Podcasts about tumorentstehung

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So groß wie ein Hühnerei können sie werden: Trichilemmalzysten sind gutartige Tumore, die aus Haarfollikeln der Kopfhaut entstehen. An diesen Zysten hat ein internationales Team unter Leitung von Forscherinnen und Forschern des Instituts für Humangenetik des Universitätsklinikums Freiburg einen neuen Mechanismus der Tumorentstehung beschrieben. Sie wiesen in aufwändigen Experimenten nach, dass es ausreicht, wenn in einer Zelle nur eine von zwei Genkopien fehlerhaft ist. Anhand von genetischen und funktionellen Laboruntersuchungen konnten sie zeigen, dass ein Teil dieser Genfehler vererbt wurde. Allerdings entstand die Zyste nur dann, wenn im Laufe des Lebens weitere Fehler in derselben Genkopie hinzukamen. Eine solche kombinierte Schädigung in nur einer Genkopie war bislang nicht beobachtet worden. Ihre Erkenntnisse, die auch für das Verständnis anderer zystenartiger Erkrankungen von Bedeutung sein könnten, veröffentlichten die Forscher am 10. Mai 2019 im Journal of Investigative Dermatology. Institut für Humangenetik, Universitätsklinikum Freiburg MEDIZIN ASPEKTE www.medizin-aspekte.de Weitere Informationen und der Link zur Originalstudie unter: https://bit.ly/2VvmCt1

HINTERGRUND: Krebserkrankungen sind nach kardiovaskulären Erkrankungen die zweithäufigste Krankheitsgruppe überhaupt in der Medizin. Nach dem aktuellen Stand der Forschung entstehen Tumoren durch Fehlregulation von Proliferation und Differenzierung einzelner Zellen. Diese Vorgänge können in Tiermodellen nachgebildet werden. Eine besonders hohe Aussagekraft haben dabei Tiermodelle, bei denen durch Verwendung eines hybriden Onkogens spontan ein Tumor entsteht. Ein hybrides Onkogen ist aus einem organspezifischen Promotor und einem bekannten Onkogen zusammengesetzt und führt zur Tumorentwicklung in einem bestimmten Organ. Ein Beispiel hierfür sind CEA424/SV 40 large T-Antigen – transgene Mäuse, sie entwickeln reproduzierbar einen Tumor im Antrum des Magens. ZIELSETZUNG: An diesem Tiermodell sollten die Faktoren der organselektiven Entwicklung des Tumors aufgeklärt werden. Hypothesen hierzu waren einerseits, dass dies durch die Integration des Transgens verursacht ist, andererseits, dass im betroffenen Organ spezifische Stimulatoren wirken. Zudem sollte auf der Grundlage von Genexpressionsdaten der Phänotyp der Tumorzellen identifiziert werden. METHODEN: Zunächst wurde mit Walking-PCR die Integrationsstelle identifiziert. Darüber hinaus wurde mit RT-PCR gezielt die Expression von Genen untersucht, welche an der Regulation von Proliferation und Differenzierung des Magens beteiligt sind. Mikroarray-Analysen und ihre computergestützte Auswertung dienten zudem zur Erstellung von Genexpressionsprofilen für verschiedene Zeitpunkte der Tumorentwicklung. ERGEBNISSE: Das Transgen wurde auf dem Chromosom 4 der transgenen Mäuse lokalisiert. Ein Einfluss der Integrationsstelle auf die organspezifische Tumorentstehung konnte dabei nicht gesehen werden. Die Genexpressionsanalyse ergab, dass im Verlauf der Tumorentwicklung die Wnt-Signalkaskade hochreguliert ist. Dieser Signalweg ist als wichtiger Stimulator der Proliferation vor allem in Stammzellmilieus des Gastrointestinaltraktes bekannt. Weiterhin zeigte sich für die Differenzierungsfaktoren Ihh, Notch1 und Pdx1 sowie für das Hormon Gastrin mit fortschreitender Tumorentwicklung eine verminderte Expression, was auf einen Verlust bestimmter Differenzierungswege im Tumorgewebe schließen lässt. In den Genexpressionsprofilen zeigte sich ein neuroendokriner Phänotyp der Tumorzellen.

Die Charakterisierung und Kultivierung von Tumorzelllinien mit Hilfe einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur gilt als Standardmethode in der Zellbiologie. Dreidimensionale (3D) Modelle gewinnen jedoch immer mehr an Bedeutung, da sie die Tumorbiologie in Bezug auf physiologisch relevante Zusammenhänge bei der Tumorentstehung und –progression besser abbilden als eine herkömmliche 2D-Kultur. Die auf poly-HEMA beschichteten Zellkulturplatten induzierten multizellulären Tumorspheroide reflektieren die Morphologie von avaskularen Tumoren und Mikrometastasen. In der vorliegenden Arbeit werden anhand von HER2-überexprimierenden Tumorzelllinien die Unterschiede der HER2-Signalaktivierung und –weiterleitung in 2D- und 3D-Kultur umfassend beschrieben. In 3D-Kultur konnte ohne Zugabe von zusätzlichen Wachstumsfaktoren eine stärkere HER2-Phosphorylierung beobachtet werden. Bei der Brusttumorlinie SKBR-3 bildet HER2 in 2D-Kultur bevorzugt Heterodimere mit HER3, wohingegen in Spheroiden HER2-Homodimere vorliegen. Diese Homodimere lokalisieren in lipidreichen Mikrodomänen und begünstigen die Aktivierung des Ras-MAPK-Wegs, der die Proliferation der Tumorzellen reguliert. Mit Hilfe des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab, der spezifisch für HER2 ist, kann die Proliferation der Zellen und die Phosphorylierung von HER2 im 3D-System besser inhibiert werden. Zusätzlich konnte in 3D eine Herunterregulierung des HER2/HER3 assoziierten PI3K-Akt-Signalwegs nachgewiesen werden. Bei SKBR-3 war in 3D-Kultur neben der stärkeren Phosphorylierung von MAPK auch die Aktivierung der Integrin 4/Rac1/PAK2-Signalkaskade zu beobachten. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit in 3D-Kultur die Zelllinie SKBR-3 HR generiert, die resistent gegen die Behandlung mit Trastuzumab ist. Die Charakterisierung dieser Linie zeigte eine verstärkte Expression von DARPP-32 und eine gesteigerte HER2/HER3-Heterodimerbildung, gefolgt von einer Hochregulierung des PI3K-Akt-Wegs. Das Gen für DARPP-32 liegt im ERBB2-Amplikon und liegt bei vielen Brusttumorproben und –zelllinien amplifiziert vor. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierte Resistenz reversibel ist und die erneut Trastuzumab responsiven Zellen eine schwächere Expression von DARPP-32 aufwiesen, gefolgt von einer reduzierten Aktphosphorylierung. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das beschriebene 3D-Modell einige in vivo Aspekte des HER2-Signalmusters besser reflektiert und deshalb als Basis für die weitere Aufklärung des Wirkmechanismus von Trastuzumab dienen kann. Außerdem kann dieses 3D-System zur Identifizierung von neuen Zielmolekülen herangezogen werden um Therapiestrategien zu entwickeln, welche eine Behandlung der HER2-positiven Patientenpopulation erlaubt, die bisher nur suboptimal auf die Behandlung mit Trastuzumab angesprochen haben.

Um die Funktion von MIF als Tautomerase auf genetischer Basis zu analysieren, untersuchten wir die MIFpg Maus, welche durch Punktmutation von Prolin1 zu Glycin einen Komplettverlust der enzymatischen Aktivität von MIF aufweist. Der Phänotyp der MIF-Defizienz in Fibroblasten besteht in verstärkter Kontaktinhibition, einem Defekt bei der malignen Transformation. Um die These über MIF als Enzym zu testen, untersuchten wir Fibroblasten von P1G-mutanten Mäusen. Laut unseren in vivo Analysen besitzen mutierte MIFpg-MEFs keine enzymatische Aktivität mehr. Die MIFpg-Maus, welche ein Mutation des Prolin1 aufweist, jener Aminosäure, welche als katalytische Basis der Isomeraseaktivität gilt, zeigte, dass MIFpg-Fibroblasten zwar einen Verlust der enzymatischen Aktivität als Isomerase, jedoch keine Defekte in der Ras-vermittelten Transformation aufwiesen. Daraus folgernd beruht die biologische Aktivität von MIF nicht auf dessen Isomeraseaktivität. Die p53-/- Mäuse entwickelten früh Tumore, meist Lymphome und Osteosarkome, mit einer daraus resultierenden frühen Letalität der adulten Maus. Die meisten Effekte von MIF scheinen durch p53 vermittelt zu werden, denn in Mäusen, welche sowohl für MIF als auch für p53 defizient sind, verschwindet der in MIFko-Mäusen beobachtete Phänotyp der verzögerten Tumorentstehung. Auch der in unseren Experimenten fehlende Unterschied in der Überlebenszeit von DKO im Vergleich zu p53-/- MIFflox/flox Mäusen, unterstützt die Annahme, dass die meisten Effekte von MIF in der Tumorgenese in vivo über p53 stattfinden. Unsere Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die tumorregulierende Aktivität von MIF im Wesentlichen über Regulation der p53-Aktivität durch MIF auf dem C57Bl/6 Hintergrund erklärt ist. Zudem zeigen wir, dass diese Aktivität nicht durch die enzymatische Aktivität von MIF als Tautomerase erklärt ist.

Der obere Aerodigestivtakt ist das primäre Kontaktorgan für viele inhalative Karzinogene. Dies spielt insbesondere bei der tabak-assoziierten Karzinogenese eine entscheidende Rolle. Polyzyklische Kohlenwasserstoffe und der Metabolit des Benzo[a]pyrens, das Benz[a]pyren-7,8-diol-epoxid (BPDE) sind hierbei von herausragender Bedeutung. Mutationen an der DNA sind dabei nicht gleichmäßig über die gesamte DNA verteilt, sondern auf speziellen Chromosomen bzw. Genen lokalisiert. Zur Erstellung eines individuellen Risikoprofils wurde in dieser Arbeit die alkalische Einzellzell-Mikrogelelektrophorese (Comet Assay), eine etablierte Methode zur Quantifizierung von DNA-Schäden, erstmals mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) an Mucosazellen des oberen Aerodigestivtraktes kombiniert. Nach Inkubation mit BPDE konnte so eine Bestimmung der DNA-Schädigung an den Chromosomen 3,5,8 und dem Vergleichschromosom 1 durchgeführt werden. Dabei wurden frisch entnommene, makroskopisch gesunde Mukosaproben von Patienten mit Oropharynxkarzinom und tumorfreien Patienten verglichen. Es stellte sich heraus, dass Tumorpatienten eine höhere Schädigung der Chromosomen 5 und 8 im Vergleich zu Chromosom 1 aufwiesen. Bei tumorfreien Patienten konnten keine Unterschiede der einzelnen Chromosomen untereinander und im Vergleich zur Gesamt-DNA nachgewiesen werden. Neben einer quantitativen Bestimmung der DNA-Schädigung an Interphasezellen sollte in der vorliegenden Arbeit auch strukturelle DNA-Schädigungen an Metaphasechromosomen untersucht werden. Zur Einschätzung der Mutagensensitivität bei der Karzinogenese im Oropharynx wurden in multiplen Vorarbeiten Lymphozyten als Kontrollzellen herangezogen. Deshalb wurden auch in der vorliegenden Arbeit Metaphasechromosomen aus Lymphozyten präpariert und mit FISH untersucht. Zusätzlich wurde auch eine neue Methodik zur Präparation von Metaphasechromosomen aus Mukosazellen des oberen Aerodigestivtraktes etabliert. Es konnte jedoch an keinem der untersuchten Chromosomen ein statistisch signifikanter Unterschied in der Schädigung zwischen tumorfreien- und Tumorpatienten ausgemacht werden. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Modell zur Präparation von Chromosomen aus Mukosazellen bietet zur weiterführenden Erfassung des Risikoprofils für die Entstehung von Karzinomen des oberen Aerodigestivtraktes einen geeigneteten Ansatz. Unter Umständen lassen sich zusätzliche Gene lokalisieren, die für die Tumorentstehung im Kopf-Hals-Bereich von Bedeutung sind. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass einige dieser Veränderungen bereits in makroskopisch gesunder Schleimhaut des oberen Aerodigestivtrakts auftreten. Weitere Untersuchungen müssen ergeben, ob spezifische Veränderungen am Genom nicht schon vor Entstehung des Tumors nachweisbar sind. Aus solchen Veränderungen ließe sich eine umfangreiche Frühdiagnostik zur Einschätzung der individuellen Mutagensensitivität entwickeln. Dies eröffnet die Möglichkeit für künftige präventive und therapeutische Strategien für die Karzinogenese des oberen Aerodigestivtraktes.

Bei Patienten mit malignen gastrointestinalen Tumoren kommt es auch nach erfolgter R0-Resektion des Primärtumors häufig in der Folgezeit noch zur Ausbildung von Fernmetastasen. Ursächlich hierfür sind disseminierte Tumorzellen, die sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Tumorentstehung vom Primärtumor absiedeln, anschließend jedoch in eine Art Ruhephase als „dormant cells“ fallen und erst zu einem späteren Zeitpunkt wieder in die Proliferationsphase eintreten. Hinsichtlich der Evaluation des Rezidivrisikos stellen diese disseminierten Zellen zwar einen unabhängigen Prognosefaktor dar, sind jedoch im Einzelfall mit bisher zur Verfügung stehenden Nachweismethoden nur unzureichend zu identifizieren. In dieser Arbeit haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein diagnostisches Verfahren zu entwickeln, das es uns einerseits erlaubt, disseminierte Tumorzellen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu charakterisieren und quantifizieren, andererseits dem Patienten eine permanente Verlaufskontrolle durch einen einfachen Zugang zu ermöglichen. Hierfür entwickelten wir eine quantitative Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), die hinsichtlich der Zielstruktur auf die außerordentlich spezifische Familie der Melanom-Antigen-Gene (MAGE)-A ausgerichtet war. Die Expression dieser Antigene konnte bisher in vielen verschiedenen Tumortypen nachgewiesen werden, nicht jedoch in nicht-tumorösen, adulten Geweben mit Ausnahme des Hodens. Eine hohe Sensitivität der Methode war durch die Identifikation einer Consensus-Sequenz der MAGE-A-Gene gewährleistet, wodurch wir in der Lage waren, unsere Primer so zu konstruieren, dass in einem Ansatz die MAGE-Subtypen A1-A6 gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Zum einen führten wir damit Zellverdünnungs-Experimente mit der Kolonkarzinom-Zelllinie HT 29 durch, bei denen jeweils 10 ml zentralvenöses Vollblut mit einer unterschiedlichen Anzahl HT 29-Zellen versetzt wurden. Ebenfalls wurden zur Kontrolle 14 Vollblutproben von Patienten ohne Tumorerkrankung aufgearbeitet. Zum anderen untersuchten wir 22 zentralvenöse prä- und postoperative Vollblutproben von Patienten mit operablen gastrointestinalen Tumoren und 19 intraoperativ gewonnene Peritoneallavagen auf das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen. Die Zellverdünnungs-Experimente erbrachten das Ergebnis, dass mit dem verwendeten Analyseverfahren das Vorhandensein von fünf einzelnen Tumorzellen in zehn Millilitern zentralvenösen Vollblutes nachgewiesen werden kann. Dies entspricht einer Empfindlichkeit des Nachweises von einer malignen Zelle in 107 bis 108 mononuklären Zellen. Alle 14 untersuchten Negativkontrollen wurden korrekt als MAGE-A-negativ identifiziert. Von den 22 Vollblutproben der Tumorpatienten konnte präoperativ bei 10 (= 45,5%), postoperativ bei 13 (= 59,1%) eine Disseminierung nachgewiesen werden. Fünf der 19 analysierten Peritoneallavagen erbrachten ein MAGE-A-positives Ergebnis. Dabei zeigte sich keinerlei Abhängigkeit der Disseminierung von der Tumorausdehnung (pT), der Lymphknotenbeteiligung (pN), Fernmetastasen (M), Grading (G), Tumortyp, Alter oder Geschlecht der Patienten. Ob und in welcher Art und Weise die Expression von MAGE-Genen möglicherweise Zellen überhaupt erst dazu befähigt, sich vom Primärtumor abzusiedeln und welchen Einfluss die Operation selbst am Auftreten einer Disseminierung maligner Zellen hat, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausreichend untersucht und sollte Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein. Hierfür haben wir ein hochsensitives und –spezifisches Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen entwickelt, auf dessen Grundlage es gelingen könnte, geeignete Patienten spezifischen adjuvanten Immuntherapiekonzepten mit MAGE als Zielstruktur zuzuführen und so das späte Auftreten von Metastasen zu verhindern.

In dieser Arbeit soll eine Dysregulation der an der Angiogenese beteiligten TGF-Beta-Isoformen und ihrer Rezeptoren in Hypophysentumorzellen als möglichen pathogenetischen Faktor in der Tumorentstehung bzw. -progression von Hypophysenadenomen dargestellt werden.

Das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM ist in der Tumorentstehung von Plattenepithelkarzinomen über- oder de novo exprimiert. Zudem korreliert die EpCAM-Expression in Tumorzellen positiv mit Proliferation und Entdifferenzierung. Es wurde in Vorarbeiten ein 1100 bp epcam-Promotorfragment kloniert, das spezifisch in EpCAM-positiven Zellen transkriptionell aktiv ist und durch TNFα in der Promotoraktivität reprimiert wird. In meiner Arbeit untersuchte ich, ob das 1100 bp epcam-Promotorfragment zur gezielten heterologen Genexpression geeignet ist. Zu diesem Zweck wurden drei Proteine ausgewählt: Grünes Fluoreszenz Protein (GFP), TNF receptor associated death domain Protein (TRADD) und Herpes Simplex Virus 1 Thymidinkinase (HSV1-TK). GFP diente der Visualisierung der Promotoraktivität im Fluoreszenzmikroskop. TRADD sollte die Apoptose in EpCAM-positiven Tumorzellen induzieren. Mit Hilfe der spezifischen Expression der HSV1-TK in EpCAM-positiven Zellen sollten Tumorzellen für Ganciclovir sensitiviert werden. Eine Therapie mit Ganciclovir sollte das Absterben der Tumorzellen bewirken. Die heterologe Genexpression wurde an einem zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen getestet. Dabei zeigten EpCAM-positive Zellen eine deutliche GFP-Expression, während EpCAM-negative Zellen sporadisch eine minimale Fluoreszenzintensität aufwiesen. Die EpCAM-spezifische Expression von GFP konnte im Immunoblot bestätigt werden. Um den Zusammenhang zwischen EpCAM- und GFP-Expression zu veranschaulichen, wurden die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen der EpCAM-Oberflächenexpression mit der GFP-Fluoreszenz verglichen. Damit konnte im zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen gezeigt werden, dass die epacm-Promotoraktivität zu einer heterologen Genexpression von GFP führt. Das zelluläre Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen wurde auf die Expression weiterer funktioneller Gene untersucht. Für das Funktionsgen TRADD konnte dabei weder eine EpCAM-spezifische heterologe Genexpression in der RT-PCR noch im Immunoblot nachgewiesen werden. In beiden Untersuchungen führten die Positivkontrollen zu einem Nachweis von TRADD. Da TRADD über komplexe Signalwege zur Bildung von TNFα führen kann, findet möglicherweise eine Inaktivierung des epcam-Promotors durch TNFα statt. Die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors konnte im zellulären Modellsystem in der RT-PCR nachgewiesen und auf die EpCAM-positive Tumorzelllinie SKBR3 übertragen werden. Durch die Genexpression von HSV1-TK wurden EpCAM-positive HEK293 Transfektanten sensitiv gegenüber einer Behandlung mit Ganciclovir und zeigten eine deutlich reduzierte metabolische Aktivität im MTT-Ansatz bei Ganciclovirgabe. Dabei gewonnene Erkenntnisse wurden an der EpCAM-positiven Tumorzellinie SKBR3 bestätigt. Zusammengefasst konnte gezeigt werde, dass die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors zu Ganciclovirsensitivität in EpCAM-positiven Zellen führte, jedoch nicht in EpCAM-negativen Zellen. Somit ist es denkbar, das 1100 bp epcam-Promotorfragment für die therapeutische Genexpression letaler Gene zur Elimination EpCAM-positiver Tumorzellen zu verwenden.

Das Auftreten einer Metastasierung ist von großer prognotischer Relevanz für Patienten mit einer Tumorerkrankung und hat einen bedeutenden Einfluß auf die Heilungsrate. Bisher gibt es keine Therapie, die die Ausbreitung der Krebserkrankung verhindern oder stoppen kann, unter anderem, weil der Prozess der Metastasierung noch weitgehend unklar ist. Deswegen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Tumorzelldisseminierung zu verstehen: Gibt es bestimmte Gene, die in disseminierten Zellen unter- oder überexprimiert sind? Hat ihre differentielle Expression einen Einfluss auf die Disseminierung? An welchen Signalwegen sind die dazu gehörigen Proteine beteiligt? Um Antworten auf diese Fragestellungen zu erhalten, ist es von großem Interesse, disseminierte Tumorzellen direkt zu studieren. Die Detektion solcher Zellen ist allerdings schwierig, da die Zellen extrem selten sind und es an spezifischen Markern mangelt. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Marker für die Detektion epithelialer Zellen in mesenchymalem Gewebe zu finden. Dafür wurde die differentielle Genexpression zwischen vier metastatischen Zellen von Brustkrebspatienten (Tester) und Knochenmarkzellen gesunder Patienten (Driver) mit der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Methode analysiert. Da das Ausgangsmaterial aus global amplifizierter cDNA einzelner Zellen besondere Adaptersequenzen trägt, musste die SSH zuerst daran angepasst werden. Neun der gewonnenen Sequenzen zeigten eine differentielle Expression, die positiv im Tester und negativ im Driver war. Drei der identifizierten Sequenzen (BAF57, IGF1R und LPP) sind für ihre potentielle Beteiligung bei der Tumorentstehung bereits bekannt. Die Expression der neun Sequenzen wurde in elf Tumorzelllinien und Knochenmark geprüft. Drei Sequenzen sind nur in Zelllinien und nicht in Knochenmark nachzuweisen: IGF1R, BAF57 und eine Sequenz von uns #288 genannt, die keinem bereits bekannten Gen entspricht. Sie konnte als Fragment eines von ERV9 Long Terminal Repeat (LTR) gesteuerten Transkriptes identifiziert werden. LTRs von humanen endogenen Retroviren (HERV) enthalten Virale Promotoren, Enhancer und Polyadenylierungssignale und können die Genexpression regulieren. Es wurden bereits verschiedene zelluläre mRNA-Transkripte gefunden, die von ERV9 LTRs gesteuert werden. Die differentielle Expression der Sequenz #288 zwischen Karzinomzelllinien und Knochenmark deutet darauf hin, dass der ERV9 LTR für eine Gewebespezifizität verantwortlich zeichnen könnte. Da in Krebsgewebe auch eine höhere Transkriptionsaktivität für nicht kodierende Transkripte festgestellt wurde, stellt sich die Frage, ob die Sequenz #288 entweder einen neuen Tumormarker darstellen könnte oder an der Regulation anderer Gene beteiligt ist.

In der vorliegenden Doktorarbeit wurden in zwei Themenkomplexen unterschiedliche Aspekte der genetischen Instabilität und ihre Bedeutung für die frühe Tumorentstehung untersucht. Die Basis für den ersten Themenkomplex bildeten Knockoutstudien, die gezeigt hatten, dass der Ausfall der regulativen Gene hSecurin und hCDC4 in diploiden kolorektalen MIN Zelllinien chromosomale Instabilität (CIN) auslösen kann. In der vorliegenden Arbeit konnte an Langzeitstudien dieser Knockoutzellen mit zytogenetischen und immunhistochemischen Methoden erstmalig nachgewiesen werden, dass der CIN-Phänotyp in beiden Zelllinien nur ein transienter Effekt ist. Mittels biochemischer und Genexpressionsanalysen wurden Hinweise auf Backup Mechanismen gewonnen, die die genomische Integrität beim Ausfall von Securin schützen könnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Bedeutung der "CIN-Gene" hCDC4 und hSecurin für die frühe Tumorentstehung in Frage und weisen auf bisher weitgehend unerforschte redundante Systeme hin. Diese Systeme sollten in weiterführenden funktionellen Studien näher untersucht werden, da sie Einblicke in das komplexe Zusammenspiel regulativer Gene während der Zellteilung geben und möglicherweise eine Bedeutung für therapeutische Ansätze haben. In einem zweiten Themenkomplex der vorliegenden Dissertation wurden vergleichende Genexpressionsanalysen von kolorektalen Zelllinien mit Mikrosatelliteninstabilität (MIN) und kolorektalen Zelllinien mit chromosomaler Instabilität (CIN) durchgeführt. Hierbei wurden nicht nur Markergene identifiziert, die die beiden Klassen trennen, sondern auch Hinweise auf Kandidatengene gefunden, die eine Rolle bei der Erhaltung der chromosomalen Stabilität in kolorektalen Zellen spielen könnten. Diese Gene sollen in Zukunft mittels siRNA- und biochemischen Analysen näher untersucht werden. Darüberhinaus wären Expressionsvergleiche mit normalen kolorektalen Zelllinien interessant, um die Klassen CIN und MIN näher zu charakterisieren. Auch das Ausmaß der chromosomalen Instabilität von CIN- und MIN-Zellen im Gewebeverband ist ein weitgehend unerforschtes Gebiet. Weiterführende Analysen zu diesem Thema wären ein wichtiger Schritt für das Verständnis der frühen Tumorentwicklung.

Während der T-Zell-abhängigen Immunantwort bilden die aktivierten B-Lymphozyten das Keimzentrum, in dem Klassenwechselrekombination und somatische Hypermutation stattfinden. Der Mechanismus dieser Prozesse ist besonders im Falle der somatischen Hypermutation noch weitgehend unbekannt. Als essentieller Faktor konnte bisher die Aktivierungsinduzierte Cytidindeaminase AID identifiziert werden, die über Läsionen Mutationen und eventuell auch DNA-Doppelstrangbrüche in die DNA einführen kann. Da DNA-Brüche für die Zelle potentiell gefährlich sind, ist eine sehr stringente Regulation der DNA-Reparatur besonders in B-Zellen notwendig, denn eine fehlgeleitete Reparatur in B-Zellen kann zur Tumorentstehung beitragen. Prinzipiell haben die Zellen zwei Möglichkeiten DNA-Doppelstrangbrüche zu reparieren: die nicht homologen Endverknüpfung und die homologe Rekombination. Letztere unterteilt sich in die fehlerfreie konservative und die potentiell aberrante nicht konservative Rekombination. In dieser Arbeit wurde die Regulation und Aktivität der Doppelstrangbruchreparatur, im Besonderen der homologen Rekombination, in B-Zellen untersucht. Diese Analysen sollten Aufschluss über eine mögliche Beteiligung dieses Prozesses an der somatischen Hypermutation geben und ergründen, wie B-Zellen auf die AID-abhängigen DNA-Läsionen reagieren. Eine Analyse der Expression von Doppelstrangbruchreparaturfaktoren in primären B-Zellen und B-Lymphomzelllinien ergab eine erhöhte Expression dieser Faktoren in Keimzentrums-B-Zellen, die unter Anderem auf eine proliferationsgekoppelten Regulation der Reparaturgene zurückzuführen ist. Auffällig war besonders die differentielle Expression des Rekombinationsfaktors Rad51 in den Zelllinien. Die Bestimmung der Aktivität der homologen Rekombination in diesen Zellen mit Hilfe eines extrachromosomalen Reporters, der auf zwei hintereinander liegenden nicht funktionellen GFP-Genen basiert, zeigte eine Hyperrekombinationsaktivität für einige Zelllinien. In einem Tetracyclin regulierbaren System konnte transkriptionsgekoppelte Hyperrekombination gezeigt werden, die mit AID-Expressionsmengen korreliert. Es handelt sich dabei um fast ausschließlich nicht konservative Rekombination. Eine Nutzung der konservativen Rekombination konnte mit Rad51-Expressionsmengen korreliert werden. Eine Überexpression von AID bewirkte eine Erhöhung der Rekombinations- und der Hypermutationsaktivität. Folglich führt AID wahrscheinlich eine erhöhte Anzahl von Brüchen in die DNA ein, während Rad51 Einfluss auf die Wahl des Rekombinationsweges nehmen kann. In den reparierten GFP-Genen konnten keine Mutationen gefunden werden. Somit ist die Rekombinationsaktivität wohl eher eine Folge der AID-induzierten Brüche, als ein an der somatischen Hypermutation direkt beteiligter Weg. Die präferentielle Nutzung nicht konservativer Rekombination in den B-Lymphomzelllinien weist auf mögliche Folgen oder auch Ursachen der Lymphomentstehung hin oder ist eine von den Keimzentrumsprozessen geforderte physiologische Bedingung in Keimzentrums-B-Zellen, um einen Beitrag zur Antikörper-Diversifizieung zu leisten. Diese Fragen könnten durch weitere Untersuchungen geklärt werden, die die Rolle von AID in der Induktion der Rekombination betreffen und den Einfluss von Rad51 auf die Rekombinationswege.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert primäre humane B-Zellen und kann deren unbegrenzte Proliferation induzieren. Dieser Prozess der Wachstumstransformation von B–Zellen ist ein Modellsystem, das die pathogenen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 1 (EBNA1) wurde als essentiell für den Prozess der Wachstumstransformation primärer humaner B-Lymphozyten beschrieben, weil es an der latenten Replikation über den viralen Replikations-Ursprung oriP, der extrachromosomalen Erhaltung des Virus-Episoms und der transkriptionellen Trans-aktivierung der latenten Gene beteiligt ist (Rickinson und Kieff, 2001). Dieses Postulat wurde nie experimentell untersucht, da die genetische Analyse mit den bisherigen Methoden nicht möglich war. Das Maxi-EBV-System macht das Genom von EBV einer genetischen Manipulation zugänglich und erlaubt auch die Herstellung von Viren, denen essentielle Gene fehlen (Delecluse et al., 1998). Ein Ziel meiner Doktorarbeit war die Herstellung und Analyse eines EBNA1-negativen Virus. Entgegen der Lehrmeinung war es mit EBNA1-negativem Maxi-EBV möglich, wachstums-transformierte Zellklone nach Infektion von primären humanen B-Lymphozyten zu etablieren. Das virale Genom war in sämtlichen erhaltenen lymphoblastoiden Zelllinien so integriert, dass alle untersuchten latenten EBV-Proteine exprimiert wurden. Meine Ergebnisse zeigen eindeutig, dass EBNA1 prinzipiell für die Wachstumstransformation entbehrlich ist. Mit EBNA1-positiven Viren werden die primären B-Zellen jedoch mindestens um den Faktor 10.000 besser wachstumstransformiert. Da EBNA1 den episomalen Status des Virusgenoms vermittelt, scheint die Etablierung des EBV-Genoms in infizierten Zellen der limitierende Schritt zu sein. Auch in vivo im SCID-Maus-Modell erwies sich EBNA1 als entbehrlich für die Tumorbildung, womit es nicht als essentielles Onkogen von EBV betrachtet werden kann. Ein weiterer im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchter Aspekt war die Frage, ob EBNA1 für die extrachromosomale Erhaltung und Replikation des EBV-Episoms durch heterologe Genprodukte ersetzt werden kann. Zu diesem Zweck wurden Fusionsproteine aus der DNA-Bindedomäne von EBNA1 mit den zellulären Proteinen Histon H1 bzw. HMG-I (Mitglied der hoch mobilen Protein-Gruppe) hergestellt. Ich konnte zeigen, dass HMG-I:EBNA1- und H1:EBNA1-Fusionsproteine in der Lage sind, kleine oriP-enthaltende Plasmide und Maxi-EBVs episomal zu erhalten und die zelluläre Replikations-Maschinerie zu rekrutieren. Zusätzlich dazu unterstützen die Fusionsproteine im EBNA1-negativen Maxi-EBV die Produktion infektiöser Viren. Für ein konditional regulierbares Vektorsystem wurden Fusionsproteine aus der EBNA1-Transaktivierungsdomäne und der DNA-Bindedomäne des Tet-Repressors (TetR) hergestellt. Diese Proteine sollten mit Tet-Operator-Sequenzen (TetO, TetR-Bindemotiv) interagieren, die multimerisiert auf oriP-basierte Vektoren kloniert wurden. Dadurch sollte die Erhaltung der oriP-basierten Vektoren in der Zelle konditional regulierbar gestaltet werden. Es gelang in dieser Doktorarbeit zum ersten Mal ein System zu etablieren, mit dem Plasmide episomal erhalten werden und bei Zugabe von Doxyzyklin konditional regulierbar verloren gehen. Dieses erstmals realisierte konditional regulierbare Vektorsystem schafft neue Wege, die virale und zelluläre Replikation genauer zu untersuchen. Außerdem öffnen sich Möglichkeiten für eine sicherere Gentherapie, da die viralen Anteile auf ein Minimum reduziert werden können. Mit einem solchen System könnten EBV-Genvektoren in B-Zellen eingeführt werden und nach Expression des auf dem Vektor kodierten, therapeutischen Gens könnte die Genfähre durch Tetrazyklin-Applikation wieder aus dem Patienten entfernt werden.

EBV wird ätiologisch mit der Entstehung verschiedener Tumoren in Zusammenhang gebracht. Inwieweit eine EBV-Infektion die zellulären Funktionen in humanen primären B-Lymphozyten zu einem frühen Zeitpunkt der EBV-Infektion beeinflusst, wurde mittels Proteomanalysen untersucht. Die identifizierten Proteine wurden in Einklang mit einer evtl. Tumorentstehung gebracht. Es zeigte sich, dass diese Proteine v.a. die Proliferation der B-Lymphozyten steigerten.

Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen und induziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der B-Zell-Immortalisation ist ein Modellsystem, das die pathogenetischen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. In vitro gilt das virale latente Membranprotein 1 (LMP1) für die Immortalisation von B-Zellen als essentiell. LMP1 ist ein integrales Membranprotein, das als konstitutiv aktivierter Pseudorezeptor verschiedene Signalwege in der B-Zelle induziert und dabei analoge Funktionen zum zellulären CD40-Rezeptor wahrnimmt. Das Genom des EBV ist in dem Maxi-EBV-System einer genetischen Manipulation zugänglich. Zuerst habe ich verschiedene Mutanten des LMP1 Gens im Kontext des EBVGenoms etabliert und auf ihren Phänotyp untersucht. Überraschenderweise war es möglich, mit allen LMP1 mutierten EBVs proliferierende B-Zellklone zu generieren, dies gelang sogar mit einer „knock out“ Mutante des kompletten LMP1 Gens. Die zehn verschiedenen LMP1- Mutanten unterschieden sich gravierend in ihrer Effizienz, B-Zellen zu immortalisieren. So wurden bis zu 100 mal mehr Virionen benötigt, um z.B. mit der LMP1-„knock out“-Mutante proliferierende B-Zellklone zu etablieren. Eine solche B-Zelllinie wies in einem in vivo Experiment mit SCID-Mäusen im Gegensatz zu B-Zelllinien mit Wildtypvirus kein onkogenes Potential auf. Im Widerspruch zu den bisherigen Veröffentlichungen einer anderen Gruppe zeigen meine Ergebnisse, dass LMP1 für den Prozess der B-Zell-Immortalisation in vitro zwar kritisch, aber nicht zwingend notwendig ist. Für die Onkogenität von EBV in vivo ist LMP1 dagegen absolut essentiell. Die Zielgene des LMP1, die die verschiedenen Effekte wie B-Zell-Immortalisation, Onkogenität und Tumorentstehung vermitteln, sind nicht vollständig bekannt. Ein zweites Ziel dieser Arbeit war deshalb die umfassende Katalogisierung dieser Zielgene. Da LMP1 und der CD40-Rezeptor analoge Funktionen und gemeinsame Signalmediatoren und -wege aufweisen, sollten vergleichende Untersuchungen von LMP1- und CD40-regulierten Genen durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurde ein konditionales LMP1-System in humanen B-Zellen etabliert, das es erlaubt, LMP1-Signaltransduktion innerhalb eines sehr kurzen, definierten Zeitraums zu induzieren und differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Da der CD40-Rezeptor auf humanen B-Zellen konstitutiv exprimiert ist und durch Interaktion mit seinem Liganden aktiviert werden kann, konnte die Analyse CD40-regulierter Zielgene im selben Zellsystem erfolgen. Unter Anwendung von ATLAS Array-Filtern und Affymetrix Chips wurden 144 LMP1- und 28 CD40-regulierte Gene identifiziert. Schließlich konnte in Zellzyklusanalysen gezeigt werden, dass LMP1-Signale in humanen B-Zellen echte proliferative Effekte vermitteln und nicht nur anti-apoptotische Funktionen erfüllen.