenze für Ciprofloxacin von 1,25 ng/ml auf, im indirekten Testsystem lag die untere Nachweisgrenze bei 1,5 ng/ml. Ciprofloxacin konnte somit weit unterhalb des geltenden MRL-Wertes von 100 µg/kg in Milch nachgewiesen werden. Das Antiserum zeigte nur bedingt Gruppenspezifität. Für fünf von 23 überprüften Chinolonen wurden Kreuzreaktionen von > 50 % ermittelt, von den mit einem MRL-Wert belegten Substanzen wurden Danofloxacin, Ciprofloxacin, Enrofloxacin und Oxolinsäure erfasst. Zur Überprüfung der Anwendbarkeit der entwickelten Testsysteme wurden künstlich kontaminierte und gewachsene Milch- und Garnelenproben untersucht, wobei das jeweilige Testsystem an die entsprechende Probenmatrix adaptiert wurde. Die mittlere Wiederfindungsrate lag bei 95,5 %, in keiner der Praxisproben konnten Chinolonrückstände nachgewiesen werden. Weiterhin wurde ein mikrobiologisches Verfahren unter Verwendung von E. coli als Testkeim zum Nachweis für Chinolone entwickelt. Dieser Agardiffusionstest zeichnete sich durch eine hohe Sensitivität und Gruppenspezifität aus. Ciprofloxacin konnte mit einer Nachweisgrenze von 2 ng/ml weit unterhalb des geltenden MRLs nachgewiesen werden, zehn weitere wichtige Chinolone wurden unterhalb von 100 ng/ml erfasst. Dieses System kann somit als nützlicher Kontrolltest verwendet werden.

Die Triomzell-Vakzinierung ist ein neuer, überaus potenter Ansatz in der Immuntherapie maligner Lymphome. Aus A20-Lymphomzellen der Maus wurde durch Fusion mit der Ratten-Hybridomzelllinie 2.4G2 die Triomzelllinie BiV hergestellt. Die entstandenen Triomzellen enthalten potenziell alle Antigene der parentalen Lymphomzellen und zusätzlich die anti-Fcγ-Rezeptor-Spezifität des Hybridoms. Die Präsentation der Tumorantigene wird somit durch Redirektion gegen internalisierende Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) ermöglicht. Durch Triom-Immunisierung konnte nicht nur ein Langzeit-Tumorschutz in Mäusen vermittelt werden, sondern es wurden sogar etablierte Tumoren abgestoßen. Der Tumorschutz wird dabei über CD4+ und CD8+ T-Zellen vermittelt, die humorale Immunantwort spielt nur eine untergeordnete Rolle. Mehrfach in vitro restimulierte und adoptiv transferierte T-Zellen aus immunisierten Mäusen waren im Gegensatz zu identisch behandelten T-Zellen aus naiven Mäusen tumorprotektiv. Das war insofern erstaunlich, als beide T-Zellpopulationen in vitro den gleichen A20-spezifischen Aktivierungszustand zeigten. Ein eingeschränktes T-Zell-Rezeptor-(TZR-) Repertoire von in vitro restimulierten T-Zellen aus immunisierten Mäusen korrelierte mit dem Tumorschutz. Restimulierte T-Zellen aus naiven Mäusen zeigten hingegen keine Einschränkung im TZR-Repertoire. Durch die Immunisierung der Mäuse erfolgt offensichtlich eine In-vivo-Aktivierung, die sich durch In-vitro-Stimulationen nicht nachstellen lässt.

Leukämische Blasten bei AML können ex vivo in DC umgewandelt werden, wodurch Anti-gen-präsentierende Zellen entstehen, welche leukämische Antigene präsentieren. Im kleineren Rahmen sollten zunächst Daten zu methodischen Vorversuchen ausgewertet werden, um bei AML und MDS unter serumfreien Bedingungen DC zu generieren. Diese me-thodischen Vorversuche an 50 AML-, 24 MDS-Patienten und 23 gesunden Probanden erga-ben, dass adhärente Zellfraktionen die DC-Ausbeute im Vergleich zu totalen MNC-Fraktionen nicht verbessern, dass bei MACS-depletierten `MNC(-)`- und aufgetauten MNC-Fraktionen niedrigere DC-Zahlen erreicht werden, und dass die DC-Ernte bei AML- und MDS-Patienten nach 10-14tägiger Kulturzeit, bei gesunden Probanden jedoch nach 7tägiger Kulturzeit höher ist. Außerdem zeigte sich, dass die Zugabe von FL die DC-Ernte erhöht, der Einsatz von autologem Plasma dagegen in vielen Fällen einen inhibitorischen Effekt auf die DC-Generierung hat. Die Kulturmedien CellGro und Xvivo erzielten vergleichbare DC-Ausbeuten. Nach Ermittlung der optimalen Zellfraktion, Kulturdauer und –zusätze, wurden serumfreie DC von 100 AML-, 55 MDS- und 38 gesunden Proben in einem 10-14-tägigem serumfreien Xvivo-Kultursystem mit GM-CSF, IL-4, FL und TNFα angezüchtet und charak-terisiert. Bei der DC-Generierung unter standardisierten Bedingungen betrug die Ausbeute der MNC-Fraktionen durchschnittlich 20% bei MDS, 34% bei AML und 25% bei gesunden Probanden. Zwischen 53-58% der DC waren reife CD83+DC. Die DC-Ernten waren in den monozytären FAB-Klassen (AML-M4/5, MDS-CMML) am höchsten, dagegen unabhängig von den zyto-genetischen Risikogruppen. Das Oberflächenmarkerprofil der DC von den AML- und MDS-Proben (einschließlich 1 MDS- und 3 AML-Zelllinien) war mit dem der gesunden DC ver-gleichbar. In parallelen Kulturansätzen konnte außerdem gezeigt werden, dass in einem `MCM-Mimic`-Medium mit PGE2 der Anteil reifer, CCR7+DC besonders hoch war. Der leu-kämische Ursprung der AML- und MDS-DC wurde bei 5 AML- und 4 MDS-Fällen mittels FISH durch die Persistenz klonaler, zytogenetischer Aberrationen in den DC oder in übrigen Fällen durch die Coexpression leukämischer Antigene auf den DC bewiesen. Durch eine kombinierte FISH/Immunophänotyp-Analyse (FISH-IPA) konnte zudem nachgewiesen wer-den, dass obige klonale, numerische Aberrationen konstant in Kombination mit DC-Markern detektierbar, jedoch nicht alle klonalen Zellen zu leukämischen DC umwandelbar waren (durchschnittlich 53% der AML- und MDS-Blasten). Umgekehrt trugen auch nicht alle gene-rierten DC die klonale Aberration (im Durchschnitt 51% der DC). In 41 AML-Fällen mit ei-ner Leukämie-spezifischen bzw. aberranten Antigenexpression oder in AML-Fällen mit ei-nem CD33+ Blastenphänotyp und gleichzeitig

Die bisherige Analyse der mini-LCL-stimulierten T-Zelllinien konzentrierte sich hauptsächlich auf die zytotoxischen CD8+ T-Zellen. Klinische Studien haben aber gezeigt, dass für eine lang anhaltende Immunität nach Stammzelltransplantation (SCT) der adoptive Transfer von CMV-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen wichtig ist. Neuere Studien unterstreichen die Rolle der CD4+ T-Zellen bei der Etablierung eines funktionierenden CD8+ T-Zellgedächtnis. Darüber hinaus wirken CD4+ T-Zellen antiviral durch die Sekretion von Zytokinen, wie IFN-g und TNF-a, und können ebenfalls zytotoxisch aktiv gegen Virus-befallene Zellen werden. Die vorliegende Arbeit sollte untersuchen, ob das mini-EBV-System geeignet ist T-Zellen zu generieren, die viele verschiedene CMV-Epitope - durch MHC-Klasse-I- und -II-Moleküle präsentiert - erkennen. T-Zellkulturen von Spendern mit unterschiedlichen HLA-Typen sollten etabliert und analysiert werden. Dabei stand eine eingehende Analyse der Epitop-Spezifitäten der generierten T-Zellen im Vordergrund. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob sich mLCLs zur Primärstimulation von naiven T-Zellen eignen. Da neben pp65 auch IE1 ein weiteres wichtiges CMV-Antigen darstellt, sollten zwei neue mEBV-Plasmide konstruiert werden, damit auch Spender erreicht werden können, die keine ausgeprägte Immunantwort gegen pp65 besitzen. Es gibt nur wenige gesunde Seropositive, die keine Immunität gegen zumindest eines dieser beiden Antigene besitzen. Ein Vektor sollte eine Expressionskassette für IE1 enthalten, der zweite eine Kassette für ein Fusionsprotein bestehend auch pp65 und IE1 (pp65_IE1). Mit Hilfe der generierten IE1-mLCLs und pp65_IE1-mLCLs sollten autologe T-Zellen stimuliert und ihre Eigenschaften eingehend charakterisiert werden.

Monoklonale Antikörper sind unverzichtbare Hilfsmittel, um Proteinkomplexe aus Zellen zu isolieren oder Proteine in Gewebeschnitten zu lokalisieren. Sie dienen auch dazu, Entwicklungsvorgänge aufzuklären. Dabei wird als Modellorganismus für Vertebraten oft der Zebrafisch gewählt, da er sich asaisonal vermehrt, eine zahlreiche Nachkommenschaft hat und sowohl die Befruchtung als auch die Entwicklung außerhalb des Mutterleibs erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper generiert, die spezifisch mit neuronalen Geweben und Organen des Zebrafisches reagieren. Zur Immunisierung wurde Gehirngewebe des Zebrafisches verwendet. Immunisiert wurden Ratten. Antikörperbildende B-Zellen aus der Ratte wurden mit einer Mausmyelom-Zelllinie fusioniert. Proteine von Interesse wurden mit Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des Zebrafisch-Gehirns immunpräzipitiert und durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die durch Antikörper detektierbaren Banden wurden ausgeschnitten und die enthaltenen Proteine mit massenspektrometrischen Techniken identifiziert. In einem weiteren Ansatz diente eine in λ-Phagen einklonierte Genbank der Expression der Proteine. Die Proteine wurden ebenfalls mit monoklonalen Antikörpern identifiziert. Die Phagen, die diese Proteine produzierten, wurden vermehrt und die für das Protein kodierende DNA sequenziert. Wir haben unsere Anstrengungen vor allem auf Proteine neuronalen Ursprungs konzentriert, weil diese Strukturen in den Fischen besonders deutlich markiert wurden. Histologische Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass die Antikörper mit neuronalen Strukturen vieler Spezies reagierten, was auf eine hohe Konservierung der Proteine in der Phylogenese schließen lässt. Aus drei Fusionen mit Milzzellen von immunisierten Ratten wurden 2400 Zellüberstände erzeugt, die auf ihre Immunglobulin-Subklasse getestet wurden. IgG-positive Überstände wurden auf histologischen Schnitten untersucht. Schließlich wurden 17 Klone etabliert, die mit Nervengewebe des Zebrafisches reagierten, und weitere 9 Klone, die sowohl mit neuronalen Zellen des Zebrafisches als auch mit neuronalem Gewebe anderer Spezies reagierten. Die von den einzelnen Antikörpern erkannten Proteine wurden entweder massenspektrometrisch oder mittels einer Expressionsgenbank, die aus drei Tage alten Zebrafischlarven hergestellt wurde, identifiziert. Es wurden Antikörper gegen folgende Proteine gefunden: 1. Tenascin R 2. Plasticin 3. TOPAP 4. VAT-1 Es wurden 16 monoklonale Antikörper, die gegen fünf verschiedene humane Antigene hergestellt worden waren, auf Kreuzreaktivität mit Zebrafischgehirn getestet. Die Antikörper reagierten sowohl mit dem Hirn des Zebrafisches als auch mit dem Hirn acht verschiedener Säugerspezies. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Versuch unternommen, gezielt gegen ein Fusionskonstrukt, das Teile des humanen Parkins enthielt, monoklonale Antikörper herzustellen. Aus vier Fusionen wurden nur drei spezifisch mit dem Antigen reagierende Antikörper selektiert, die auch im Western-Blot mit Parkin reagierten. In vivo wurde das Antigen in histologischen Schnitten jedoch nicht erkannt.

Adhäsionsvorgänge von Leukozyten spielen eine wichtige Rolle bei den verschiedensten biologischen Prozessen. Die Adhäsionsinteraktionen können Signalkaskaden aktivieren, die Funktionen wie die Zellmigration, Proliferation und Reifung von T-Lymphozyten steuern. Die Zellen des Immunsystems müssen schnell auf körperfremde Eindringlinge reagieren können und Adhäsionsvorgänge zwischen Zellen bzw. zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix effektiv regulieren. Um jeden Infektionsherd im Körper zu erreichen, benutzen die Immunzellen die Lymph- und Blutbahnen, können diese Systeme aber verlassen (Diapedese) und durch Gewebe migrieren. Am Infektionsort interagieren die Immunzellen mit infizierten Zellen und starten Vernichtungsprogramme. Weiterhin präsentieren antigenpräsentierende Zellen im Lymphknoten ihre Antigene vorbeiziehenden T-Zellen, die bei korrekter Antigenerkennung zu T-Effektorzellen proliferieren. Bei all diesen regulierten Adhäsionsreaktionen spielen besonders die Integrine eine große Rolle. Von besonderem Interesse ist hierbei das Heterodimer LFA-1 (CD11a/CD18). LFA-1 wird nur auf Leukozyten exprimiert und bindet an die Liganden ICAM-1,-2,-3 der Immunglobulinsuperfamilie. Die kontrollierte Adhäsion bzw. Deadhäsion von Leukozyten bedarf einer spezifischen Regulation des LFA-1-Integrins und die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge ist von großem Interesse. Die LFA-1-vermittelte Zelladhäsion kann über den intrazellulären Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Cytohesin-1 aktiviert werden. Die Aktivierung wird dabei u.a. über Inositid-abhängige Membranrekrutierung von Cytohesin-1 kontrolliert. In dieser Arbeit wurde ein mit Cytohesin-1 interagierendes Protein, CYTIP, identifiziert, welches durch Cytokine in hämatopoetischen Zellen vermehrt exprimiert wird. CYTIP interagiert über seine „coiled-coil“-Proteininteraktionsdomäne direkt mit der N-terminalen „coiled-coil“-Domäne von Cytohesin-1 und inhibiert vollständig die Zelladhäsion auf Integrinliganden. Aufgrund der zwei Proteininteraktionselemente („coiled-coil“-Domäne, PDZ-Domäne) stellt CYTIP ein Adaptermolekül dar, um verschiedene Signalkomponenten in einem Multiproteinkomplex zu koppeln. CYTIP (Cytohesin-1 interacting protein) stellt eine neue Molekülklasse dar, die durch direkte Interaktion mit Cytohesin-1 die LFA-1 vermittelte Zelladhäsion negativ regulieren kann.

Im Rahmen einer retrospektiven klinischen Studie wurde die allergen-spezifische Immuntherapie zur Behandlung der CAD und FAD untersucht. Die Ermittlung der Erfolgsrate der beschriebenen Therapie basiert auf der Behand-lung von 117 Hunden. Diesen war über einen Zeitraum von mindestens zwölf Mona-ten eine wässrige Allergenextraktlösung subkutan injiziert worden. In 86 Fällen basierten die Lösungen auf intrakutanen Hauttests, in 27 Fällen auf allergenspezifischen IgE-Serumtests und in vier Fällen auf einer Kombination beider Verfahren. Die Pilzallergenextrakte wurden von den anderen Allergenen getrennt gelagert und injiziert. Dieses Vorgehen beruhte auf Berichten, nach denen proteolytische Enzyme dieser Extrakte die biologische Aktivität von Pollenallergenen reduzieren. Achtzehn Hunde (15,4 %) zeigten exzellente Behandlungsresultate. Bei 57 Hunden (48,7 %) war ein guter Erfolg festzustellen. Eine leichte Besserung trat bei 24 Patien-ten (20,5 %) ein, während die Therapie bei 18 Hunden (15,4 %) nicht von Nutzen war. Die Separierung der Pilzallergene führte zu einer deutlichen Steigerung der Erfolgsraten in der Gruppe der Pilzallergiker im Vergleich zu einer früheren Studie mit identi-schen Allergenen in derselben Praxis, welche keine Trennung dieser Komponente vorgenommen hatte. Das vorliegende Ergebnis deutet darauf hin, dass proteolytische Aktivitäten von Pilzallergenen eine für die Immuntherapie relevante Auswirkung auf die allergenen Eigenschaften anderer Antigene besitzen und durch eine getrennte La-gerung verhindert werden können. So ließen sich hinsichtlich der Allergenart bei Pollen, Milben und Pilzen keine Unterschiede in den Erfolgsraten erkennen. Die beobachteten Parameter wie Alter bei Allergiebeginn, Alter bei Immuntherapiebeginn, Zeitdauer bis Immuntherapiebeginn, Allergenanzahl und der Testlösung zugrunde liegender Testtyp (Serumtest auf allergenspezifisches IgE oder intrakutaner Hauttest) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Erfolgsquote. Ein Erfolg der Immuntherapie zeigte sich auch an der deutlichen Reduktion der Kor-tisondosis und der verminderten Anzahl der Patienten, die diese Art der Medikation noch benötigten. Die durchschnittliche Dauer bis zum Erkennen erster klinischer Besserung lag bei zwei bis fünf Monaten. Die Behandlung der FAD durch Immuntherapie sowie andere Therapieformen wird am Beispiel von vier Katzen erörtert, bei denen eine Immuntherapie durchgeführt wurde. Die Diagnose der atopischen Dermatitis wurde nach Möglichkeit durch Ausschluss relevanter Differentialdiagnosen gestellt. Zur Allergenidentifizierung wurde der bei der Katze schwieriger als beim Hund zu bewertende und auszuführende Intrakutantest verwendet. Erfahrungen in der Literatur berichten über ähnliche Erfolge von Immuntherapien, die auf Serumtests auf allergenspezifisches IgE beruhen. Bei zwei Tieren kam es zu einer deutlichen Besserung der Erkrankung, während die Immuntherapie bei den beiden anderen nach acht und zehn Wochen abgebrochen wurde, nachdem sich die Symptomatik nicht gebessert hatte. In den beiden nicht auf die Immuntherapie ansprechenden Fällen konnte eine Futtermittelallergie nicht kom-plett ausgeschlossen werden. Aber auch die deutlich unter zwölf Monaten liegende Therapiezeit erschwert die Einschätzung dieser beiden Fälle. Die individuelle Anpassung des Protokolls durch eine Dosisreduktion und Intervallverkürzung bei einer der erfolgreich therapierten Katzen und die Intervallverlänge-rung bei dem anderen Tier macht die Relevanz dieses Aspektes deutlich. Ein Vergleich mit anderen Studien zeigte, dass bei Erfolgsraten von 50 bis 75 % die Immuntherapie eine sinnvolle Alternative zur Behandlung mit Kortison ist. Im Gegensatz zu anderen Behandlungen wie der oralen Gabe von Antihistaminika oder Fettsäuren, denen eine höhere Wirksamkeit als beim Hund zugeschrieben wird, stellt der Weg der Injektion häufig eine attraktive Alternative zu den täglichen - und häufig schlecht akzeptierten - Tablettengaben dar.

Fragestellung: Die klinische Herz-Xenotransplantation scheint aufgrund vielfältiger wissenschaftlicher Fort-schritte wahrscheinlicher zu werden, jedoch könnten präformierte natürliche Antikörper, die ohne vorausgegangene Sensibilisierung im Blut vorhanden sind und Antigene fremder Spezies erkennen, auch bei therapeutischer Bewältigung der initialen hyperakuten Abstoßungsreaktion zur anhaltenden Transplantatdysfunktion führen. Tage bis Wochen nach Antigenerstkontakt käme es im xenogenen System zusätzlich zur Bildung induzierter Antikörper, die gegen das Fremdgewebe gerichtet sind. Ziel der vorliegenden Arbeit ist, an spontan kontrahierenden Kardiomyozyten das Wirkungs-profil präformierter natürlicher Antikörpern im Vergleich mit induzierten Antikörpern (durch Verimpfung von Rattenherzgewebe oder Rattenherzzellen in Kaninchen gewonnen) zu unter-suchen. Methodik: Zu Kulturen spontan kontrahierender, neonataler Rattenkardiomyozyten werden Seren zuge-geben, die präformierte oder induzierte Antikörper enthalten (dialysierte, Elektrolyt-, pH-, thermoäquilibrierte, mit Medium verdünnte Seren). Im Vergleich zu den nativen Seren wer-den dieselben Seren nach Entfernung der xenoreaktiven Antikörper aus den Seren (messbar durch den Hämagglutinationstiter gegen Rattenerythrozyten) und/oder Inaktivierung der Komplementkomponenten untersucht. Zum Einsatz kommt einerseits humanes Serum mit ei-nem hohen Gehalt an präformierten xenoreaktiven Antikörpern; Spenderserum wird hierbei im Vergleich mit kommerziell erhältlichen Humanimmunglobulinpräparationen eingesetzt. Andererseits wird Serum mit einem hohen Gehalt an spezifischen induzierten Antikörpern gegen Rattenherzepitope in den Inkubationsexperimenten verwandt. Das Serum wurde nach Verimpfung von Rattenherzgewebe oder Rattenherzzellen in Kaninchen gewonnen. Die Kontraktionen werden über ein Phasenkontrastmikroskop mittels eines photoelektrischen Systems registriert und videotechnisch dokumentiert. Als Parameter der Kontraktilität dienen die Frequenz, Amplitude und Kontraktions-/Relaxationsgeschwindigkeit. Das Ausmaß der synzytialen Kopplung im Zellverband wird als Streuung der Kontraktionsfrequenzen (Variati-onskoeffizienten, Tests nach Hartley, Mann-Whitney und Cochran, Scatterdiagramme) ermit-telt. Als Zytotoxizitätsparameter werden der zelluläre Gehalt an Kalium und Protein sowie an energiereichen Phosphaten, die Trypanblauaufnahme und die elektronenmikroskopisch er-fassbare Ultrastruktur bestimmt. Der Nitritgehalt des Kulturüberstands als Endprodukt des Stickoxidmetabolismus fungiert als ein Maß für die Zellaktivierung. Ergebnisse: (1) Spontane Zellkontraktionen neonataler Rattenkardiomyozyten kommen nach Gabe von Seren mit präformierten natürlichen Antikörpern - einem stereotypen, reproduzierbaren Mus-ter eines geänderten Schlagverhaltens folgend - zu einem passageren Stillstand, der über eini-ge Minuten anhält und spontan reversibel ist. Die Kontraktionen bleiben anschließend über Stunden desynchronisiert in Gegenwart der präformierten natürlichen Antikörper im Sinne einer Entkopplung des funktionellen Synzytiums der Zellmonolayer; dabei bleiben die Kardi-omyozyten vital, jedoch kommt es zu einer Zellaktivierung, kenntlich an einer vermehrter zel-lulären Nitritproduktion. Absorption der spezifisch gegen Rattenepitope gerichteten xenoreak-tiven Antikörper, nicht aber Dekomplementierung der Seren verhindert die Desynchronisati-on. (2) Seren mit induzierten Antikörpern führen dagegen zeit- und konzentrationsabhängig zur Zytotoxizität bis zum Zelltod der neonatalen Rattenkardiomyozyten. Hierfür sind sowohl Komplementkomponenten als auch induzierte xenoreaktive Antikörper erforderlich. Schlussfolgerungen: Präformierte natürliche Antikörper könnten in vivo eine Dysfunktion xenogener Herztrans-plantate im Sinne einer fehlenden synzytialen Koordination der Kardiomyozyten auslösen. Induzierte Antikörper haben eine zytotoxische Wirkung, die die Zellintegrität gefährdet.

Fragestellung: Um mögliche proinflammatorische Zeichen bzw. Frühindikatoren (sog. Mikroinflammation) bei Patienten mit chronischem Nierenversagen und nierentransplantierten Patienten aufzuspüren, die an späteren Organkomplikationen (chronische Transplantatdysfunktion, Herz-Kreislaufmorbidität, endotheliale Dysfunktion, Infektanfälligkeiten) beteiligt sein können, untersuchten wir die Expression funktioneller monozytärer Oberflächenantigene. Als immunologischen Marker der Aktivität einer Entzündungsreaktion verglichen wir die in der Durchflusszytometrie (fluorescence-activated cell sorter (FACS))gemessene Expression sog. mCD14-Rezeptoren und der CD14+CD16++-Rezeptoren auf peripheren Blut-Monozyten mit serologischen Parametern wie C-reaktives Protein und Leukozytenzahl. Die Frage, ob die beiden Oberflächenantigene CD14 und CD16 sowie die Koexpression beider Antigene (proinflammatorisch aktivierte Monozyten) zum „immunologischen Monitoring“ geeignet sind, sollte erstmalig klinisch an Gesunden, Patienten nach Nierentransplantation sowie Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium ohne Dialysebehandlung untersucht werden. Ergänzend wurden nichtorgantransplantierte Patienten mit akuten infektiösen Komplikationen auf mögliche Modulationen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+/CD16++-Zellen) hin untersucht. CD14 existiert membrangebunden (mCD14) und in löslicher Form (sCD14) und ist verantwortlich für die Interaktion von Endotoxin (LPS) mit Monozyten und Neutrophilen. LPS ist ein Glykoprotein der äußeren Membranschicht gramnegativer Bakterien. CD14 ist der wichtigste Rezeptor für gram-negative bakterielle Lipopolysaccharide (Endotoxin), jedoch auch für Peptidoglykan und Lipoteichonsäure gram-positiver Erreger. CD 16 ist der funktionell wichtige Fcγ–Rezeptor Typ III (FcγRIII, IgG-Rezeptor Typ III), der mit niedriger Affinität monomeres IgG sowie polymeres IgG oder Immunkomplexe bindet. Er vermittelt wichtige immunphysiologische Funktionen wie antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, Beseitigung zirkulierender Immunkomplexe, Superoxidbildung und ist auch an der Signaltransduktion beteiligt. Die untersuchten CD14+CD16++-Monozyten bewirken im Zusammenwirken von TNFα, IL-1, IL-6 und IL-10 bewirkt eine stärkere Entzündungsreaktion als die konventionellen CD14++CD16negativen-Zellen; sie sind sehr potente Antigen-präsentierende Zellen, besitzen eine hohe Phagozytoseaktivität und verstärken die endotheliale Adhäsion. Untersuchungsaufbau: Wir untersuchten 69 Patienten nach Nierentransplantation (23 Frauen, 46 Männer) im Alter von durchschnittlich 52,63 +/- 11,42 Jahren (Median 53,84 Jahre). Die Patienten erhielten durchschnittlich vor 6,38 +/- 5,2 Jahren ein Nieren- Transplantat (Median 8,16 Jahre). Wir unterschieden diese Patienten hinsichtlich ihrer Immunsuppression in folgende Gruppen: 1) Mycophenolat-Mofetil-Monotherapie (MMFmono), 2) Cyclosporin-Monotherapie (CyAmono) und 3) einer Kombination aus MMF und CyA (MMF-CyAkombi). In die Gruppe mit MMF-Monotherapie wurden16 Personen eingeschlossen (3 Frauen, 13 Männer) im Alter von durchschnittlich 51,29 +/- 10,47 Jahren (Median 51,15 Jahre). In der Gruppe der CyA-monotherapierten Patienten befanden sich 11 Personen (3 Frauen, 8 Männer) im Durchschnittsalter von 58,43 +/- 8,01 Jahren (Median 59,96 Jahre). Zur Gruppe der MMF-CyA-kombinationstherapierten Patienten gehörten 18 Patienten (3 Frauen, 15 Männer) im Alter von 46,69 +/- 10,22 Jahren (Median 47,44 Jahre). Des weiteren wurden 13 Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (12 Männer, eine Frau) im Alter von 32 bis 74 Jahren (Median 65,0 Jahre; Mittelwert 63,5 Jahre +/- 10,3 Jahre) in die Analysen miteinbezogen. Parallel wurden 8 Patienten (6 Frauen, 2 Männer) im Verlauf einer akuten Infektion erfasst (Mittelwert 74,6 +/- 10,53 Jahre; Median 78 Jahre). Unser Kontrollkollektiv bestand aus 18 klinisch gesunden freiwilligen Probanden im Alter zwischen 24 und 54 Jahren (Median 31Jahre; Mittelwert 33,42 +/- 9,91 Jahre; 10 Frauen, 8 Männer). Ergebnisse: 1. Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz hatten signifikant höhere CRP-Serumkonzentrationen als Gesunde (p=0,010)(Gesunde 0,33 mg/dl vs. Urämiker 0,7 mg/dl). 2. Die mCD14-Expression auf peripheren Blutmonozyten war bei Urämikern (p=0,024) und bei nierentransplantierten Patienten (p=0,026) signifikant niedriger als bei Gesunden.(Gesunde 517 MFI vs. Urämiker 426 MFI vs. NTX 433 MFI) 3. Der prozentuale Anteil CD14+CD16++-Monozyten im Blut war sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (p=0,00000487; MFI= 13,0%) als auch bei Patienten nach Nierentransplantation (p=0,00298; MFI=9,3%) signifikant höher. 4. Die Leukozytenzahl im Blut war weder bei immunsupprimierten Nierentransplantierten noch bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium signifikant gegenüber Gesunden verändert. 5. Hinsichtlich der verschiedenen Strategien der immunsuppressiven Therapie ließen sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen der MMF-mono, der CyA-mono und der MMF-CyA-kombi-behandelten Nt-Patienten feststellen. 6. Die Absolutzahl CD14+CD16++-Monozyten war sowohl bei urämischen Patienten (p=0,003; 430/µl) als auch bei nierentransplantierten Patienten (p=0,005; 413/µl) gegenüber Gesunden signifikant erhöht. 7. Bei Nierentransplantierten fiel die CRP-Konzentration im Serum mit steigendem Alter des Transplantates logarithmisch ab (p=0,065), die mCD14-Expression fiel linear ab (p=0,063) wohingegen der prozentuale Anteil der CD14+CD16++- Monozyten invers ansteigt (p=0,0036). 8. Im Verlauf akuter infektiöser Erkrankungen war der Anteil der CD14+CD16++- Monozyten signifikant höher als bei Gesunden (p=0,000049) und fiel bis zur stationären Entlassung so signifikant ab (p=0,012), so dass kein Unterschied mehr zwischen Gesunden und Kranken mehr nachweisbar war. Schlußfolgerungen: 1. Sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz wie bei Nierentransplantierten finden sich anhand erhöhter Zahlen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+CD16++-Phänotyp) eindeutig Zeichen einer sog. „Mikroinflammation“; dies ausdrücklich auch bei NTX-Patienten, obwohl diese unter einer dauerhaften immunsuppressiven Behandlung stehen. 2. Proinflammatorische Blutmonozyten sind Ziel- und Effektorzellen der Immunabwehr. Darüber hinaus sind sie pathophysiologisch an den Vorgängen einer Atheromatose beteiligt. CD14+CD16++-Blutmonozyten entsprechen dem Phänotyp von Gewebsmakrophagen. Erhöhte Anteile CD14+CD16++-Blutmonozyten gehen möglicherweise parallel mit der erhöhten Progressionsrate der Atheromatose von Organtransplantierten und Patienten mit Niereninsuffizienz. Andererseits sind sie an der Auslösung und Perpetuation der chronischen Transplantatdysfunktion (chronisches Transplantatversagen) ursächlich beteiligt, was aus Biopsiedaten hervorgeht. Die hier erfolgten Blutzellanalysen unterstützen diese These. 3. Dauerimmunsuppression bei Nierentransplantierten vermag nicht den proinflammatorischen Status diese Patienten zu unterdrücken. Damit gilt für alle NTXPatienten, dass sich mehr oder weniger schnell trotz potenter Immunsuppression irgendwann ein Transplantatversagen einstellt. Es spricht alles dafür, dass aktivierte Blutmonozyten hier die Schlüsselrolle spielen. Wir postulieren, dass dies nur dann abgeschwächt oder vermindert werden könnte, wenn sich die zellulären Marker, die auf chronische inflammatorische Aktivität hinweisen, pharmakologisch günstig beeinflussen ließen.