Podcasts about pcr methode

In dieser Folge meiner Schulreihe geht es um die PCR - Methode, welche bei Kriminalfällen eingesetzt wird. Hier wird die DNA im Reagenzglas gezielt Vervielfältigt. Ich würde mich über ein LIKE und ein ABBO sehr freuen. Danke fürs zuhören und viel Spaß beim lernen! Instagram: adg.offiziell

Die gebräuchliche Therapie gegen Milzbrand besteht aus der Gabe von Antibiotika. Als Therapie der Wahl gilt hierbei das Fluorochinolon Ciprofloxacin. Resistenzen gegen dieses Antibiotikum wurden bei B. anthracis in vivo noch nicht, in vitro jedoch im Rahmen mehrerer Studien beschrieben. Es existieren herkömmliche Resistenztests, wie der Gradientendiffusions- oder der Mikrodilutionstest, welche bei einer Milzbranderkrankung genutzt werden können. Diese nehmen jedoch aufgrund der kulturellen Anzucht in einem Labor der Schutzstufe 3 vor der Durchführung des Tests ein bis zwei Tage Zeit in Anspruch. Um diese Zeitspanne zu verkürzen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Schnelltests entwickelt. Diese basieren auf einer real-time-PCR Methode, mit welcher Ciprofloxacin-Resistenz verursachende Punktmutationen (= SNPs), nachgewiesen werden. Im ersten Abschnitt dieser Studie wurde der B. cereus Stamm ATCC10987 resistent gegen Ciprofloxacin generiert. Aufgrund der Dual-Use-Research-of-Concern-Problematik wurde dieser, wenig pathogene, aber genotypisch sehr nah mit B. anthracis verwandte, BSL-2-Organismus verwendet. Die Resistenzbildung erfolgte durch natürliche Selektion, indem der B. cereus Wildtyp mehrfach auf Ciprofloxacin-haltigen Agar-Platten, welche eine steigende Konzentration des Antibiotikums enthielten, angezüchtet wurde. Es folgte eine Sequenzierung der Quinolone Resistance Determinig Region (= QRDR), bestehend aus den Genen gyrA, gyrB, parC und parE, von neun B. cereus Mutanten, welche CIP-Resistenzen entwickelt hatten. Eine der Mutanten besaß einen SNP im Gen gyrA an Stelle 254 mit einer Mutation der Base Cytosin in ein Thymin. Solche SNPs stellen eine mögliche Ursache der Resistenz gegen Fluorochinolone dar. Acht der B. cereus Mutanten besaßen jedoch keine SNPs in der QRDR. Die Ursache für deren Resistenz wird in der erhöhten Funktion von Effluxpumpen vermutet. Im zweiten Teil der Studie wurden die Schnelltests entwickelt. Es wurden mehrere Protokolle für die beiden real-time-PCR Methoden TaqMan® und MeltMAMA (= Melt Analysis of Mismatch Amplification Mutation Assays) erstellt und getestet. Der Vergleich beider Methoden wertete den TaqMan® als die Methode der Wahl für die gesetzte Zielstellung. Daraufhin wurden für acht bekannte Ciprofloxacin-Resistenzen auslösende SNPs TaqMan®-Protokolle entwickelt. Im Abschluss wurden diese durch Versuche mit verschiedenen B. anthracis Stämmen, dem B. cereus ATCC10987 Wildtyp und seinen Mutanten, synthetisch hergestellten Templates, die als Mutationskontrollen genutzt wurden, sowie verschiedenen Bacillus Spezies hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität erprobt. Es wurden acht TaqMan® Protokolle erarbeitet, welche SNPs in der QRDR von B. anthracis nachweisen und somit eine schnelle Diagnose vieler Ciprofloxacin-resistenter Stämme gewährleisten. Der Einsatz dieser Schnelltests zusätzlich zu den herkömmlichen Empfindlichkeitstests gibt die Möglichkeit eine optimale Therapie von Milzbrandinfektionen in einem verkürzten Zeitraum zu gewährleisten.

In der Literaturübersicht wird der derzeitige Kenntnisstand zum epizootischen ulzerativen Syndrom (EUS), einer Erkrankung bei zahlreichen Süß- und Brackwasserfischen, die sich innerhalb kurzer Zeit in vielen Teilen der Welt ausgebreitet hat und eine potentielle Bedrohung für europäische Süß- und Brackwasserfische darstellt, zusammengefasst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zuallererst, eine PCR-Methode geeignet zum Nachweis von Aphanomyces invadans direkt aus erkrankten Fischen zu entwickeln, und weiterhin, die Empfänglichkeit ausgewählter Süßwasser-fischarten, die von Bedeutung für die europäische Aquakultur sind, gegenüber diesem Erreger zu untersuchen. Hierzu wurde eine Semi-Nested PCR-Methode angewandt, die Teile der ITS-Region amplifiziert (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen). Die PCR-Methode erwies sich sowohl als hochspezifisch gegenüber allen untersuchten Aphanomyces invadans-Stämmen als auch hochsensitiv. Die Spezifität wurde unter Einsatz von DNA verschiedener Oomyceten, anderer relevanter Pathogene und Kommensalen sowie Wirts-DNA in die PCR untersucht. Die untere Nachweisgrenze der Semi-Nested PCR lag bei Einsatz von genomischer DNA aus Mycel bei 25 fg und bei Einsatz von Aphanomyces invadans-Zoosporen in die DNA-Extraktion bei 0,025 Zoosporen. Um die PCR-Methode an diagnostischen Proben zu testen, wurden Infektionsversuche durchgeführt. Hierzu wurden Blaue Fadenfische (Trichogaster trichopterus) und drei in Deutschland wirtschaftlich bedeutsame Fischarten ausgewählt: Regenbogenforellen (Oncorynchus mykiss), Europäische Welse (Silurus glanis) und Europäische Aale (Anguilla anguilla). 36 Fischen von jeder der vier Spezies wurde intramuskulär eine Aphanomyces invadans-Sporensuspension injiziert. Während eines Versuchszeitraumes von 35 Tagen wurden laufend Fische zu vorher festgelegten Entnahmezeitpunkten euthanasiert, auf Hautveränderungen untersucht und Probenmaterial aus dem Injektionsbereich für die PCR-Untersuchung und eine histopathologische Untersuchung entnommen. Die Fadenfische und die Welse zeigten im Versuchsverlauf deutlich sichtbare, teilweise ulzerative Hautläsionen. Während bei der histopathologischen Untersuchung der Fadenfische die EUS-typischen mykotischen Granulome, die die Hyphen umschlossen, auftraten, konnten bei den Welsen zwar zahlreiche Hyphen nachgewiesen werden, die Entzündungreaktion bestand hier jedoch aus einer losen Anordnung von Makrophagen, wenigen Lymphozyten und Riesenzellen. Bei den Regenbogenforellen traten nur geringgradige, bei keinem Tier ulzerative Hautveränderungen auf. Nur bei vier Regenbogenforellen konnten die EUS-typischen mykotischen Granulome nachgewiesen werden. Keiner der Aale wies makroskopisch sichtbare Hautveränderungen auf mit Ausnahme eines Aals mit einer geröteten Injektionsstelle, der an Tag 2 post infectionem entnommen wurde. Bei diesem Tier konnten mit Hilfe der Grocott-Reaktion lokalisiert einzelne Hyphen sichtbar gemacht werden. Das Auftreten mykotischer Granulome oder einer zellulären Wirtsreaktion konnte bei den Aalen nicht beobachtet werden. Die PCR-Methode wurde für den Nachweis von Aphanomyces invadans aus den Fischen der Infektionsversuche angewandt. Der Erregernachweis gelang bei allen Fischen, die makroskopisch sichtbare Hautläsionen zeigten. Bei den Fadenfischen und den Welsen gelang der Erregernachweis bei allen Versuchsgruppen ab dem ersten Entnahmezeitpunkt an Tag 1 p. i. Die Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Methode sich für den Nachweis von Aphanomyces invadans bei erkrankten Fischen eignet. Zur Empfänglichkeit von Europäischen Welsen und Aalen lagen bisher keine Daten vor. Die Ergebnisse der Infektionsversuche liefern klare Hinweise dafür, dass Europäische Welse gegenüber dem EUS empfänglich sind, während Aale nicht und Regenbogenforellen nur geringgradig empfänglich zu sein scheinen.

Die Lyme-Borreliose, ausgelöst durch den Erreger B. burgdorferi s.l., ist die häufigste von Zecken übertragene Infektionserkrankung der nördlichen Hemisphäre. Der B. burgdorferi s.l. Komplex besteht mittlerweile aus mindestens elf definierten Spezies. In Europa ist für die drei Spezies B. burgdorferi s.s., B. afzelii und B. garinii eine Humanpathogenität gesichert, für B. valaisiana wird sie zumindest vermutet. Anhand des Oberflächenproteins OspA wurden für Europa mindestens sieben verschiedene OspA-Typen definiert. Die Spezies B. burgdorferi s.s. und B. afzelii sind homogen in ihrem OspA-Typ und entsprechen Typ 1 und 2. Die Spezies B. garinii hingegen ist wesentlich heterogener und lässt sich in fünf OspA-Typen (3 bis 7) differenzieren. Die Heterogenität der Borrelien in Europa hat wichtige Implikationen für die Pathogenitätsforschung (u. a. Organotropsimus), da verschiedene Spezies bzw. OspA-Typen möglicherweise mit unterschiedlichen klinischen Manifestationsformen der Lyme-Borreliose assoziiert sind. Außerdem beeinflusst die Heterogenität maßgeblich die Entwicklung von einem europäischen Impfstoff und von diagnostischen und epidemiologischen Testsystemen. Valide Daten zur Verteilung der Spezies und OspA-Typen sind somit Vorraussetzung für derlei Entwicklungen. Jedoch ist das bisher vorhandene Datenmaterial, besonders in Bezug auf die Verteilung der OspA-Typen, sehr begrenzt, was möglicherweise auch an dem hohen Aufwand und den Kosten bisher beschriebener Differenzierungsmethoden liegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einfache und zuverlässige OspA-PCR basierende Methoden entwickelt die einen sensitiven Nachweis und eine Differenzierung aller in Europa relevanten B. burgdorferi s.l. Spezies erlauben. Im Gegensatz zu vielen bisher veröffentlichten PCR Protokollen wurde die Sensitivität der Methoden mit einem umfangreichen Panel von 9 B. burgdorferi s.l. Stämmen der verschiedenen Subtypen evaluiert und die Spezifität durch Testung von 18 verwandten Spirochäten abgesichert. Nur so kann bei der Heterogenität der Borrelien die Sensitivität und Spezifität einer PCR ausreichend evaluiert werden. Die hier entwickelte RFLP Analyse erlaubt eine Differenzierung aller in Europa relevanten Spezies und zusätzlich der fünf OspA-Typen von B. garinii. Sie stellt somit ein ideales Werkzeug für notwendige epidemiologische Untersuchungen zur Heterogenität von B. burgdorferi s.l. in Europa dar. Im Weiteren ist, im Gegensatz zu vielen etablierten Typsisierungsmethoden, eine zuverlässige Differenzierung von Doppelinfektionen möglich, wie sie in Zecken und klinischem Material schon mehrfach beschrieben sind. Die entwickelte Multiplex-PCR erlaubt eine schnelle und sehr einfache Differenzierung der klinisch relevanten Spezies B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. garinii und B. valaisiana in einem Reaktionsansatz. Sie stellt das erste beschriebene Multiplex-PCR-Protokoll zur Differenzierung von B. burgdorferi s.l dar. Der LightCycler ist eine schnelle, moderne real-time-PCR Methode. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein LightCycler-Protokoll entwickelt, das eine Differenzierung der in Europa relevanten Spezies und mit Einschränkungen auch der verschiedenen OspA-Typen von B. garinii erlaubt. In einer Pilotstudie wurde die Verteilung von Borrelia-Spezies und OspA-Typen in Zecken und in klinischem Material untersucht. Die Borrelienpopulationen aus den Zecken der verschiedenen Sammelgebiete zeigten eine ausgeprägte Mikro- und Makroheterongenität, wobei aufgrund der Inkonstanz der Verteilungsmuster über die Zeit keine lokalen Vorhersagen über das Vorkommen einzelner Subtypen gemacht werden konnten. Ein interessanter Befund war die hohe fokale Prävalenz von OspA-Typ 4 in einem Gebiet, da diesem OspA-Typ möglicherweise eine herausragende pathogenetische Bedeutung zukommt und er bisher nur selten in Zecken gefunden wurde. Die Differenzierung von Borrelien aus klinischem Material erlaubt Rückschlüsse auf wichtige pathogenetische Zusammenhänge und Assoziationen. Bei den durchgeführten Untersuchungen konnte eine Assoziation von B. afzelii mit kutanen Manifestationen der Lyme-Borreliose bestätigt werden. Bei der Differenzierung von Isolaten von Patienten mit Neuroborreliose zeigte sich wie schon in vorangegeangenen Studien eine Dominanz der Spezies B. garinii und auf der Ebene der OspA-Typen Verteilung interessante Unterschiede in der in Bezug auf das Alter der untersuchten Patienten. Insgesamt wurde in dem untersuchten Material neben B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. valaisiana und allen fünf OspA-Typen von B. garinii auch die Genospezies Borrelia A14S sowie B. bissettii detektiert. Borrelia A14S stellt eine erst kürzlich beschriebene neue Genospezies von B. burgdorferi s.l. dar, deren Verteilung in Europa noch weitgehend unbekannt ist. Der Nachweis von B. bissettii aus einer Liquorprobe ist die erste Beschreibung dieser Spezies in Deutschland und wirft Fragen über ihre - bisher vermutete - Apathogenität auf. Die erhaltenen Prävalenzdaten der verschiedenen Borrelien stellen einen Schritt zur Erarbeitung einer epidemiologischen Basis für die Entwicklung eines zuverlässigen Impfstoffs und diagnostischer und epidemiologischer Testsysteme in Europa dar. Aufgrund der Unterschiede der Borrelienpopulationen in verschiedenen geographischen Regionen sind hierfür aber weitere breitgefächerte Untersuchungen auf dem ganzen Kontinent nötig. Die in dieser Arbeit entwickelten, breit evaluierten und einfachen durchzuführenden Methoden stellen für derlei Untersuchungen eine praktikable methodische Basis dar.

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.