Podcasts about immundiagnostik

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.

Die Toxocariasis des Menschen ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit. Die Übertragung erfolgt auf fäkal-oralem Weg durch Aufnahme von Wurmeiern, die von den natürlichen Wirten - Hunden und Füchsen - ausgeschieden werden. Die Pathologie wird durch Wanderung, Lokalisation, Anzahl der Larven und durch die Intensität der Abwehrreaktion des Wirtes bestimmt. Diese bedingt beim Menschen, der eigentlich Fehlwirt ist, ein klinisch sehr variables Erscheinungsbild. Unterschieden werden können das klinisch meist schwerwiegendere okuläre und das klinisch eher polymorphe viszerale Larva migrans-Syndrom. Aber nicht nur die klinische Diagnostik angesichts unterschiedlich häufiger und unterschiedlich ausgeprägter klinischer und laborchemischer Befunde und Symptome erscheint schwierig. Der Nachweis der Larve im Biopsat oder Punktat kann nur selten geführt werden, so dass der Immundiagnostik eine besondere Bedeutung zukommt. Die Aussagekraft der Antikörpernachweismethoden, wie der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder der Enzyme-linked Immunoelectrotransfer Blot (EITB) mit dem exkretorisch/sekretorischen (E/S) Antigen der Zweitlarve werden durch den fehlenden Goldstandard, durch die Kreuzreaktionen mit Antigenen verwandter Helminthen oder auch mit weit verbreiteten Antigenen wie dem Phosphorylcholin (PC) und durch den Durchseuchungstiter eingeschränkt. Da sich der IgG4-ELISA bereits in der Immundiagnostik anderer Helminthosen, wie den Filariosen und Echinokokkosen bewährt hat, erschien die Untersuchung des IgG4-ELISA auch bei einer Toxocariasis ein sinnvoller Ansatz zur Verbesserung der Diagnostik. Auf der Basis des bereits etablierten IgG-ELISA wurde daher ein IgG4-ELISA getestet. Als Untersuchungsmaterial standen uns 4298 Patientenseren mit dem Verdacht auf eine Toxocariasis, 59 kreuzreagierende Seren von Patienten mit einer nachgewiesenen anderen Helminthose und 997 Blutspenderseren zur Verfügung. Diese drei Kollektive wurden mit dem IgG-ELISA auf Antikörper gegen T.canis getestet. Auswahlkriterium war ein Antikörpertiter >100 Antikörpereinheiten (AKE). Das erste Kollektiv reduzierte sich dadurch auf 427 Seren. An Hand von 22 histologisch nachgewiesenen und publizierten Toxocariasis-Fällen haben wir ein klinisches Scoresystem entwickelt und konnten schließlich aus den 427 Patienten 100 gemäß Kriterien der CDC in eine Gruppe mit 43 wahrscheinlichen und eine Gruppe mit 57 möglichen Toxocariasis-Fällen einteilen. Für die Evaluation des IgG4-ELISA standen somit schließlich 100 Seren von Personen mit dem Verdacht einer Toxocariasis zur Verfügung. An Hand des Auswahlkriteriums reduzierte sich das zweite Kollektiv von 59 auf 18, und das dritte Kollektiv von 997 auf 24 Personen. Die Untersuchung dieser Kollektive schließlich mit dem IgG4-ELISA ergab: 33% positive Ergebnisse bei den Seren von Patienten mit dem Verdacht einer Toxocariasis (ohne Unterschied zwischen den beiden klinischen Gruppen), 17% bei den Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose und 21% bei den Blutspenderseren. Das bedeutet, dass nach Untersuchung mit zwei Testverfahren (IgG- und IgG4-ELISA) die Anzahl positiver Befunde bei den Patienten mit Verdacht einer Toxocariasis doppelt so groß wie bzw. um mehr als ein Drittel größer ist als bei den anderen Kollektiven. Ein positiver Befund in beiden Testverfahren kann somit als Indikator für eine Toxocariasis dienen und stellt zusammen mit klinischen und laborchemischen Befunden und Symptomen das beste Verfahren zur Diagnostik einer Toxocariasis dar, zumal bei den anderen beiden Kollektiven Blutspenderseren, Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose) keine Assoziation zwischen den Testverfahren, laborchemischen und klinischen Befunden und Symptomen besteht. Der IgG4-ELISA trägt hierbei, wie die Untersuchungen zeigen, zu einer Verbesserung v.a. der Spezifität der serologischen Untersuchungen bei.

Die Toxocariasis des Menschen ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit. Die Übertragung erfolgt auf fäkal-oralem Weg durch Aufnahme von Wurmeiern, die von den natürlichen Wirten - Hunden und Füchsen - ausgeschieden werden. Die Pathologie wird durch Wanderung, Lokalisation, Anzahl der Larven und durch die Intensität der Abwehrreaktion des Wirtes bestimmt. Diese bedingt beim Menschen, der eigentlich Fehlwirt ist, ein klinisch sehr variables Erscheinungsbild. Unterschieden werden können das klinisch meist schwerwiegendere okuläre und das klinisch eher polymorphe viszerale Larva migrans- Syndrom. Aber nicht nur die klinische Diagnostik angesichts unterschiedlich häufiger und unterschiedlich ausgeprägter klinischer und laborchemischer Befunde und Symptome erscheint schwierig. Der Nachweis der Larve im Biopsat oder Punktat kann nur selten geführt werden, so dass der Immundiagnostik eine besondere Bedeutung zukommt. Die Aussagekraft der Antikörpernachweismethoden, wie der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder der Enzyme-linked Immunoelectrotransfer Blot (EITB) mit dem exkretorisch/sekretorischen (E/S) Antigen der Zweitlarve werden durch den fehlenden Goldstandard, durch die Kreuzreaktionen mit Antigenen verwandter Helminthen oder auch mit weit verbreiteten Antigenen wie dem Phosphorylcholin (PC) und durch den Durchseuchungstiter eingeschränkt. Da sich der IgG4-ELISA bereits in der Immundiagnostik anderer Helminthosen, wie den Filariosen und Echinokokkosen bewährt hat, erschien die Untersuchung des IgG4-ELISA auch bei einer Toxocariasis ein sinnvoller Ansatz zur Verbesserung der Diagnostik. Auf der Basis des bereits etablierten IgG-ELISA wurde daher ein IgG4-ELISA getestet. Als Untersuchungsmaterial standen uns 4298 Patientenseren mit dem Verdacht auf eine Toxocariasis, 59 kreuzreagierende Seren von Patienten mit einer nachgewiesenen anderen Helminthose und 997 Blutspenderseren zur Verfügung. Diese drei Kollektive wurden mit dem IgG-ELISA auf Antikörper gegen T.canis getestet. Auswahlkriterium war ein Antikörpertiter >100 Antikörpereinheiten (AKE). Das erste Kollektiv reduzierte sich dadurch auf 427 Seren. An Hand von 22 histologisch nachgewiesenen und publizierten Toxocariasis-Fällen haben wir ein klinisches Scoresystem entwickelt und konnten schließlich aus den 427 Patienten 100 gemäß Kriterien der CDC in eine Gruppe mit 43 wahrscheinlichen und eine Gruppe mit 57 möglichen Toxocariasis-Fällen einteilen. Für die Evaluation des IgG4-ELISA standen somit schließlich 100 Seren von Personen mit dem Verdacht einer Toxocariasis zur Verfügung. An Hand des Auswahlkriteriums reduzierte sich das zweite Kollektiv von 59 auf 18, und das dritte Kollektiv von 997 auf 24 Personen. Die Untersuchung dieser Kollektive schließlich mit dem IgG4-ELISA ergab: 33% positive Ergebnisse bei den Seren von Patienten mit dem Verdacht einer Toxocariasis (ohne Unterschied zwischen den beiden klinischen Gruppen), 17% bei den Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose und 21% bei den Blutspenderseren. Das bedeutet, dass nach Untersuchung mit zwei Testverfahren (IgG- und IgG4-ELISA) die Anzahl positiver Befunde bei den Patienten mit Verdacht einer Toxocariasis doppelt so groß wie bzw. um mehr als ein Drittel größer ist als bei den anderen Kollektiven. Ein positiver Befund in beiden Testverfahren kann somit als Indikator für eine Toxocariasis dienen und stellt zusammen mit klinischen und laborchemischen Befunden und Symptomen das beste Verfahren zur Diagnostik einer Toxocariasis dar, zumal bei den anderen beiden Kollektiven (Blutspenderseren, Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose) keine Assoziation zwischen den Testverfahren, laborchemischen und klinischen Befunden und Symptomen besteht. Der IgG4-ELISA trägt hierbei, wie die Untersuchungen zeigen, zu einer Verbesserung v.a. der Spezifität der serologischen Untersuchungen bei.