Podcasts about b zelllinien

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von Mutanten den Einfluss der Proteine BALF1, BHRF1 und LMP2A von Epstein-Barr Virus (EBV) auf die B-Zell-Immortalisierung zu bestimmen. Diese EBV Mutanten bilden die Grundlage zur Funktionsanalyse der Genprodukte in infizierten humanen B-Zellen, die durch die Infektion mit EBV als stabile B-Zelllinien in vitro proliferieren und latent, d.h. ohne Virus zu produzieren, mit EBV infiziert sind. Die Einzeldeletionen von BALF1 oder BHRF1 im Genom von EBV zeigen keinen Einfluss auf die Effizienz, mit der solche B-Zelllinien entstehen. Die in beiden Genen deletierte Mutante ist dagegen nicht mehr in der Lage, die Proliferation von BLymphozyten zu induzieren. Eine LMP2A Deletionsmutante ist gegenüber Wildtyp EBV in dieser Eigenschaft deutlich beeinträchtigt. LMP2A induziert in frisch infizierten B-Lymphozyten die Expression von EBV Genen, die nicht zur Gruppe der latenten Genprodukte gehören, sondern nur während der Virusproduktion transkribiert werden. Allerdings werden keine Viren gebildet, da der lytische Zyklus nicht vollständig durchlaufen wird. Ebenso unerwartet ist die Expression des anti-apoptotischen Proteins BHRF1, das auch zu den lytischen Genen gehört und dessen Expression kurz nach der Infektion primärer B-Zellen nachzuweisen war. Diese Ergebnisse führten im Rahmen dieser Arbeit zu der Hypothese eines dritten Infektionsmodus von EBV: die Initiation der Latenz. Dabei wird die Apoptose in der infizierten Zelle durch BHRF1 verhindert, bis die Latenz etabliert ist. Später können anderen Proteinen von EBV wie z.B. LMP1, dessen antiapoptotische Eigenschaften bereits beschrieben ist, diese Aufgaben übernehmen. Der bisher ungeklärte Mechanismus der Replikation des viralen Genoms von einem auf bis zu mehreren Hundert Kopien ist während der Initiation der Latenz durch einen der lytischen Replikation ähnlichen Vorgang zu erklären. LMP2A wurde bisher immer mit der Unterdrückung des lytischen Zyklus und der Aufrechterhaltung der Latenz in der infizierten Zelle in Verbindung gebracht. Um die Funktion dieses Proteins besser untersuchen zu können, wurde ein konditionales LMP2A Zellsystem entwickelt. Dieses Systems ermöglicht eine kontrollierte LMP2AAktivierung, um die induzierten Signalwege und Zielgene von LMP2A in der Zelle zu identifizieren.

Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen und induziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der B-Zell-Immortalisation ist ein Modellsystem, das die pathogenetischen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. In vitro gilt das virale latente Membranprotein 1 (LMP1) für die Immortalisation von B-Zellen als essentiell. LMP1 ist ein integrales Membranprotein, das als konstitutiv aktivierter Pseudorezeptor verschiedene Signalwege in der B-Zelle induziert und dabei analoge Funktionen zum zellulären CD40-Rezeptor wahrnimmt. Das Genom des EBV ist in dem Maxi-EBV-System einer genetischen Manipulation zugänglich. Zuerst habe ich verschiedene Mutanten des LMP1 Gens im Kontext des EBVGenoms etabliert und auf ihren Phänotyp untersucht. Überraschenderweise war es möglich, mit allen LMP1 mutierten EBVs proliferierende B-Zellklone zu generieren, dies gelang sogar mit einer „knock out“ Mutante des kompletten LMP1 Gens. Die zehn verschiedenen LMP1- Mutanten unterschieden sich gravierend in ihrer Effizienz, B-Zellen zu immortalisieren. So wurden bis zu 100 mal mehr Virionen benötigt, um z.B. mit der LMP1-„knock out“-Mutante proliferierende B-Zellklone zu etablieren. Eine solche B-Zelllinie wies in einem in vivo Experiment mit SCID-Mäusen im Gegensatz zu B-Zelllinien mit Wildtypvirus kein onkogenes Potential auf. Im Widerspruch zu den bisherigen Veröffentlichungen einer anderen Gruppe zeigen meine Ergebnisse, dass LMP1 für den Prozess der B-Zell-Immortalisation in vitro zwar kritisch, aber nicht zwingend notwendig ist. Für die Onkogenität von EBV in vivo ist LMP1 dagegen absolut essentiell. Die Zielgene des LMP1, die die verschiedenen Effekte wie B-Zell-Immortalisation, Onkogenität und Tumorentstehung vermitteln, sind nicht vollständig bekannt. Ein zweites Ziel dieser Arbeit war deshalb die umfassende Katalogisierung dieser Zielgene. Da LMP1 und der CD40-Rezeptor analoge Funktionen und gemeinsame Signalmediatoren und -wege aufweisen, sollten vergleichende Untersuchungen von LMP1- und CD40-regulierten Genen durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurde ein konditionales LMP1-System in humanen B-Zellen etabliert, das es erlaubt, LMP1-Signaltransduktion innerhalb eines sehr kurzen, definierten Zeitraums zu induzieren und differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Da der CD40-Rezeptor auf humanen B-Zellen konstitutiv exprimiert ist und durch Interaktion mit seinem Liganden aktiviert werden kann, konnte die Analyse CD40-regulierter Zielgene im selben Zellsystem erfolgen. Unter Anwendung von ATLAS Array-Filtern und Affymetrix Chips wurden 144 LMP1- und 28 CD40-regulierte Gene identifiziert. Schließlich konnte in Zellzyklusanalysen gezeigt werden, dass LMP1-Signale in humanen B-Zellen echte proliferative Effekte vermitteln und nicht nur anti-apoptotische Funktionen erfüllen.