Podcasts about b cll zellen

Eine kritische Vorraussetzung für eine effektive Krebstherapie stellt die Identifizierung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) dar. Diese Antigene sollten Peptidsequenzen besitzen, die an MHC-Moleküle binden. Auch sollten diese von Tumorzellen prozessiert und auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Ein weiteres TAA-Kriterium stellt die Überexpression im Tumor dar, was eine Erkennung durch T-Zellen ermöglicht und folglich eine Tumor-spezifische Immunantwort nach sich ziehen soll. Bei der B-chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) wurden bislang nur wenige Tumorantigene identifiziert, die als potentielle Zielstrukturen für eine Generierung einer spezifischen T-Zellantwort in Frage kommen. Daher sind die Bestrebungen groß, neue B CLL-assoziierte Antigene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die Moleküle hTERT, CD23 und CD229 hinsichtlich ihrer Möglichkeiten untersucht, als TAAs bei der B-CLL zu fungieren. Die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase Reverse Transkripase (hTERT), stellt ein universelles Tumorantigen dar, das in einer Vielzahl verschiedener Krebstypen, einschließlich hämatopoetischer Erkrankungen, exprimiert wird, jedoch nicht oder nur in geringem Maße bei adulten, gesunden, differenzierten Zellen detektierbar ist. Der humane Niedrig-Affinitätsrezeptor für IgE, auch bekannt als CD23, ist auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu finden. Bei der B-CLL wird CD23 konstitutiv exprimiert und atypisch auf den malignen B-Zellen reguliert im Vergleich zu normalen B-Lymphozyten. Dies hat eine starke Überexpression des Moleküls zur Folge. Das Humane Ly9 oder CD229, das Homolog zum murinen Ly9, ist ein Mitglied der SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) Familie, die Singnalrezeptoren repräsentieren. CD229 interagiert mit Antigen-spezifischen Rezeptoren und vermittelt so die Zelladhäsion zwischen Lymphozyten und anderen Zellen. Die Überexpression von CD229 auf hämatopoetischen Zellen wurde in einer Publikation beschrieben, die gezeigt hat, dass 12/15 B-CLL Patienten positiv für das Molekül waren. Ein Merkmal eines Tumorantigens/TAAs stellt die Überexpression in einem Tumor im Vergleich zum Normalgewebe dar. Alle drei Antigene wurden bezüglich ihres Expressionsprofils untersucht, und es konnte eine eindeutige Überexpression verglichen mit normalen Zellen nachgewiesen werden (RT-PCR, FACS-Analysen). Die Immunogenität und MHC-Restriktion (hier HLA-A0201) der ausgewählten Peptide wurde mit Hilfe in vitro generierter zytotoxischer T-Zellen (CTLs) von gesunden Spendern gezeigt, die Antigen-spezifisch durch Stimulation mit autologen, Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs) expandiert wurden. Die endogene Prozessierung und Präsentation der potentiellen Tumorantigene, genauer der verschiedenen hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide, konnte mit Hilfe Antigen-spezifischer CTLs von gesunden Spendern nachgewiesen werden, da diese spezifisch die HLA-A0201+ B-Zell-abstammende Zelllinie Ramos, HLA-A0201+ naive B-CLL Zellen und Peptid-beladene T2-Zellen in MHC-I-restringierter Weise erkannten (IFN-γ-ELISPOT Assays, [Cr51]-release Assay). Diese Experimente lassen auf eine natürliche Prozessierung und Präsentation der hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide via HLA-A0201 auf den B-CLL Zellen schließen. Des Weiteren konnten autologe hTERT-, CD23- and CD229-spezifische T-Zellen von B-CLL Patienten in Gegenwart von autologen CD40L-aktivierten B CLL Zellen und interessanterweise auch durch autologe, naive, maligne B-Zellen expandiert werden, die einen deutlichen Anti-leukämischen Effekt zeigten (IFN-γ-ELISPOT Assays, Dimerfärbungen). Ein möglicher Grund für die Generierung einer T-Zellantwort mit autologen naiven B-CLL Zellen als Stimulatoren scheinen das von den B-CLL Zellen vermittelte Mikromilieu (Zytokinprofil) darzustellen. Anhand der Quantität und Qualität der erzielten CTL-Reaktivitäten gegen die drei unterschiedlichen Moleküle zeigte sich, dass vor allem die Oberflächenmoleküle CD229 und CD23 als neue TAAs bei der B-CLL geeignet scheinen. hTERT ist ebenfalls in der Lage, eine Antigen-spezifische T-Zellreaktion zu induzieren, jedoch mit geringerer Effizienz. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD229 und CD23 natürlich prozessiert und als TAAs bei der B-CLL präsentiert werden, die die Expansion autologer Tumor-spezifischer T-Zellen erlauben. Daher stellen sie geeignete Zielstrukturen für T-Zellbasierte, immuntherapeutische Strategien und ein Immunmonitoring bei dieser hämatologischen Erkrankung dar. Für hTERT gilt dies jedoch nur bedingt.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Die chronische lymphatische Leukämie ist die häufigste Leukämie im Erwachsenenalter in den westlichen Ländern. Erkenntnisse der letzten Jahre haben das Spektrum verfügbarer Therapien deutlich erweitert, kurativ ist bisher nur die allogene Knochenmarkstransplantation. Im Blut der betroffenen Patienten treten die Zellen des malignen Klons in Kontakt mit autologen Immuneffektorzellen. Gentherapeutische Strategien basierend auf dem Transfer immunstimulatorischer Moleküle eröffnen deshalb neue Perspektiven für die Therapie der B-CLL. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals die Eignung eines Helfervirus-freien EBV-Genvektorsystems für den Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen beschrieben. Durch Optimierung der Vektorverpackung für ein eGFP kodierendes Plasmid konnte gezeigt werden, dass sich mit Hilfe einer Helfervirus-freien Verpackungszelline infektiöse Titer bis zu 2 x 106 infektiöse Partikel/ml generieren lassen. Das untersuchte Vektorsystem eignet sich für einen effizienten Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen. Auf eine CD40L-Stimulation, wie sie zur Verbesserung der Transfereffizienz von Adenoviren zur Anwendung kommt, kann dabei verzichtet werden. Der Gentransfer lässt sich mit Hilfe eines monokonalen Antikörpers gegen CD21 weitgehend neutralisieren. In Kontrollexperimenten mit Überständen aus der Verpackung TR-deletierter Genvektorplasmide sinkt die Gentransferrate auf Werte nahe der Nachweisgrenze. Nach Verpackung des therapeutischen Moleküls CD40L sinkt die Transfereffizienz gegenüber dem eGFP kodierenden Genvektor und vermehrt unspezifische Effekte werden beobachtet. Zu den charakteristischen Eigenschaften EBV abgeleiteter Genvektoren zählen ein Tropismus für B-Lymphozyten und eine grosse Verpackungskapazität, die den Transfer von Gensequenzen bis zu einer Grösse von 160 kb erlaubt. Als essentielle EBV-Elemente enthalten die Genvektoren nur die Verpackungssignale TR und den lytischen Replikationsorigin oriLyt. Zukünfte Entwicklungen des Vektorsystems haben zum Ziel das Risiko von Rekombinationsereignissen zu reduzieren, die zur Freisetzung replikationsfähiger Virusmutanten oder potentiell onkogener viraler Gene führen könnten.

Die Immuntherapie von niedrig malignen Tumoren stellt eine vielversprechende alternative Behandlungsmethode dar. Epstein Barr-Virus (EBV) etabliert eine latente Infektion in der Zielzelle, in der das EBV-Genom extrachromosomal aufrecht erhalten wird. EBV eignet sich mit diesen Eigenschaften hervorragend als Genvektor. Meine Aufgabenstellung war es, neue EBV-abgeleitete Genvektoren zu entwickeln, die das therapeutische Zytokin GM-CSF in Tumorzellen von B-CLL-Patienten (Chronische lymphatische Leukämie) exprimieren. Dabei entscheidend ist die Eigenschaft von EBV naive, wie auch reife und maligne B-Lymphozyten über den CD21-Rezeptor spezifisch zu infizieren. Als Grundlage diente das Maxi-EBV-System, mit dem das EBV-Genom für genetische Veränderungen zugänglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sicherer EBV-Basis-Vektor etabliert, der replikations-defizient ist und dem zusätzlich die immortalisierenden Eigenschaften von EBV fehlen. Im selben Zuge wurden verschiedene Expressionskassetten für das Transgen GM-CSF in den EBV-Basis-Vektor eingebracht. Es konnten fünf unterschiedliche GM-CSF-Vektoren etabliert werden, die das Transgen an verschiedenen Genorten innerhalb des Maxi-EBV-Genoms tragen. Zwei dieser GM-CSF-Vektoren erzielten besonders hohe Transduktionseffizienzen und Expressionsraten in der Modellzelllinie Raji (Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie). Auch B-CLL-Zellen konnten mit guter Effizienz transduziert werden, die Expression des GM-CSF war aber deutlich schwächer. Das immunstimulatorische Zytokin GM-CSF führt in vivo zu einer verbesserten Immunantwort gegen Tumore. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass GM-CSF-haltige Überstände von Vektor-transduzierten Raji-Zellen eine Reifung von dendritischen Zellen (DC) bewirken, die als wichtige Effektoren bei einer Anti-Tumorantwort gelten. Die Funktion von GM-CSF konnte auch anhand eines Proliferationsversuchs mit einer Zytokin-abhängigen Zelllinie gezeigt werden. Darüber hinaus waren DC nach exogener Antigenbeladung in der Lage, spezifischen CD4-positiven T-Zell-Klonen effizienter ein antigenes Peptid zu präsentieren, wenn die DC in Gegenwart von GM-CSF gereift waren. Damit zeigt das nach Gentransfer sezernierte GM-CSF einen immunstimulatorischen Effekt ähnlich dem von rekombinantem GM-CSF und kann eine effizientere Antigenpräsentation von Tumorantigenen hervorrufen. Prinzipiell eignen sich B-CLL-Zellen daher als Produzenten von EBV-Genvektor-transduziertem GM-CSF, das zur immunologischen Demaskierung von B-CLL-spezifischen, tumor-assoziierten Antigenen auch in vivo führen sollte.