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Im Rahmen dieser Dissertation wurde der potentielle Einfluss des endothelialen hyperpolarisierenden Faktors (EDHF) auf Thrombozyten untersucht und geprüft, ob die EDHF Wirkungen durch eine (oder mehrere) Epoxyeicosatriensäuren (Produkte der endothelialen CYP450 Monooxygenase) ausgelöst sein könnten. EDHF wurde bisher hauptsächlich, neben NO und Prostazyklin, als dritter funktionell bedeutender vom Endothel gebildeter vasodilatierender Faktor charakterisiert. Für NO und Prostazyklin ist vielfach eine Freisetzung in das Gefäßlumen und damit neben der lokalen dilatierenden Wirkung auch eine Beeinflussung zirkulierender Blutbestandteile, wie Thrombozyten beschrieben. Beide können die thrombozytäre Aktivierung und Aggregation effektiv hemmen und dadurch gefäßprotektive Wirkungen ausüben. Ob EDHF ebenfalls Blutbestandteile wie Thrombozyten beein-flussen kann, war die Hauptfragestellung dieser Arbeit. Wir konnten erstmals im Bioassay zeigen, dass kultivierte menschliche Endothelzellen (HUVEC) nach entsprechender Stimulation einen EDHF freisetzen, der Thrombozyten hyperpolarisiert. Weiterhin konnten wir nachweisen, dass dieser Faktor die thrombozytäre Adhäsion an Endothelzellen sowie die thrombozytäre Aktivierung (P-Selektin Expression) hemmte. Diese Effekte waren - analog zu den hyper-polarisierenden Effekten - vermittelt durch Aktivierung von Calcium aktivierbaren Kalium-Kanälen (KCa-Kanäle) mit großer (BKCa) und mittlerer (IKCa) Leitfähigkeit, nicht jedoch von denen mit geringerer (SKCa) Leitfähigkeit. Die beobachteten Hemmeffekte waren durch die EDHF Wirkungen auf das thrombozytäre Membranpotential erklärbar, ein zusätzlicher ergänzender membranpotentialunabhängiger Effekt konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden. Der in unserem Bioassay nachweisbare EDHF zeigte ähnliche Eigenschaften wie exogen verabreichte Epoxyeicosatriensäuren (EETs) - Produkte, die durch die Cytochrom P450 2C8/9 Oxidase im Endothel aus Arachidonsäure gebildet werden. Erhärtet wurden diese Befunde durch eine CYP2C9 stabil überexprimierende Zellinie mit endothelialen Eigenschaften, welche verschiedene EETs in physiologischen Konzen-trationen freisetzte und deren Überstand ähnliche hyperpolarisierende und antiadhäsive Effekte auf Thrombozyten wie der EDHF hatte. EDHF stellte somit unter unseren experimentellen Bedingungen eine Epoxyeicosa-triensäure (oder eine Mischung verschiedener EETs) dar. Bei vielen Herz-Kreislauf Erkrankungen spielen thrombozytäre Aktivierung und Adhäsion eine wichtige Rolle. Insbesondere beim akuten Herzinfarkt, der Haupttodesursache in westlichen Industrieländern, kommt es in patho-physiologisch, z.B. durch Atherosklerose, vorgeschädigten Gefäßen, aufgrund einer arteriellen Thrombusbildung zum kompletten Gefäß-verschluss mit Myokardischämie. Daher könnte EDHF bzw. EET - infolge seiner thrombozytenhyperpolarisierenden und antiadhäsiven Effekte - von großer Bedeutung sein, vor allem, wenn er durch Risikofaktoren wie freie Sauerstoffradikale und Hyperlipidämie weniger stark beeinflusst würde als NO. Die Daten dieser Dissertation könnten somit zukünftiger Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen sowie Basis für die Entwicklung potentiell gefäßprotektiver Medikamente zur effektiveren Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen darstellen.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

In der vorgelegten Dissertation wurde die Rolle des onkogenen Transkriptionsfaktors c-Myc für eine schnelle Zellzyklusprogression untersucht. Der Stand der Forschung zu Beginn der Arbeit legte nahe, dass ohne die Expression von c-Myc eine Zelle nur verzögert den Teilungszyklus durchlaufen kann (Mateyak et al., 1997). Mit Hilfe eines neuen Experimentansatzes konnte gezeigt werden, dass diese Beobachtung korrigiert werden muss. Die Analyse der Zellzyklusprogression von einzelnen Zellen mit Hilfe von Zeitrafferfilmen ergab, dass c-myc-/- Zellen in gleicher Zeit die Teilung durchführen wie c-myc+/+ Zellen. Das Aufstellen von Stammbäumen zu den einzelnen Zellen ebnete den Weg zu einer umfassenden statistischen Auswertung. Mit der Kaplan-Meier Methode gelang eine detaillierte Beschreibung des beobachteten Sachverhaltes. c-myc-/- und c-myc+/+ Zellkulturen unterschieden sich vor allem in ihrer Teilungswahrscheinlichkeit und nicht in der Zellzyklusdauer der einzelnen Zellen. In Abwesenheit von c-Myc-Expression wurde ein großer Teil der Zellen nach erfolgter Teilung inaktiv. Der Anteil teilungsinaktiver Zellen akkumuliert und ließ die Gesamtzahl der Population deutlich langsamer ansteigen. Dieses Ergebnis konnte durch die Generierung einer neuen Zellinie weiter untermauert werden. Die Expression eines MycER Fusionsproteins in c-myc-/- Zellen (Smoxi-4) ermöglichte die wahlweise Aktivierung des MycER Proteins durch Zugabe von Tamoxifen (4-OHT). Eine unmittelbare Untersuchung der Auswirkung von c-Myc-Aktivität in einer einzigen Zellinie war dadurch möglich. Zeitrafferfilme und deren Auswertung bestätigten die bereits gemachten Ergebnisse. Durch die Verwendung der publizierten Osteosarkomzellinie M47 (Gehring et al., 2000) konnten die Beobachtung weiter verallgemeinert werden. In diesen Zellen ließ sich die Expression des c-Myc-antagonistisch wirkenden Transkriptionsfaktors Mad1 durch Zugabe von Tetrazyklin steuern. Der Antagonist Mad1 senkte vor allem die Teilungswahrscheinlichkeit der Zellen. Zusammenfassend ergibt sich daraus der Vorschlag eines neuen Modells. Die Expression von c-Myc in einer Zelle beeinflusst vor allem die Entscheidung, ob sie in einen weiteren Zellzyklus eintritt oder nicht. Der Geschwindigkeit der Zellzyklusprogression kommt dabei nur eine untergeordnete Rolle zu. Diese Beobachtung unterstreicht die Bedeutung von Restriktionspunkten und Aktivierungsschwellen bei der Kontrolle der Zellteilung durch c-Myc. Die erhöhte Apoptose- und Mitoserate von Smoxi-4 Zellen zeigte auf anschauliche Weise, wie durch eine einzige onkogene Läsion (c-Myc) die Entstehung weiterer Mutationen begünstigt werden kann.