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In den letzten Jahren hat ein durch psychrophile und psychrotolerante Clostridium spp. ausgelöstes Verderbsgeschehen bei vakuumverpacktem Rindfleisch, bei dem es zum Aufgasen der Vakuumverpackungen kommt, immer mehr an Bedeutung gewonnen. Neben C. estertheticum und C. gasigenes wurden eine Reihe verschiedener psychrophiler Clostridien beschrieben, die die Fähigkeit für dieses Verderbsgeschehen besitzen. Da divergente Beschreibungen dieser verderbsverursachenden Bakterien vorliegen, wurden sechs psychrotolerante Clostridien-Referenzstämme phänotypisch untersucht und die Ergebnisse mit bereits bestehenden Studien verglichen. Dabei wurden insbesondere hinsichtlich des Hämolyseverhaltens auf Blutagarplatten sowie der Größe der vegetativen Zellen abweichende Ergebnisse ermittelt. Bei der Untersuchung von C. gasigenes wurden obendrein im letzten Drittel der Stäbchen deutliche Querfortsätze beobachtet, die nach derzeitigem Kenntnisstand bisher in der Literatur nicht beschrieben wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mehr Erkenntnisse über das Vorkommen und die Verbreitung von psychrotoleranten Clostridien in fleischverarbeitenden Betrieben zu erlangen. Im Vorfeld dazu wurde die Nachweisbarkeit von C. estertheticum-Sporen von unterschiedlichen, häufig in fleischverarbeitenden Betrieben vorkommenden Oberflächen mittels Wattetupfern überprüft. Dabei konnten Sporen auf Kunststoff- und Edelstahloberflächen nachgewiesen werden, wobei die Nachweisintensität bei glatten Kunststoff- und Edelstahloberflächen annähernd gleich ausfiel, während die Nachweisintensität bei eingekerbten Kunststoffoberflächen deutlich abnahm. Da bislang kein PCR-System zum Nachweis von C. bowmanii und C. frigoris vorhanden war, wurde zur Beantwortung der Fragestellung ein neues PCR- System entwickelt sowie das von Broda et al. (2003a) entwickelte System zum Nachweis von C. gasigenes modifiziert. Bei Anwendung der konventionellen Gelelektrophorese lag die Nachweisgrenze von vegetativen Zellen im Bereich von 10 bis 10³ Organismen/ml Fleischtropfsaft. Bei Anwendung des Experion Automated Electrophoresis System mit vorangehender Aufreinigung der PCR-Produkte lag die Nachweisgrenze zwischen 10³ und 10^4 Organismen/ml Fleischtropfsaft. Die Nachweisgrenze für Sporen von C. frigoris und C. gasigenes war sowohl bei Anwendung der konventionellen Gelelektrophorese als auch bei Anwendung des Experion Automated Electrophoresis Systems für den jeweiligen Keim identisch. Sie lag bei C. frigoris bei 10^5 Organismen/ml Fleischtropfsaft, bei C. gasigenes bei 10² Organismen/ml Fleischtropfsaft. Die Nachweisgrenze für Sporen von C. bowmanii konnte aus technischen Gründen nicht ermittelt werden. Beim Vergleich des konventionellen sowie des automatisierten Elektrophorese-Systems zeigte sich, dass es bei einer Aufreinigung der PCR-Produkte zu DNA-Verlusten kommen kann, die sich in der Ermittlung der Nachweisgrenze widerspiegeln. Wird auf eine Aufreinigung verzichtet, führen beide Elektrophorese-Methoden zu gleich guten Ergebnissen. Abschließend wurden drei fleischverarbeitende Betriebe auf das Vorkommen von C. estertheticum, C. gasigenes, C. frigoris und C. bowmanii unter Anwendung der entwickelten Methoden untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass in jedem Betrieb C. estertheticum und C. estertheticum-like Organismen vorhanden waren. C. frigoris wurde ebenfalls in allen Betrieben detektiert, jedoch mit deutlich geringerer Häufigkeit, wohingegen C. bowmanii nur in einer Probe in Betrieb C nachweisbar war. C. gasigenes wurde ebenfalls nur in Betrieb C an zwölf verschiedenen Beprobungsstellen nachgewiesen. In den drei Betrieben wurden unterschiedliche Maßnahmen zur Eliminierung der psychrotoleranten Clostridien ergriffen und der Erfolg der Maßnahmen durch erneute Untersuchungen kontrolliert. Dabei wurde deutlich, dass durch die Verbesserung der allgemeinen Betriebshygiene und durch die Anwendung von peressigsäurehaltigen Desinfektionsmitteln die Nachweisbarkeit von psychrotoleranten Clostridien erheblich gesenkt werden konnte. Durch die Grundsanierung eines ursprünglich stark kontaminierten Betriebes wurde erreicht, dass keine der im Anschluss daran genommenen Tupferproben zu einem positiven Ergebnis auf psychrotolerante Clostridien führte.

Die Staupe ist eine bedeutsame, weltweit verbreitete virale Infektionskrankheit der Hunde und vieler anderer Raubtierspezies. Aufgrund ihres oft letalen Ausgangs und der fehlenden Möglichkeit zur kausalen Therapie, stellt die aktive Immunisierung empfänglicher Tiere die wichtigste prophylaktische Maßnahme dar. Bei der Impfung exotischer Tierspezies stellt sich die Verwendung von für den Hund zugelassenen, attenuierten Lebendimpfstoffen, sowie anderer experimenteller Vakzinen, problematisch dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression verschiedener Staupevirus-Antigene durch das Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) untersucht, um einen sicheren Kandidaten-Impfstoff gegen die Staupe zu erstellen. Mittels homologer Rekombination wurden die Gene des Fusionsproteins (F), des Hämagglutinin-Proteins (H) und des Matrix-Proteins (M) des Staupe-virus (Canines Distemper Virus, CDV) einzeln oder in Kombination in das MVA-Genom inseriert. Durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzmarker war eine hocheffektive Aufreinigung und klonale Isolation der verschiedenen rekombinanten MVA möglich. Bei der anschließenden genetischen Charakterisierung konnte die korrekte und stabile Insertion der Fremdgene nachgewiesen werden. Bei der Expressionsanalyse der CDV-Proteine konnte eine vom gewählten Promotor abhängige Synthese beobachtet werden. Um die Kombinations-möglichkeit verschiedener Antigene in einem MVA-Vektor zu untersuchen, wurde F/H-rekombinantes MVA erstellt, welches beide CDV-Glykoproteine zur Expression brachte. Anschließende Untersuchungen der Wachstumseigenschaften der rekombinanten MVA zeigten deren uneingeschränkte Replikationsfähigkeit in embryonalen Hühnerzellen sowie deren Replikationsdefizienz in Säugerzellen, was zum einen für die Herstellung von Impfstoffpräparationen im großen Maßstab und zum anderen für die sichere Anwendung im zu impfenden Säuger entscheidend ist. Es konnte gezeigt werden, dass mittels MVA-Vektorsystem eine effiziente Expression von CDV-Proteinen möglich ist, was die erstellten Konstrukte zu interessanten Kandidaten-Impfstoffen gegen Staupe macht. Weitere Untersuchungen über deren Potential zur Induktion einer protektiven Immunität im Tier sind anzustreben.

Der TNF-verwandte Apoptose induzierende Ligand TRAIL ist in der Lage, spezifisch Apoptose in Tumorzellen zu induzieren ohne normales Gewebe zu schädigen und gilt deswegen als vielversprechender Kandidat für den Einsatz in der Tumortherapie. Neben der Induktion von Apoptose ist TRAIL allerdings auch in der Lage den Transkriptionsfaktor NF-κB („nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells") zu aktivieren, was wiederum die Induktion von Zelltod durch TRAIL vermindert. Für die Tumortherapie wäre es daher wünschenswert, durch TRAIL selektiv den Apoptosesignalweg und nicht NF-κB zu aktivieren. Dazu ist ein Verständnis beider Signalwege unerlässlich. Im Gegensatz zum Signalweg der TRAIL-induzierten Apoptose ist der Signalweg der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB aber bisher wenig erforscht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das rezeptornahe Adaptorprotein und die ersten, rezeptornahen Signalschritte der NF-κB Aktivierung durch TRAIL zu identifizieren. Die Überexpression konstitutiv aktiver Fusionsproteine der beiden TRAIL-Rezeptoren 1 und 2 war in der Lage, NF-κB zu aktivieren. Fusionsproteine mit verkürztem C-Terminus, der die Apoptose-vermittelnde Todesdomäne enthält, waren dabei nicht im Stande den Signalweg zu aktivieren. Dadurch konnte die entscheidende Funktion der Todesdomäne für TR1 und TR2 bei der Induktion von NF-κB gezeigt werden. Um Untersuchungen des TRAIL-Signalweges mit dem Liganden durchführen zu können, wurde die bakterielle Produktion und Aufreinigung von rekombinantem humanem TRAIL, sowie einem hochaktiven ILZ (Isoleucin Zipper)-TRAIL und einer inaktiven Kontrollvariante etabliert. Die Untersuchung von FADD („fas associated death domain“)-defizienten JURKAT-Zellen, zeigte, dass diese nicht in der Lage waren, NF-κB auf TRAIL zu aktivieren. Die transiente und auch stabile Reexpression von FADD stellte dabei die Aktivierbarkeit von NF-κB durch TRAIL wieder her. Somit konnte FADD als Adaptorprotein für die TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB identifiziert werden. Die Expression von FADD-Varianten mit je zwei Punktmutationen in der Todeseffektordomäne war hingegen nicht in der Lage, TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB wiederherzustellen, was auf die Notwendigkeit der Multimerisierung von FADD hinweist. Des Weiteren aktivierten auch JURKAT-Zellen, die defizient für Caspase 8 („cysteinyl-aspartate specific protease 8“) waren, den TRAIL-induzierten NF-κB-Signalweg nicht. Auch die Verminderung der Expression von Caspase 8 in HEK 293T führte zu einer verminderten NF-κB Aktivierung durch die Überexpression des konstitutiv aktiven Fusionsproteins des TRAIL-Rezeptors 2. Im Rahmen dieser Arbeit war es somit gelungen, die Todesdomäne der TRAIL-Rezeptoren 1 und 2, das Adaptorprotein FADD mit seiner Todeseffektordomäne und wahrscheinlich Caspase 8 als rezeptornahe Signalschritte der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB zu identifizieren. Folglich sind die Signalwege von Apoptose und Aktivierung von NF-κB durch TRAIL im rezeptornahen Signalweg identisch. Damit ist es nicht möglich, an Hand der gezielten Aktivierung der rezeptornahen Signalschritte TRAIL-induzierte Apoptose selektiv zu aktivieren. Hierzu muss eine Untersuchung weiterer distaler Signalschritte erfolgen.

Podosomen sind aktinreiche Adhäsionsstrukturen, die vor allem in monozytären Zellen, aber auch in dendritischen Zellen, Osteoklasten, Endothelzellen oder glatten Muskelzel-len vorkommen. In primären humanen Makrophagen gibt es zwei Subpopulationen von Podosomen: größere, hochdynamische Precursor in der Peripherie sowie kleinere, sta-bilere Podosomen im Zellzentrum. Die Regulation der Podosomendynamik in der Zell-peripherie erfolgt durch das Mikrotubuli-basierte Motorprotein KIF1C, wahrscheinlich durch den Transport von Regulationsfaktoren. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Ar-beit lag daher in der Identifizierung dieser Regulatoren. • Die Aufreinigung KIF1C-GFP positiver Vesikel mittels FACS ist grundsätzlich funk-tionell. Die Analyse zahlreicher Vesikel-assoziierter Proteine spricht weiter für die Hypothese, dass es sich bei der von KIF1C transportierten Fracht um vesikuläre Struk-turen handelt. Die Detektion zahlreicher unspezifischer Proteine zeigt jedoch auch, dass die Methode der Aufreinigung zukünftig noch verbessert werden muss. • RabGTPasen, die auch am Transport von Vesikeln beteiligt sind, haben oftmals eine ähnliche subzelluläre Lokalisation wie KIF1C. Vor allem zwischen Rab6a und KIF1C war ein häufiger und länger dauernder Kontakt in der Zellperipherie zu beobachten. Mittels GFP-Immunpräzipitation konnte eine Interaktion bestätigt werden. • Auf der Suche nach weiteren potentiellen Interaktionspartnern von KIF1C wurde das Protein HAX1 identifiziert. Sowohl in fixierten als auch in lebenden primären humanen Makrophagen konnte eine eindeutige Kolokalisation der Proteine in der Zellperipherie beobachtet werden. Bei Einsatz der Rigormutante von KIF1C (KIF1C-K103A) akku-mulierten beide Proteine am MTOC. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion zwi-schen KIF1C und HAX1 schließen. Das Motorprotein KIF9 lokalisiert vor allem an den stabileren Podosomen im Zentrum der Zelle. Bei der Ermittlung der Rolle von KIF9 hinsichtlich der Regulation dieser Po-dosomensubpopulation wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: • Knock-down von KIF9 reduziert die Anzahl der Podosomen und inhibiert bei noch bestehenden Podosomen den Abbau extrazellulärer Matrix. Für KIF9 konnte demnach nicht nur eine Beteiligung an der Podosomenregulation sondern auch eine Rolle im Matrixabbau zugewiesen werden. • KIF9-GFP positive Vesikel assoziieren mit Mikrotubuli und kontaktieren mehrere Podosomen nacheinander. Dies spricht für eine direkte Verbindung von KIF9-vermitteltem, mikrotubuli-basiertem Transport mit Podosomen, die durch KIF9 regu-liert werden. • Durch Immunpräzipitationsversuche wurden Hinweise gefunden, dass KIF9 mögli-cherweise in unterschiedlichen Spleißvarianten oder verschieden phosphorylierten Zu-ständen existiert. • Als Interaktionspartner für KIF9 konnte Reggie-1 identifiziert werden. Durch knock-down von Reggie-1 und auch Reggie-2 konnte diesen Proteinen eine Beteiligung am Abbau extrazellulärer Matrix zugeschrieben werden. Die Teilung der Podosomen-Precursor sowie Auflösung der regulären Podosomen sind grundlegende Vorgänge. Unterschiede in der molekularen Zusammensetzung der Podo-somen-Subpopulationen waren bisher allerdings unbekannt. • Supervillin konnte als erstes Protein identifiziert werden, das differentiell an die unter-schiedlichen Subpopulationen lokalisiert. Dies zeigt zum ersten Mal eine unterschiedli-che molekulare Zusammensetzung der Podosomen-Subpopulationen. • Podosomen reichern Supervillin an, bevor diese sich auflösen. Überexpression von GFP-Supervillin führte außerdem zu einem Verlust von Podosomen, wohingegen shRNA-basierter knock-down die Lebensdauer verlängerte. Supervillin scheint somit eine Rolle in der Regulation von Podosomen zu spielen. • Die Myosin IIA-Bindedomäne ist sowohl für die Anzahl der Podosomen als auch für die differentielle Rekrutierung an die unterschiedlichen Subpopulationen essentiell. • Supervillin steht mit Myosin IIA und der phosphorylierten leichten Kette von Myosin in Verbindung und koppelt kontraktiles Myosin an Podosomen, was deren Auflösung auslöst. • Durch siRNA-basierten knock-down konnte gezeigt werden, dass Supervillin erst zu-sammen mit Myosin IIA und/oder Gelsolin die Effektivität der Podosomen hinsichtlich Matrixabbau beeinflusst. Die Podosomenanzahl hingegen war nicht verändert.

Infektionen mit Pigeon-Circovirus gelten als Wegbereiter für ein verlustreiches und bei jungen Brieftauben weit verbreitetes multifaktorielles Krankheitsgeschehen, der Jungtaubenkrankheit. Neben der klinisch manifesten Form einer PiCV-Infektion kommt es auch zu subklinischen Infektionen, die am lebenden Tier durch die bislang entwickelten Nachweismethoden nicht sicher zu diagnostizieren sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein indirektes Virusnachweisverfahren entwickelt und zur Untersuchung von Taubenseren eingesetzt. Da PiCV nicht mit klassisch-kulturellen Verfahren vermehrt werden kann, wurde das Antigen für die Antikörperdetektion, basierend auf dem PiCV-Kapsidprotein, rekombinant in E. coli exprimiert. Um die Expression des Virusproteins im prokaryotischen System zu erleichtern, wurde die cap-Sequenz ohne die Arginin-Codon-reichen, 5’-terminalen 117 Nukleotide kloniert. Ein 5’-terminal eingefügter 6xHistidin-Tag ermöglichte die Aufreinigung mittels Metall-Affinitäts-Chromatographie und den Nachweis des rekombinanten Kapsidproteins rCapPiCV über anti-His-Antikörper. Durch Expression des Konstrukts und anschließende denaturierende Aufreinigung konnte rCapPiCV in großer Menge und hoher Reinheit gewonnen werden. Durch vergleichende Untersuchung der Reaktivität von rCapPiCV gegen Präimmun- und Immunseren von experimentell PiCV-infizierten Tauben und einem anti-His-Antikörper im Western Blot konnte die spezifische Bindung von anti-PiCV-Antikörpern durch das rekombinante Protein gezeigt werden. Damit gelang erstmals der Nachweis von anti-PiCV-Antikörpern. Auf der Basis des rCapPiCV wurde ein indirekter ELISA entwickelt und zur Untersuchung von Taubenseren eingesetzt. Mit Hilfe des rCapPiCV-ELISAs konnte die Serokonversion experimentell PiCV-infizierter Tauben ein bis drei Wochen p. i. gezeigt werden. Die Untersuchung im Western Blot bestätigte bei allen Seren das Ergebnis der serologischen Untersuchung im ELISA und damit die Spezifität der Antigenpräparation. Der rCapPiCV-ELISA wurde daraufhin zur Untersuchung eines natürlich, subklinisch infizierten Taubenbestands eingesetzt und detektierte in 30 (81 %) von 37 getesteten Taubenseren anti-PiCV-Antikörper. Dadurch wurde gezeigt, dass das entwickelte indirekte Virusnachweisverfahren geeignet ist, PiCV-Infektionsgeschehen auf Bestandsebene nachzuweisen. Aus dem Patientengut der Klinik für Vögel wurden Seren von Tauben mit unbekannten PiCV-Infektionsstatus aus den Jahren 1989, 1991 und 1994 ausgewählt und im rCapPiCV-ELISA getestet. Von 81 Seren waren 59 (73 %) PiCV-seropositiv, was darauf schließen lässt, dass PiCV schon vor seiner Erstbeschreibung 1997 in Deutschland in Taubenpopulationen zirkulierte. Die vorgestellten serologischen Methoden können in weiterführenden Studien zu Epidemiologie, Pathogenese und Verlauf der PiCV-Infektion eingesetzt werden. Diese Daten aus der Forschung sind nötig, um die Bedeutung der PiCV-Serologie auf Bestands- und Einzeltierebene und ihren Nutzen für die klinische Diagnostik zu bewerten. Neben dem Einsatz zur Bindung virusspezifischer Antikörper, ist rCapPiCV eine potenzielle Subunit-Vakzine für die PiCV-Impfstoffentwicklung.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen heute in der westlichen Welt die häufigste Todesursache überhaupt dar. In der Vergangenheit wurde deshalb zu deren Therapie bereits eine Vielzahl an medikamentösen und chirurgischen Behandlungsmöglichkeiten entwickelt, die jedoch insbesondere in schweren Erkrankungsfällen keine langfristig zufrieden stellenden Optionen bieten konnten. Von Embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) erhofft man sich deshalb ganz neue, zelltherapeutische Möglichkeiten. Durch das Potential, vitales Herzmuskelgewebe aus diesen pluripotenten Zellen in vitro generieren zu können, eröffnen sich dabei für die kausale Behandlung der Herzinsuffizienz bisher ungeahnte Perspektiven. Zwei der Hauptprobleme bei der Gewinnung von Kardiomyozyten aus der differenzierten ES-Zell-Kultur stellen jedoch zum einen der geringe Anteil von Herzmuskelzellen an der Mischkultur und zum anderen deren schwierige hochselektive Aufreinigung dar. Durch Entschlüsselung der Stammzellentwicklung und der daran beteiligten Faktoren und Signalkaskaden könnte es jedoch in Zukunft möglich werden, die Steuerung für diese Differenzierung zu übernehmen, um so aus den hoch proliferativen, pluripotenten Vorläuferzellen Kardiomyozytenreinkulturen gewinnen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde der früh während der Embryonalentwicklung exprimierte Transkriptionsfaktor mesoderm posterior 1 (MesP1) als mögliche Schlüsselkomponente der kardiovaskulären Entwicklung detailliert untersucht. Mithilfe eines dafür konstruierten Vektors konnte der Faktor MesP1 in stabil-transfizierten, murinen embryonalen Stammzellen überexprimiert – und so dessen induktive Wirkung auf die Entwicklung von Herz- und Endothelzellen während der ES Zell-Differenzierung auf molekularer wie auch zellulärer Ebene nachgewiesen werden. So zeigte sich in den transgenen Zellen bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung eine verstärkte Expression u. a. der frühen kardialen Transkriptionsfaktoren Nkx2.5 und GATA-4, die sich später während der Differenzierung in einer mehrfach erhöhten Ausbeute an Kardiomyozyten und Endothelzellen in der Zellkultur widerspiegelte. Die Funktionalität der amplifizierten Kardiomyozyten bezüglich Kontraktionsfrequenz und Reagibiliät auf vegetative Reize blieb dabei unverändert erhalten. Bei der Analyse der Keimblattentwicklung fiel auf, dass durch Überexpression des mesoderm posterior 1 in den transgenen Zellen die Menge an Gesamtmesoderm unverändert blieb, jedoch innerhalb dieses Keimblattes die Differenzierung deutlich in Richtung kardiovaskulär und zu Lasten der Skelettmuskelentwicklung verschoben war. Im Ektoderm zeigte sich eine verstärkte neurale Entwicklung, induziert durch die vermehrt vorhandenen kardiogenen Zellen. Die Bildung des Endoderms war unbeeinträchtigt. Im Folgenden konnte schließlich in Untersuchungen zur Signaltransduktion der Mechanismus der MesP1-vermittelten kardiovaskulären Induktion aufgeklärt werden, indem der Faktor Dickkopf-1, ein Inhibitor des Wnt-Signalweges, als Zielgen des Transkriptionsfaktors MesP1 identifiziert und in Folgeversuchen mittels Bandshift auch bestätigt werden konnte. Die Blockade des Wnt-Signalweges ist verantwortlich für die Initiierung der kardiovaskulären Differenzierung während der Embryonalentwicklung. MesP1 stellt damit einen besonderen Faktor während der Embryogenese dar und einen wichtigen Startpunkt für die weitere Entzifferung der komplexen Signaltransduktionskaskaden der Herz- und Gefäßentwicklung. Das vollständige Verständnis dieses komplexen Netzwerkes sowie die Übertragung auf das humane ES-Zell-System könnte es einmal ermöglichen, Herzmuskelerkrankungen des Menschen mit embryonalen Stammzellen therapieren zu können.

Trotz erfolgreicher Resektion des Primärtumors sterben bis heute ca. 40% aller Brustkrebspatientinnen an den Folgen der Metastasierung. Inzwischen ist zunehmend anerkannt, dass wenige selektierte Tumorzellen für die Progression der Erkrankung und eine Therapie-Resistenz verantwortlich sind. Es ist deshalb fraglich, ob genomische Veränderungen, die zur Disseminierung führen, entdeckt werden können, wenn die Masse der Zellen eines heterogenen Primärtumors untersucht wird. Einzelne Tumorzellen disseminieren in ektope Organe, wie das Knochenmark, und gelten als die Vorläufer der metachronen Metastasen. Eine genetische Analyse dieser Zellen könnte zur Entdeckung neuer Zielstrukturen für adjuvante Therapien führen. Um genomweit und hochauflösend genomische Aberrationen identifizieren zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation ein Protokoll entwickelt, das Array-CGH-Analysen von einzelnen Zellen ermöglicht. Hierfür war es notwendig ein Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation von BAC-DNA zu entwickeln, die Bedingungen zur Array-Herstellung zu optimieren und ein Hybridisierungsprotokoll zu etablieren. Der daraufhin hergestellte, 3000 BAC-Klone umfassende 3K BAC-Array mit einer mittleren Auflösung von 1 Mb war bei der Analyse amplifizierter DNA aus Einzelzellen konventionellen BAC- und Oligonukleotid-Arrays überlegen. Bei Hybridisierungen von Einzelzell-DNA mit bekanntem Karyotyp wurde bei normalen Zellen ein balanciertes Profil, bei Einzelzell-DNA eines Patienten mit Trisomie 21 die zusätzliche Kopie des Chromosoms 21 und bei Einzelzell-DNA von T47D-Zellen der komplexe Karyotyp in Übereinstimmung mit der Literatur dargestellt. Zusätzlich wurden Kriterien zur Auswahl zuverlässig hybridisierender BAC-Klone identifiziert und ein Assay zur Vorhersage einer erfolgreichen Array-CGH Analyse von Einzelzell-Amplifikaten entwickelt. Bei der Untersuchung einzelner disseminierter Tumorzellen aus dem Knochenmark von Brustkrebspatientinnen wurden sowohl große Alterationen, die durch Metaphasen-CGH detektiert worden waren, als auch kleine zusätzliche Aberrationen zwischen 3,5 und 4,7 Mb Größe detektiert. Ausgewählte chromosomale Gewinne konnten durch eine qPCR unabhängig verifiziert werden. Der 3K BAC-Array erhöht die Auflösung der Metaphasen-CGH um den Faktor 10-30 und ist außerdem publizierten Verfahren zur Array-CGH mit Einzelzellen überlegen. Mit seiner Hilfe war eine hochauflösende Untersuchung gestreuter Methaphasen-CGH-negativer Tumorzellen möglich, was zur Identifizierung bislang unerkannter Veränderungen führte. Die Einzelzell-Array-CGH-Technologie ermöglicht nun die Charakterisierung mikrometastatischer Vorläuferzellen und damit neue Erkenntnisse über frühe Stadien der Krebserkrankung.

Zusammenfassung Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 2 (EBNA-2) ist ein Schlüsselprotein bei der Initiation und der Aufrechterhaltung der B-Zelltransformation nach einer EBV-Infektion. EBNA-2 reguliert die Genexpression von viralen und zellulären Genen und induziert so das physiologische Proliferationsprogramm der B-Zelle. Die DNA-Bindung erfolgt indirekt durch eine Interaktion mit zellulären Adapterproteinen, zu denen das CBF1 (C-promoter binding factor 1) Protein zählt. Mit dieser Arbeit sollte ein Beitrag zum Verständnis der bisher wenig untersuchten molekularen Mechanismen, über die EBNA-2 zelluläre Zielgene transaktiviert, geleistet werden. Die drei zellulären EBNA-2-Zielgene SLAMF1, DNASE1L3 und CCL3 wurden in dieser Arbeit exemplarisch untersucht. Die EBNA-2-Transaktivierung der drei Gene ist CBF1 abhängig. In allen drei Genen konnte erstmals eine EBNA-2-Bindung am Transkriptionsstart nachgewiesen werden. Erstmalig ist auch der Nachweis gelungen, dass EBNA-2 an intronständige CBF1-Bindestellen rekrutiert wird. Eine EBNA-2-Aktivierung führte in allen untersuchten Genen zur Rekrutierung der an Serin 5 phosphorylierten Polymerase II an den Transkriptionsstart, sowie auch zu CBF1-Bindestellen in Regionen, die distal zum Transkriptionsstart lokalisiert sind. Die Aktivierung der Genexpression korreliert in allen Fällen mit einer erhöhten Acetylierung der Histone H3 und H4, die nicht auf den Bereich des Transkriptionsstarts beschränkt war. Eine detaillierte Analyse des CCL3-Gens erwies, dass die DNA-Bindung von CBF1 durch EBNA-2 unterstützt wird. Des Weiteren zeigte sich, dass eine nahe dem Transkriptionsstart gelegene Region entscheidend zur EBNA-2 vermittelten Transaktivierung beiträgt und vermutlich nicht durch CBF1 vermittelt wird. Möglicherweise reguliert EBNA-2 nicht nur über eine Bindung an CBF1 die Transaktivierung eines Genes, sondern noch über einen zweiten Mechanismus, bei dem EBNA-2 direkt oder indirekt an den Transkriptionsstart oder in dessen unmittelbarer Nähe bindet. Zur Identifikation von Proteinen, die direkt an dem molekularen Mechanismus der EBNA-2-Transaktivierung beteiligt sind, wurde die „Tandem Affinity Purification“ (TAP-Reinigung) zur Aufreinigung nativer EBNA-2-Komplexe in B-Zellen etabliert. Durch eine anschließende massenspektrometrische Analyse konnten potentielle EBNA-2-Interaktionspartner identifiziert werden. Für das interessante Kandidatenprotein TFE3, ein Transkriptionsfaktor des Immunglobulinlokus, konnte bereits eine spezifische Anreicherung über EBNA-2 nachgewiesen werden.

Die Amyloidosen gehören zu den Proteinspeicherkrankheiten. Die abgelagerten pathogenen Proteine zeichnen sich durch eine besondere Konformation, die β-Faltblattstruktur, aus. Man spricht daher auch von Konformationskrankheiten" oder "β-Fibrillosen". Bislang sind etwa 25 verschiedene Proteine bekannt, die im Menschen zu einer Amyloidose führen können. Je nach Lokalisation der Amyloidablagerungen unterscheidet man lokale („Amyloidom“), organlimitierte (z.B. zerebrale) und systemische Formen. Die Benennung erfolgt nach der Art des gespeicherten Proteins, wobei an das Kürzel „A“ für „Amyloid“ das Kürzel des gespeicherten Proteins angehängt wird: Die bekanntesten Amyloidosen sind vom Typ Aβ (M. Alzheimer), APrP (Scrapie), AA (Akutphasenprotein bei chronischen Entzündungen), Aβ2M (Urämie, chronische Hämodialyse), ATTR (Amyloid vom Transthyretin-Typ sporadisch im Alter sowie familiär bei Mutation) und AL (Leichtketten-Amyloid bei monoklonaler Gammopathie mit den Isotypen λ und κ). Daneben gibt es seltenere, dann oft familiär gehäuft auftretende und z.T. mit Polyneuropathie einhergehende Amyloidosen sowie Amyloid in endokrinen Drüsen. In dieser Arbeit wurde die Amyloidose einer Patientin („UNK“) untersucht, die eine außergewöhnliche klinische Manifestation einer organlimitierten Amyloidose aufweist: Über 10 Jahre hinweg sind bei der Patientin multiple subkutane Knoten („Amyloidome“) aufgetreten, ohne dass sich im Verlauf ein Anhalt für eine systemische Amyloidverteilung ergab. Bei den Amyloidablagerungen handelt es sich, wie in dieser Arbeit mit immunchemischen und biochemischen Methoden gezeigt werden konnte, um eine Amyloidose vom κ1-Leichtketten-Typ (ALκ1). Es werden also Teile eines Immunglobulins, nämlich einer κ-Kette der Subklasse 1 (man unterscheidet 4 κ-Subklassen, daneben gibt es noch Leichtketten vom Typ λ) in knotiger Form in der Subkutis gespeichert ausgehend von einer monoklonale Gammopathie. Das besondere auch daran ist, dass sich über 10 Jahre kein Progress im Sinne der Entwicklung eines Plasmozytoms gezeigt hat. Daneben wurde bei der Patientin ein zerebraler Entmarkungsherd (Multiple Sklerose) diagnostiziert, hierbei muss differentialdiagnostisch an das Vorliegen eines zerebralen Amyloidoms gedacht werden; es gibt dazu entsprechende Berichte in der Literatur. Durch Isolation des Amyloidproteins aus dem Gewebe, Aufreinigung und anschließende Aminosäuresequenzierung (Edman-Abbau) kombiniert mit Massenspektrometrie konnte die vollständige Aminosäuresequenz der variablen Region (AS 1-108) sowie wesentlicher Teile (bis AS 207) der konstanten Region (AS 109-214) der abgelagerten κ-Kette ermittelt werden. Um die Frage zu klären, ob aus der Aminosäuresequenz des Proteins auf seine Amyloidogenität, also die Wahrscheinlichkeit, Amyloid zu bilden, geschlossen werden kann oder auf die sehr ungewöhnliche Art der klinischen Manifestation (Leichtkettenamyloidosen zeigen in der ganz überwiegenden Zahl der Fälle ein systemisches Befallsmuster), wurde die ermittelte Sequenz mit allen bislang veröffentlichten 17 Sequenzen von Amyloid-bildenden κ1-Ketten sowie nicht-amyloidogenen κ-Ketten verglichen mit folgendem Ergebnis: (1) ALκ (UNK) zeigt 7 bisher nicht und etwa ebenso viele bisher nur selten beschriebene Aminosäureaustausche. Diese Aminosäureaustausche entsprechen kaum den bislang typischerweise mit erhöhter Amyloidogenität in Verbindung gebrachten Mutationen, so dass aus der Aminosäurenabfolge an sich kein Rückschluss auf die Amyloidogenität des Proteins möglich ist. (2) Bemerkenswert ist ferner die (bei aus dem Gewebe isolierten Amyloidproteinen fast regelhaft auftretende) starke Fragmentierung des Proteins, ein "staggering" an Position 63-69 sowie eine Biklonalität (AS 82D und E), welche bisher für ALκ-Amyloidosen noch nicht beschrieben wurde. (3) Die Hypothese, dass erhöhte Hydrophobizität die Amyloidogenität eines Proteins erhöht, wird durch ALκ (UNK) bestätigt, indem die in ALκ (UNK) neu aufgetretenen Aminosäureaustausche die Hydrophobizität deutlich steigern. (4) Es ist bekannt, dass die Destabilisierung der Tertiärstruktur eines Proteins seine Umfaltung zur Fibrille begünstigt. ALκ (UNK) weist eine Mutation an der hochkonservierten und für die Stabilisierung der Tertiärstruktur verantwortlichen Position (Serin60Prolin)auf. (5) Da in der Literatur bislang erst 6 Fallberichte zu organlimitierten subkutanen Amyloidosen (verschiedene Ursprungsproteine) vorliegen, lässt sich der bevorzugte Organbefall (Organotropismus) derzeit noch nicht aus der Aminosäuresequenz ableiten. Möglicherweise wird der Tropismus durch eine Art Antigen-Antikörper-Interaktion der amyloidogenen Leichtketten mit Strukturen im Zielgewebe (mit-)bestimmt. Das Protein ALκ (UNK) wurde außerdem mit immunchemischen Methoden charakterisiert: (1) Im Kaninchen wurde ein polyklonales Antiserum gegen ALκ (UNK) hergestellt und gegen Amyloide vom Typ ALκ aus anderen Patienten, native κ Ketten sowie Amyloide anderer Subklassen ausgetestet. Es hat sich mittlerweile im Routineeinsatz bestens bewährt und rückblickend die Sensitivität und Spezifität der Amyloiddiagnostik im Labor deutlich verbessert. (2) Es konnte gezeigt werden, dass Antiseren, die gegen Amyloid-Vorläuferproteine (κBJP) erzeugt wurden, keine Reaktion mit ALκ (UNK) zeigen. Diese Beobachtung unterstützt die Annahme, dass es im Rahmen der Amyloidogenese zu einer erheblichen Konformationsänderung und damit auch Veränderung der Oberflächenstruktur des Vorläuferproteins kommt, so dass zur immunchemischen Detektion von Amyloidproteinen besondere Reagenzien (nämlich speziell gegen Amyloidproteine hergestellt Antiseren) erforderlich sind. (3) Die Subklassenbestimmung der abgelagerten κ-Kette gelang mit den eingesetzten immunchemischen Methoden aus technischen Gründen nicht. (4) ALκ (UNK) konnte auch immunchemisch (Immunhistochemie, Western Blot, Ouchterlony-Test) eindeutig als ALκ identifiziert werden, was den hohen Stellenwert der Immunchemie bei der Amyloiddiagnostik unterstreicht. Daneben wurden noch weitere Untersuchungen angestellt: (1) Der Geweberohextrakt wurde mittels Western Blot bezüglich des Gehaltes an anderen Proteinen (außer ALκ (UNK)) untersucht. Es konnten u.a. unfragmentierte λ- und γ-Ketten nachgewiesen werde, ferner ist vom Vorhandensein noch weiterer ubiquitärer höhermolekularer Proteine wie Albumin in gegenüber dem Amyloidgehalt vergleichsweise geringer Menge auszugehen. (2) Die Fragmentierung der abgelagerten Proteine wurde genauer untersucht. Man findet Sequenzanfänge bei AS-Position 1,40,88,150,159, wobei andererseits wieder Fragmente gefunden wurden, die diese überlappen. Auch ein die konstante und variable Region der leichten Kette überlappendes Fragment wurde gefunden. Daneben wurden Urinproben der Patientin untersucht. Auch hier zeigen sich κ-Fragmente in mehreren Molekulargewichtsbereichen (nicht sequenziert). Ob die Fragmentierung vor, während oder nach der Amyloidablagerung zustande kommt, wurde nicht untersucht. Zur Therapie dieses ungewöhnlichen Amyloid-Syndroms: Bei fehlender Progression sowohl im Bezug auf das Auftreten neuer Amyloidablagerungen (bislang fehlende systemische Beteiligung) wie auch hinsichtlich der Dynamik des monoklonalen Plasmazellklons (kein Anhalt für Plasmozytom) ist derzeit ein abwartendes Verhalten gerechtfertigt. Sollte es bei der Patientin zur Progredienz kommen, wäre bezüglich der Amyloidablagerungen die entsprechende symptomatische Therapie (medikamentöse Therapie der Herzinsuffizienz, Schrittmacherimplantation, Hämodialyse bei Niereninsuffizienz), bezüglich der monoklonalen Gammopathie die Reduktion des monoklonalen Zellklons (gemäß den Leitlinien zur Tumortherapie, z.B. autologe Stammzelltransplantation) indiziert.

Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein bedeutender Lebensmittelkeim, der vorwiegend in Schweinefleisch vorkommt. Kulturell ist er sehr schwer nachzuweisen, da er auf Selektivagar sehr schnell von anderen Keimen überwuchert wird. Zudem sind die kulturellen Isolierungsmethoden sehr zeitaufwendig und eine Aussage über pathogene oder apathogene Stämme kann aufgrund der Ergebnisse ohne weitere Diagnostik nicht getroffen werden. Aus diesen Gründen wird in der Diagnostik von Y. enterocolitica aus Lebensmitteln vermehrt der PCR-Nachweis eingesetzt, welcher innerhalb von Stunden, bei vorheriger Anreicherung nach einem Tag, ein zuverlässiges Ergebnis liefert. Abhängig von der Wahl des Zielgenes werden nur pathogene Keime detektiert. Die Sensitivität einer PCR ist in großem Maße von der Aufreinigung abhängig, deshalb sollte ein PCR-Protokoll immer einschließlich Probenvorbereitung etabliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time PCR-basiertes Nachweisverfahren, zusammen mit der Probenvorbereitung, für Y. enterocolitica in Lebensmitteln entwickelt. Nachgewiesen wurde das chromosomale ail-Gen, sowie das auf dem Plasmid lokalisierte virF-Gen. In Vorversuchen erfolgte die Optimierung von verschiedenen Bedingungen für eine PCR, wie die Mastermix-Konzentration, Primer-Konzentration und Annealing-Temperatur. Anschließend erfolgte die Untersuchung von gezielt kontaminierten Rinderhackfleischproben. Diese Proben wurden nach Anreicherung mit sechs verschiedenen Extraktionsverfahren aufgereinigt und anschließend mit drei PCR-Methoden, davon eine Real-Time PCR mit SYBR Green und eine TaqMan Real-Time PCR sowie eine konventionelle Multiplex-PCR mit Gelelektrophorese, auf Y. enterocolitica untersucht. Parallel dazu wurde der klassische kulturelle Nachweis mit Anreicherung in TSB und ITC und Ausstrich auf CIN-Agar durchgeführt. Abschließend erfolgte die Untersuchung von 150 Schweinefleischproben aus dem Handel. Diese wurden ebenfalls mittels der drei PCR-Methoden und kulturell untersucht. Die Aufreinigung der Proben erfolgte nach Anreicherung mit drei Extraktionsmethoden, welche in den Versuchen mit den beimpften Proben die besten Ergebnisse lieferten. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden.

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt näher bringen.

Maligne Erkrankungen sind in den Industrieländern, nach Herz-Kreislauferkrankungen, die zweithäufigste Todesursache. Aufgrund der Erfolge bei der Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird Schätzungen zufolge Krebs in den nächsten Jahren die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern sein. Trotz des klinischen und wissenschaftlichen Fortschritts ist die Prognose der meisten Tumorentitäten unverändert schlecht. Eine der Hauptursachen ist der Mangel an spezifischen Markern, um eine geeignete Frühdiagnostik, Vorsorge und Therapie zu ermöglichen. Biomarker, wie tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene, werden als potente Strukturen diskutiert, Karzinome bereits im Frühstadium zu diagnostizieren und im Rahmen von Therapien als Zielstrukturen eingesetzt zu werden. Seit einigen Jahren werden daher systematische Techniken zur Identifizierung neuer Tumorantigene entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine bestehende Technologie zur Identifizierung von Tumorantigenen weiterentwickelt und optimiert werden. Die in der Arbeitsgruppe etablierte Technik namens AMIDA (Autoantibody-mediated Identification of Antigens) basiert auf der spezifischen Autoantikörper-vermittelten Selektion und Aufreinigung potenzieller Tumorantigene und deren anschließender zweidimensionaler Auftrennung und Isolierung. AMIDA ermöglicht prinzipiell die Identifizierung von Tumorantigenen, die durch posttranslationale Modifikationen immunogen wurden, wobei für die Isolierung das komplette Proteom zur Verfügung steht. Es wurde eine allogene Variante etabliert, welche die Technik unabhängig von autologen Tumorbiopsien macht (allo-AMIDA). Neben der Einführung geeigneter Kontrollen kann allo-AMIDA nun im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Der Vorteil von allo-AMIDA gegenüber AMIDA und anderen Strategien ist, neben der schnellen und reproduzierbaren Durchführung, die nunmehr universelle Einsetzbarkeit der Methode. Zur Identifizierung von Tumorantigenen werden lediglich Seren von Tumorpatienten und eine geeignete Tumorzelllinie benötigt. Allo-AMIDA wurde am Beispiel von Karzinomen des Kopf-Hals-Bereiches eingesetzt und führte zur Identifizierung von insgesamt 12 potenziellen Tumorantigenen. Neun der 12 Tumorantigene wiesen zum Zeitpunkt der Identifizierung eine Assoziation mit Tumoren auf, fünf davon sind etablierte Tumorantigene, was die Eignung von allo-AMIDA zur Identifizierung von TAs beweist. Für die allo-AMIDA-Antigene Grb-2 und Hsp-27 konnte eine starke Expression in Tumorzellen der Kopf-Hals-Entität gezeigt werden. Drei der allo-AMIDA Antigene waren bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen assoziiert. Eines dieser Proteine – hnRNP H (heterogeneous ribonucleoprotein H) – stellte sich als geeigneter Marker für Tumorzellen des Kopf-Hals-Bereiches heraus. Es konnte auf Transkript- und Proteinebene gezeigt werden, dass hnRNP H bereits in hyperplastischem Epithelien vermehrt gebildet wird und mit zunehmender Karzinogenese in den meisten primären Tumoren bzw. Metastasen dieser Tumorentität stark überexprimiert ist. Interessanterweise war diese starke Expression auf Tumorzellen beschränkt. In anderen Tumorentitäten (Kolon-, Pankreas-, Mamma-Karzinom) war hnRNP H ebenfalls stark über-exprimiert, die Expression in humanen nicht-malignen Geweben war sehr heterogen. Da bis dato wenige Informationen über die Funktion dieses nukleären Proteins bekannt sind, wurde hnRNP H detaillierter analysiert. In der Literatur wird diskutiert, dass hnRNP H am alternativen Spleißen von prä-mRNAs bzw. an der Regulation dieses Prozesses beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von hnRNP H durch RNAi zur Apoptose von Tumorzelllinien führt. Mittels Genexpressionanalyse konnten potenzielle Zielgene im Bereich Apoptose identifiziert werden, die von hnRNP H durch alternatives Spleißen reguliert werden. hnRNP H ist an der Regulation des Bcl-X-Gens beteiligt, was von Garneau und Kollegen (2005) kürzlich ebenfalls gezeigt werden konnte. Die Regulation von ARAF1 durch hnRNP H wurde erstmals gezeigt; ein potenzieller Weg, wie die Deregulation von ARAF1 Apoptose induzieren kann, wird vorgeschlagen. Die Validierung der Zielgene von hnRNP H im Kontext von Tumorzellen ist Gegenstand laufender Projekte und weiterer Analysen.

Zum Nachweis von PrPc und PrPsc wurde eine Kapillarelektrophorese-Immunofluoreszenz-Methode (CE-LIF) etabliert und mit konventionellen Verfahren (ELISA, Westernblot, Dot-EIA) verglichen. Zur CE-LIF wurde der monoklonale Antikörper F89 und ein Fluoreszenz-markiertes Peptid (FITC-P3) eingesetzt. Die Nachweisgrenze für rekombinantes bovines PrPc liegt bei 1 pg/Test. Zur Anreicherung von PrPsc aus Hirn und Liquor wurden (Ultra-) Zentrifugations-, Extraktions- (HFIP) und Chromatographieverfahren (HPLC, Festphasenextraktion) einzeln oder in Kom-binationen geprüft; darüber hinaus wurden Anreicherungsversuche mit Affinität- bzw. Immu-nomagnetischer Separation vorgenommen. Die Überprüfung des PrPsc-Gehaltes ausgewählter Extrakte im Vergleich zum Ausgangsma-terial mittels ELISA ergab deutliche Substanzverluste. Eine selektive Bindung von PrPsc an Dynabeads® gekoppeltem Plasminogen konnte nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde eine Anlagerung an Antikörper-beschichteten Beads festgestellt. Allerdings war die Bin-dungskapazität der Beads bei Versuchen in mit in PBS gelöstem PrPc oder PrPsc höher als bei vergleichbaren Versuchen mit Liquor. Bei der kapillarelektrophoretischen Analyse erwiesen sich alle mittels einfacher Probenauf-bereitung hergestellten Extrakte als ungeeignet. Sie führten entweder zu technischen Prob-lemen (Verstopfung der Kapillare; Durchbrennen) oder zu Interferenzen im Elektrophe-rogramm, die eine Auswertung nicht ermöglichten. Die Aufbereitung mittels HPLC ergab zwar verwendbare Präparationen, allerdings variierte die Retentionszeit von PrPsc derart stark, dass dieses Verfahren nicht weiter eingesetzt wurde. Bezüglich der Verwertbarkeit von CE-LIF wurden die besten Resultate mit Hilfe einer Aufreinigung nach Bio-Rad® mit an-schließender Festphasenextraktion erzielt. Während der Nachweis von PrPsc mittels CE-LIF aus Hirngewebe eindeutig gelang, führte die Untersuchung des Liquors eines bekannt BSE-positiven Tieres zu keinem eindeutigen Ergebnis. Prinzipiell ist die CE-LIF zum Nachweis von PrPsc geeignet. Allerdings handelt es sich dabei um ein sehr störanfälliges Verfahren. Die Sensitivität kann deutlich erhöht werden, wenn die Konzentration von PrPsc in kleine Volumina noch besser gelingt.

Agrobacterium tumefaciens ist ein Gram-negatives Bodenbakterium, das dikotyle Pflanzen infiziert. Mittels eines Typ IV Sekretionssystems werden dabei ein Teil der bakteriellen DNA (T-DNA), sowie die Virulenzproteine VirE2, VirE3, VirD2 und VirF in die pflanzliche Zelle transferiert. Das Typ IV Sekretionssystem von A. tumefaciens besteht aus den 12 Vir-Proteinen VirB1-VirB11 und VirD4, die zu einem die äußere und innere Membran durchspannenden Proteinkomplex und einem Pilus (T-Pilus) assemblieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Protein-Protein-Interaktionen im VirB/D4-Sekretionssystem von A. tumefaciens C58 analysiert, mit dem Ziel einer Aufklärung der Assemblierung von Transporterstruktur und T-Pilus. Ergebnisse: 1) Unter Verwendung des milden nicht-ionischen Detergenz n-Dodecyl-b-D-maltosid wurde eine potentielle Vorstufe der T-Pilus Assemblierung solubilisiert. In dem ca. 100 kDa großen Proteinkomplex wurden die Vir-Proteine VirB2, VirB3, VirB5, VirB6, VirB7, VirB8 und geringe Mengen VirB9 detektiert. Die T-Pilus Proteine VirB2, VirB5 und VirB7 zeigten bei Analyse mittels BN-PAGE und 2D-Gelelektrophorese eine Kofraktionierung. Unter Berücksichtigung bereits bekannter Fakten wurde ein Modell der T-Pilus Assemblierung wurde erstellt. 2) Ein 27 kDa großes, mit VirB5 interagierendes Protein wurde entdeckt und nach Aufreinigung und N-terminaler Sequenzierung als „trans-Zeatin produzierendes Protein“ (Tzs) identifiziert. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Tzs ergab eine Umsetzung von 4-Hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyldiphosphat (HMBPP) mit AMP zu Zeatinribosid-5´-monophosphat (ZMP), einem Phytohormon der Cytokinin-Klasse. HMBPP ist ein Zwischenprodukt des alternativen Isoprenoid-Biosynthese Weges (DXP-Weg) Gram-negativer Bakterien. 3) Eine Interaktion von VirB5 mit VirB5, sowie VirB5 mit VirE2 konnte gezeigt werden. Im Rahmen der Analysen wurde neben den Piluskomponenten VirB2, VirB5 und VirB7 auch VirB1 in isolierten T-Pili detektiert.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem proteolytischen System des Chloroplasten höherer Pflanzen und hier speziell mit dem des Thylakoidsystems. Vorderstes Ziel war die Isolierung und Charakterisierung neuer, bislang unbekannter Komponenten. Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Ansätze erprobt: Einmal der rein biochemische Weg, bei dem der Versuch unternommen wurde, speziell lichtinduzierte proteolytische Aktivitäten des Thylakoidlumens nachzuweisen, anzureichern, und, falls möglich, aufzureinigen. Mit dem zweiten Ansatz wurde zunächst versucht, in Sequenzvergleichen auf molekularbiologischer Ebene homologe Gene zu bekannten bakteriellen und cyanobakteriellen Proteasen im pflanzlichen Genom ausfindig zu machen, und ausgehend von diesen dann die zugehörigen Genprodukte zu isolieren und charakterisieren. 1. Nachweis, Charakterisierung und Aufreinigung lichtstreßinduzierter Proteasen des Thylakoidlumens: Die zu diesem Ansatz durchgeführten Experimente konnten im Thylakoidlumen von Erbsenchloroplasten durch den Einsatz von Aktivitätstests auf substrathaltigen Polyacrylamidgelen mindestens fünf distinkte proteolytische Aktivitäten sichtbar machen. Diese Aktivitäten erwiesen sich als eindeutig induzierbar durch Hochlicht. Sie wurden jedoch sämtlich durch in äußerst geringer Menge vorliegende Komponenten des Lumens hervorgerufen. An der dadurch, sowie zusätzlich durch einen Lichtadaptationseffekt des Pflanzenmaterials, bedingten schlechten Reproduzierbarkeit der Aktivitäten scheiterten schließlich sowohl die Charakterisierung der unbekannten Proteasen als auch deren weitere Aufreinigung. Die Arbeiten sind dennoch dazu angetan, eine Vorstellung von der Größe und Komplexität des proteolytischen Systems alleine des Thylakoidlumens zu vermitteln. 2. Klonierung der Gene neuer plastidärer Proteasen und Charakterisierung der zugehörigen Genprodukte: Im Rahmen der Arbeit wurden die Gene zweier zuvor nicht beschriebener mutmaßlicher Proteasen aus Arabidopsis thaliana L. isoliert, beides Homologe zu bekannten Proteasen aus E. coli. hhoA: Das Produkt dieses Gens stellt ein Mitglied der ubiquitär verbreiteten HtrA-Familie von Serinproteasen dar, deren Zahl sich in Arabidopsis auf mittlerweile vierzehn beläuft. Es besitzt die typische katalytische Triade der Familie, läßt jedoch die zumindest für die meisten charakterisierten Homologe typische sogenannte PDZ-Domäne im N-terminalen Bereich vermissen. In den Experimenten zur Kartierung des Gens konnte gezeigt werden, daß dieses in singulärer Kopienzahl auf Chromosom IV lokalisiert ist. Anschließende Untersuchungen zur Expression konnten in Pflanzen jedoch weder unter normalen Anzuchtsbedingungen, noch nach Streßexperimenten mit Hochlicht und Hitzestreß ein spezifisches Transkript nachweisen. In vitro-Experimente belegten die Transkribier- und Translatierbarkeit des Gens; dessen Produkt im in organello-Importexperiment als lösliche Komponente im Thylakoidlumen akkumulierte. Weitere Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen aus Spinat und Arabidopsis unter Zuhilfenahme eines gegen das heterolog exprimierte gereifte Genprodukt produzierten polyklonalen Antikörpers bewiesen, daß hhoA auch in vivo synthetisiert wird und wie im Importexperiment im Thylakoidlumen lokalisiert ist. Verschiedene Versuche zur Funktion des Proteins brachten kein eindeutiges Ergebnis. Die Transformation von Arabidopsis mit Sinnund Gegensinnkonstrukten des Gens war zwar erfolgreich, erzeugte jedoch Pflanzen ohne erkennbar vom Wildtyp abweichenden Phänotyp. sppA: Das Homolog zu der Signalpeptid-prozessierenden Protease aus E. coli, Protease IV, stellt das bislang einzige beschriebene in höheren Pflanzen dar. Das Gen ist, wie in Experimenten zu seiner Kartierung gezeigt wurde, in singulärer Kopienzahl im Genom vorhanden, lokalisiert auf Chromosom I. In Untersuchungen zur Expression konnte das Transkript unter normalen Anzuchtsbedingungen nicht nachgewiesen werden. Bei Behandeln der Pflanzen mit Lichtstreß über längere Zeit wurde jedoch ein nach mehrstündiger Latenzzeit einsetzendes Ansteigen der Transkriptrate beobachtet. Das Genprodukt wurde nach in vitro-Transkription und -Translation im in organello-Importexperiment als peripher mit der stromalen Oberfläche der Thylakoidmembran assoziiert charakterisiert. Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen mittels Antikörpern, die gegen den C-Terminus des heterolog exprimierten SppA-Proteins produziert worden waren, bestätigten neben dem Nachweis des Vorhandenseins auch unter Normalbedingungen diese Lokalisation auch in vivo. Bei weiterer Subfraktionierung der Thylakoide fand sich das Protein vornehmlich assoziiert mit Stromathylakoiden. Die bei Bestrahlung der Pflanzen mit hohen Lichtintensitäten steigende Expressionsrate deutet auf eine funktionelle Neudefinierung von SppA in photosynthesetreibenden Organismen im Vergleich zu E. coli und auf eine Rolle innerhalb der langfristigen Adaptationsmechanismen der Pflanze gegen Lichtstreß hin. Weitere Untersuchungen konnten jedoch keine eindeutigen Hinweise bezüglich der spezifischen Funktion des Proteins liefern.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.

Ziel dieser Arbeit sollte die Entwicklung einer automatisierten, hochparallelen und nachweis-starken Sequenzierungsmethode für Proteine im Rahmen der Proteomanalytik sein. Zur Kon-zeption der Methodik sollte dabei mit der sogenannten Leitersequenzierung eine Kopplung aus enzymatischem Aminosäureabbau und MALDI-Massenspektrometrie zum Einsatz kom-men. Die experimentellen Grundparameter für die Leitersequenzierung im Bezug auf die nasschemischen Sequenzierungsschritte und die massenspektrometrischen Messung wurden dabei im ersten Teil der Arbeit zunächst manuell ausgearbeitet. Im zweiten Abschnitt wurden dann die Möglichkeiten einer Automatisierung der so erarbeiteten Methode zur Leitersequen-zierung auf verschiedenen Ebenen evaluiert. Da der enzymatische Abbau eines Gesamtproteins durch dessen intrinsische Eigenschaften wie Sekundärstruktur, Tertiärstruktur (Zugänglichkeit der Proteintermini für die Exopepti-dase) oder Lösungsverhalten erschwert ist, wurden die Sequenzierungsprotokolle der Leiter-sequenzierung für proteolytisch erzeugte, RP-HPLC-gereinigte Spaltfragmente von Proteinen optimiert. Zudem besitzt die MALDI-MS, wie auch andere gängige massenspektrometrische Verfahren, im Massenbereich über ca. 5-10 kDa eine zu geringe Auflösung und Genauigkeit, um eine eindeutige Zuordnung der Massendifferenzen in den Leiterpeptidspektren zu den durch Exopeptidase abgespaltenen Aminosäure zu erlauben. Bei Versuchen mit verschiede-nen Endopeptidasen stellte sich – entgegen theoretischen Erwartungen – heraus, dass vor allem auch Proteinspaltungen mit Endoproteinase GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin, neben Spaltungen mit Endoproteinase LysC, gute Voraussetzungen für die nachfolgende enzymatische Sequenzierung liefern. Mit den Proteinfragmenten aus Spaltungen der Endoproteinasen GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin wurden bei den enzymatischen Sequenzierungen die höchsten Sequenzabdeckungen erzielt. In der technischen Ausführung wurden alle Experimente im Hinblick auf eine Sequenzierung direkt auf dem Target (on-target) optimiert. Geringfügige Anpassungen der erarbeiteten Methoden erlaubten jedoch auch eine Sequenzierung von Peptiden, die zuvor auf PVDF-Membran (Immobilon PSQ) aufgetragen wurden. Ein relativ kontrollierter und reproduzierba-rer Abbau war in einem Temperaturbereich von ca. 25-35°C möglich. Die enzymatischen Sequenzierungen erfolgten ausschließlich mit kommerziell erhältlichen Exopeptidasepräpara-tionen. Eine zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Enzyme erwies sich als nicht notwen-dig. Um eine einfache Interpretation der massenspektrometrischen Resultate zu gewährleisten, wurden nur Monopeptidylpeptidasen eingesetzt. Für C-terminale Sequenzierungen wurden mit CPY, CPP, CPW, CPA und CPB Carboxypeptidasen unterschiedlicher Spezifität einzeln und in verschiedenen Kombinationen untersucht. Von der N-terminal Seite aus wurden Sequenzierungen mit APM, LAP, API und AAP durchgeführt. Eine Betrachtung der Sequen-zierungen zeigt dabei, dass zumeist nur aus kombinierten Resultaten der Anwendung verschiedener Carboxy- beziehungsweise Aminopeptidasen eine ausreichende Sequenzinfor-mation erhalten werden kann. C-terminal ist der Anteil sequenzliefernder Fragmente bei der Verwendung von CPY, sowie bei den sequenziellen Peptidasenkombinationen sb(CP-I) und den Peptidasenmischungen pb(CP) mit maximal 42% am höchsten. Hier treten auch vermehrt längere Teilsequenzen mit bis zu 12 AS auf. N-terminal hebt sich APM als Einzelpeptidase mit überdurchschnittlich guten Sequenzresultaten gegenüber den anderen Aminopeptidasen ab. Bis zu 34% der getes-teten Peptide liefern allein schon mit diesem Enzym eine Sequenzinformation. Zudem wurden längere Teilsequenzen mit bis zu 9 AS im Vergleich zu anderen Aminopeptidasen häufiger erhalten. Sequenzierungen mit Aminopeptidasenmischungen bei N-terminaler Sequenzierung brachten im Gegensatz zu Carboxypeptidasenmischungen bei C-terminaler Sequenzierung kaum deutliche Vorteile. Auch sehr lange Sequenzabschnitte mit bis zu 16 AS N-terminal und bis zu 25 AS C-terminal wurden in Einzelfällen erhalten. C- und N-terminal am häufigsten wurden jedoch aus den Leiterspektren Teilsequenzen mit bis zu 6 AS erhalten (85% aller sequenzliefernden Proteinfragmente). Der größte Teil der Sequenzabdeckung stammt mit 70% aus Teilsequenzen mit 3-9 AS. Unter dem Hauptaspekt einer möglichen Steigerung der Sequenzinformation bei den Leiter-sequenzierung wurden unterschiedliche Peptidderivatisierungen untersucht. Die gezielte N-terminale Modifizierungen brachte in vielen Fällen durch die resultierende Massenverschie-bung des derivatisierten Peptids einen Gewinn an C-terminaler Sequenzinformation. Gegen-über entsprechend nicht-modifizierten Peptiden konnten durch die Massenverschiebung auch Leiterpeptide beobachtet werden, die sonst mit Signalen der MALDI-Matrix interferieren. Bei Modifikationsreagenzien, die eine fixierte positive Ladung oder ein ausgedehntes, delokali-siertes Elektronensystem ins Peptid einbrachten, wie z.B. Sulforhodamin B oder FMOC-NHS wurde dabei zusätzlich auch eine sehr gute Response im Massenspektrum beobachtet. Die Empfindlichkeiten lagen selbst bei der Sequenzierung der Rohprodukte solcher Derivate im unteren fmol-Bereich. Das charakteristische Isotopenmuster Brom-haltiger Peptidderivate erlaubte weiterhin ein stark vereinfachtes Auslesen der Leitersequenz aus dem Massenspekt-rum. Während die Leitersequenzierung allgemein keine Unterscheidung der isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin erlaubt, gelang die Unterscheidung der ebenfalls isobaren Aminosäuren Lysin und Glutamin nach einer schnellen und selektiven Acetylierung des Lysins mit anschließender C-terminaler Sequenzierung.Im Hinblick auf die Analyse post-translationaler Modifikationen wurden insbesondere Phosphorylierungen eingehender untersucht. Dabei war sowohl bei der N-terminalen, als auch bei der C-terminalen Leitersequenzierung ein enzymatischer Abbau der phosphorylierten Aminosäuren zu beobachten und damit die entsprechende Phosphorylierungsstelle schnell und eindeutig zu identifizieren. Die N-terminale Sequenzierung mit APM lieferte die besten Resultate und ermöglichte sowohl den Abbau von Phosphotyrosin wie auch Phosphoserin, während der C-terminale Abbau sich auf Phosphotyrosin beschränkt zeigte. Aus der Summe der erhaltenen Resultate (Sequenzen) folgt, dass die Leitersequenzierung unter den gegebenen Voraussetzungen – insbesondere der limitierenden Verfügbarkeit zusätzlicher Exopeptidasen mit ergänzenden Spaltungsspezifitäten – im wesentlichen als Instrument zur schnellen Generierung kurzer Sequenztags geeignet ist. Auf diesem Gebiet stellt die erarbeitete Leitersequenzierung im Vergleich zur Edman-Sequenzierung eine wesentlich schnellere Alternative dar. Im Gegensatz zu rein massenspektrometrischen Sequenzierungen ist die Interpretation der Sequenzen im Massenspektrum stark vereinfacht und daher zumeist eindeutig. Die Empfindlichkeit der Methode ist stark von der untersuchten Peptidsequenz abhängig. Generelle Werte für die Empfindlichkeit lassen sich somit nicht angeben, die Resultate lassen jedoch für eine Peptidausgangsmenge im oberen fmol-Bereich (1000-500fmol) eine Leitersequenzierung ausnahmslos möglich erscheinen. Die Ergebnisse von Verdünnungsreihen zeigen zudem, dass auch nach Sequenzierung von Peptidmengen im mittleren bis unteren fmol-Bereich (50-10fmol) ein Auslesen der Peptidsequenz aus dem Massenspektrum zumeist möglich ist. Zum Erreichen solcher Empfindlichkeiten ist die weit-gehende Minimierung von Suppressionseffekten und damit die Verwendung von DHB als MALDI-Matrix eine notwendige Voraussetzung. Eine Evaluierungsstudie mit vier verschiedenen Proteinen führt zum Schluss, dass die Metho-dik auch für die de novo Sequenzierung unbekannter Proteine ein hohes Potential birgt. Die ermittelte Sequenzabdeckung der überlappenden Spaltfragmente lag bei maximal 80%. Im Bereich prolinhaltiger Sequenzabschnitte fehlen Überlappungen dabei am häufigsten, da auf Seiten der N-terminalen Sequenzierung geeignete Exopeptidasen zu Spaltung der Iminbindung nicht verfügbar waren. Zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen, die dann als Hybridisierungssonden in der Nucleinsäureanalytik eingesetzt werden, ist die Länge der erhaltenen Sequenzabschnitte jedoch in fast allen Fällen ausreichend. Die Methoden „MALDI-LS 1.42s“ für die Probenpräparation mit dem Pipettierroboter MultiPROBE II, sowie „multiprobe_5“ für die MALDI-MS Messung mittels AutoXecute auf dem Bruker Reflex III Massenspektrometer, erlauben eine Umsetzung der manuell ausgear-beiteten Methodik auf ein vollständig automatisiertes System. Eine Excel-Tabellenvorlage, die in konvertierter Form von beiden beteiligten Geräten gelesen werden kann, ermöglicht eine zentrale und einfache Dateneingabe für die Proben. Diese Art der Dateneingabe erlaubt im Zusammenspiel mit dem ausgearbeitetem Automatisierungspro-gramm eine vollkommen flexible, individuelle Behandlung der einzelnen Proben. Die erfor-derliche „Ortspräzision“ bei der Abgabe der Flüssigleiten auf dem MALDI-Target konnte durch eine entsprechenden ausgelegte Performance-Datei für den Pipettiervorgang erreicht werden. Querkontaminationen beim Pipettieren wurden durch organische Spülschritte in der Methode eliminiert. In der Summe lieferten die auf dem automatischen Pipettiersystem mit der Methode MALDI-LS 1.42s präparierten Proben im Massenspektrum vergleichbare Abbauspektren und somit auch die gleiche Sequenzinformation, wie entsprechend manuell präparierte Proben. Bei den automatischen MALDI-MS Messungen war eine Anpassung der Parameter insbeson-dere aufgrund der bevorzugten Verwendung der DHB-Matrix notwendig. Ein erhöhter Aceto-nitrilgehalt von 50% im Lösungsmittel der DHB sorgte für eine Verbesserung der Präparation im Bezug auf die automatische AutoXecute Messung. Mit speziellen Rasterkoordinaten, die bei der Laserabtastung der einzelnen Probenspots auf die besonderen Kristallisationseigen-schaften der DHB-Matrix zugeschnitten wurden, konnten gute Ergebnisse erzielt werden. Vorteile zeigten die DHB-Präparationen, im Vergleich zu CHCA-Präparationen, in der Toleranz gegenüber geringfügigen Mengen von Puffersalzen, wie sie bei der enzymatischen Sequenzierung üblich sind. Die Toleranzschwelle für den Abbruch der automatischen Messung musste jedoch bei den enzymatisch sequenzierten Proben und Verwendung von DHB-Matrix im Vergleich zu Messungen salzfreier Peptidproben in CHCA-Matrix erhöht werden, was im Durchschnitt zu etwas längeren Messzeiten führte. Die in dieser Arbeit weiterentwickelten Methoden zur enzymatischen on-target Sequenzie-rung von Peptiden erlauben somit, in Verbindung mit den beschriebenen Hard- und Software-komponenten zur automatischen Probenpräparation und MALDI-MS Messung, deren Einsatz für eine schnelle Sequenzierung in der Proteinanalytik. Zusätzliche Verbesserungen könnten jedoch, bei entsprechender Verfügbarkeit, noch durch Exopeptidasen mit ergänzender Spaltungsspezifität (z.B. X-Pro Aminopeptidase, EC 3.4.11.9) erzielt werden. Auf Seiten der Automatisierung ergäben sich durch die ausschließliche Ver-wendung eines 96er oder 384er Mikrotiterplattenformat auf allen Geräten (Pipettierrobot und MALDI-MS) deutliche Vereinfachungen in der Methode, bei gleichzeitig noch höherem Probendurchsatz.