Podcasts about pcr protokolle

Die epitheliotropen Parapockenviren sind Mitglieder der Familie Poxviridae und treten ubiquitär in der Wiederkäuerpopulation auf. Sie verursachen kontagiöse, pustulöse Haut und Schleimhautläsionen, die meist auf den Bereich des Kopfes oder des Euters beschränkt sind (Lokalinfektion). Die Erkrankung verläuft unter Ausprägung milder bis schwerwiegender Symptome und ist i. d. R. durch eine hohe Morbidität, aber geringe Mortalität gekennzeichnet. Derzeit existieren vier in das Genus eingeordnete Virusspezies: ORFV (Schaf und Ziege), PCPV und BPSV (Rind), sowie PVNZ (neuseeländisches Rotwild). Mit Ausnahme von PVNZ konnte eine Übertragung aller Parapockenviren auf den Menschen nachgewiesen werden (Zoonoseerreger). Die Infektion des Menschen führt zum Auftreten lokal begrenzter Hautläsionen, die historisch bedingt als „Melkerknoten“ bezeichnet werden. Nach erfolgter Parapocken Diagnose werden Humaninfektionen unter Vernachlässigung der virusübertragenden Wirtstierspezies meist lapidar als erworbene Tierpocken oder pauschal als PCPV bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde eine einzigartige Kollektion von 21 historischen und aktuellen Parapockenvirus Zellkultur Isolaten von Mensch und Tier (sowie zwei Parapockenvirus DNA Proben aus Schottland) untersucht. Dabei kamen zwei selbstentwickelte diskriminierende PCR Protokolle zur Anwendung, die einen sicheren Nachweis der Parapockenviren erlauben. Die phylogenetische Analyse der DNA Fragmente aus den PCR Ergebnissen ermöglicht die Zuordnung zu einer der etablierten Virusspezies sowie die Rückverfolgung humaner Parapockenvirus Isolate zum animalen Ursprungswirt. Überdies wurden die DNA Genome dreier Virusisolate mittels NGS sequenziert. Um genomische Veränderungen durch in vitro Einflüsse auszuschließen, wurde die Anzahl der Zellkulturpassagen strikt niedrig gehalten. Die sequenzierten Virusgenome offenbarten Parapockenvirus typische Eigenschaften: eine Größe von rund 140 kbp, einen hohen GC Gehalt von 64-65 %, das Vorhandensein eines Sets aus 88 Genen, die innerhalb der Subfamilie Chordopoxvirinae konserviert sind, sowie weiterer 12 Parapockenvirus spezifischer Gene. Die vergleichende Analyse der Genomsequenzen eines korrespondierenden ORFV Paares von Schaf (B015) und Mensch (B029) konnte zeigen, dass das Virus auch nach einer Übertragung auf eine neue Wirtsspezies seine genetische Integrität zu nahezu 100 % bewahrt. Das Auftreten der Parapockenvirusspezies PVNZ war lange Zeit auf Neuseeland beschränkt, obgleich eine weitere Verbreitung, insbesondere auch in Europa, für wahrscheinlich gehalten wurde. Im Rahmen eines Monitorings wurden 1764 Tonsillentupfer von Rotwild im bayerischen Alpenraum untersucht. In 14 (0,79 %) wurde die Präsenz von Parapockenvirus DNA mit einer real time PCR nachgewiesen. Aus einer Probe konnte erfolgreich ein Virus (HL953) in Zellkultur isoliert und seine DNA anschließend sequenziert werden, was in der ersten (nahezu) vollständigen Genomsequenz eines Parapockenvirus vom Rotwild resultierte. Tests auf klassische biologische Eigenschaften sowie die eingehende molekulare Charakterisierung des Virus mit phylogenetischer Analyse anhand von 125 Genen, ermöglichten seine Identifizierung als Vertreter einer eigenen Parapockenvirusspezies beim Rotwild in nächster Verwandtschaftsbeziehung zu PVNZ. Auffälligerweise war ca. ein Viertel aller HL953 ORFs größer als die entsprechenden ORFs in den verwendeten Parapockenvirus Referenzgenomen. Das Fehlen klinischer Symptome beim infizierten Rotwild deutet darauf hin, dass es persistierende, asymptomatische Infektionsverläufe gibt. Hieraus ergibt sich eine weitere potentielle Infektionsquelle für empfängliche Nutztiere und den Menschen.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Erforschung von Yersinia (Y.) pestis in historischem Skelettmaterial. Die Disziplin Paläomikrobiologie verspricht, Beweise zu liefern, die durch die Erforschung moderner Pathogene nicht möglich wären und dadurch möglicherweise das Verständnis zu historischen Infektionen zu verändern (Tsangaras & Greenwood 2012). Yersinia pestis als der Erreger der Pest wird für drei Pandemien der Menschheitsgeschichte verantwortlich gemacht: die Pest der Moderne, den Schwarzen Tod im 14. und den nachfolgenden Jahrhunderten sowie die Pest des Justinian. Diese Dissertation beschäftigte sich mit dem Nachweis und der Typisierung des Pest-Erregers in historischen Individuen verschiedener Fundorte aus den beiden letztgenannten Pandemien. Dazu wurden methodisch zwei Wege beschritten: Der Nachweis des Erregers auf molekulargenetischer Ebene durch die Detektion verschiedener Loci und ein davon unabhängiger alternativer Weg zur Detektion des Pathogens über den Nachweis seines Kapselproteins. Letzten Weg zu beschreiten, ist in dieser Arbeit nicht geglückt. Dafür waren die auf Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) beruhenden Ansätze umso erfolgreicher. Für die Analysen standen Individuen von vier Fundorten in Deutschland und der Schweiz aus unterschiedlichen Zeitstellungen zur Verfügung. Die Skelette des Gräberfelds Aschheim-Bajuwarenring datieren ins 6. Jahrhundert, die Individuen aus Manching-Pichl und Basel ins 14. bis 17. Jahrhundert und die skelettalen Überreste von drei Menschen aus Brandenburg in die Zeit des Dreißigjährigen Kriegs. Nach der Erprobung eines für das zur Verfügung stehende Material optimal geeigneten Extraktions-Protokolls und der Etablierung neuer PCR-Protokolle wurden die Verfahren auf Extrakte alter DNA (aDNA) angewandt. Dabei wurde zur Generierung authentischer Ergebnisse im neu etablierten aDNA-Labor des ArchaeoBioCenters der LMU gearbeitet, das die maximalen Möglichkeiten der Verhinderung von Kontaminationen bereitstellt. Es ist in dieser Arbeit gelungen, bereits publizierte Pest-Nachweise in Skeletten aus Aschheim und Manching-Pichl zu reproduzieren und damit zu validieren. Darüber hinaus konnte in Individuen eines weiteren, bisher molekulargenetisch nicht untersuchten Fundorts in Brandenburg die Anwesenheit der Pest gezeigt werden. Durch tiefer gehende molekulargenetische Untersuchungen anderer Loci sowie Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) wurden die jeweiligen Erreger in einen bereits existierenden phylogenetischen Stammbaum eingeordnet. Durch den Beweis der Anwesenheit der Pest in Aschheim im 6. Jahrhundert wurde das Bakterium Yersinia pestis eindeutig als Verursacher der ersten Pandemie identifiziert – eine Assoziation, die nach anfänglichem Konsens zuletzt in Frage gestellt worden war. Spekulationen um das ätiologische Agens können jetzt definitiv eingestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit beenden auch weitere Diskussionen bezüglich des Biovars des Erregers während der ersten Pandemie. Durch Typisierungen wurde gezeigt, dass es sich bei diesem Erreger um einen anderen handelt als den, der für die zweite oder dritte Pandemie verantwortlich ist. Der Nachweis und die Typisierung des Erregers im Zuge des Schwarzen Todes in Manching-Pichl und Brandenburg schließt die bis dato existierende genauer charakterisierte Detektionslücke in Deutschland. Bisher waren nur in England, Frankreich und den Niederlanden der bzw. die Erreger durch zwei Arbeitsgruppen aus Mainz und Tübingen/Kanada glaubhaft detektiert worden. Der in Deutschland identifizierte Erreger passt dabei zu den Ergebnissen der anderen Fundorte in Europa. Zudem scheint es in Deutschland über einen längeren Zeitraum nur einen Erregertyp gegeben zu haben, da die Ergebnisse der Individuen aus Brandenburg und Manching-Pichl in allen untersuchten Loci genau übereinstimmten. Obwohl aufgrund ungenügenden Quellenmaterials nicht exakt belegbar scheint der Weg der Pest zu diesen beiden letztgenannten Fundorten in Deutschland ein anderer gewesen zu sein als der zu den anderen europäischen Fundorten.

In der vorliegenden Arbeit wurden Real-time PCR-basierte Nachweisverfahren für E. canis und A. phagocytophilum entwickelt, validiert und im Anschluss für die Untersuchung von Patientenproben eingesetzt. Für E. canis wurden für zwei Tests Primer und Sonden des Typs „Molecular Beacon“ konstruiert, die auf unterschiedliche Zielgene gerichtet waren, die Reaktionsbedingungen optimiert und die Leistungsfähigkeit beider Tests verglichen. Die PCR EC-16S hatte hierbei die 16S rDNA als Zielgen, während die PCR ECP-p30 auf das p30-10-Gen von E. canis gerichtet war. Bei der Ermittlung der analytischen Sensitivität und analytischen Spezifität ergab sich, dass beide Tests in ihren Leistungen sehr ähnlich waren. Beide PCRs waren spezifisch und lieferten nur für DNA von E. canis ein positives Ergebnis, während die übrigen getesteten Erreger A. platys, N. risticii, A. phagocytophilum, Babesia canis, B. gibsoni und H. canis in der PCR negativ reagierten. Da die PCR ECP-p30 bei der Sensitivitätsprüfung geringfügig besser beurteilt wurde, wurde entschieden, die weiteren Untersuchungen mit diesem PCR-Protokoll durchzuführen. Zur Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität dieses Tests wurde eine extern kontrollierte Validierung mit geblindeten Proben durchgeführt. Hierbei ergab sich eine diagnostische Spezifität von 100 %. Die diagnostische Sensitivität der Real-time PCR betrug 82 %. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses lag für die PCR ECP-p30 bei 100 %, während der prädiktive Wert des negativen Testergebnisses 87,5 % erreichte Als Nachweisgrenze wurden 14,5 Moleküle des Zielgens pro 50 µl Ansatz ermittelt. Im Anschluss wurde die Eignung des Tests an Blutproben von Hunden aus einem für E. canis endemischen Gebiet untersucht. Dabei wurden 244 Blutproben einbezogen und die Ergebnisse der PCR mit denen eines IFATs verglichen. Die Blutproben stammten aus Kampanien, Italien und wurden dort durch Tierärzte von Hunden gewonnen, die in einer Tierarztpraxis mit angeschlossenem Tierheim vorgestellt wurden. Die Tiere waren drei Gruppen zuzuordnen: Ein Teil der Hunde, und zwar 19 Tiere, wurde von privaten Besitzern in der Praxis vorgestellt, 52 Tiere waren unmittelbar zuvor von der Strasse aufgelesen worden und die dritte Gruppe, die 173 Hunde umfasste, hielt sich zum Zeitpunkt der Probennahme schon längere Zeit im Tierheim auf. Innerhalb des Tierheims wird ein hoher diagnostischer und medikamenteller Aufwand zur Erkennung und Bekämpfung von E. canis mittels antibiotischer Therapie und Zecken¬prophylaxe betrieben. In die Untersuchung einbezogen wurden jedoch nur Hunde, die mindestens drei Monate lang nicht mehr mit einem gegen E. canis wirksamen Medikament behandelt worden waren. Bei der serologischen Untersuchung der Hunde mittels IFAT ergab sich ein Anteil seropositiver Tiere von insgesamt 41,8 %, der auch bei Betrachtung der drei verschiedenen Gruppen nur wenig variierte. So betrug der Anteil seropositiver Tiere innerhalb der Gruppe der Hunde aus dem Tierheim 43,4 %, während 40,4 % der Straßenhunde und 31,6 % der Tiere in privatem Besitz seropositiv waren. Diese Unterschiede waren nicht signifikant. Ein direkter Erregernachweis mittels Real-time PCR erfolgte bei 13,9 % der untersuchten Tiere. Beim Vergleich der Untersuchungsergebnisse von PCR und IFAT wurde eine Überein¬stimmung bei 61,9 % der untersuchten Proben ermittelt. Bei Betrachtung der einzelnen Hundegruppen lag der Anteil der in der PCR positiven Tiere bei den Straßenhunden mit 23,1 % ungefähr doppelt so hoch wie bei den Tieren in Privatbesitz (10,5 %) oder den Tierheim¬hunden im Tierheim (11,6 %). Der Unterschied zwischen den Straßenhunden und den Tierheimhunden war somit signifikant. Diese Ergebnisse weisen auf ein häufiges Vorkommen von E. canis im Untersuchungsgebiet hin und stützen die Auffassung, dass eine Erreger¬elimination mittels Antibiotikatherapie nur schwer zu erreichen ist. Für A. phagocytophilum wurde in der vorliegenden Studie ebenfalls eine Real-time PCR entwickelt und das Testverfahren unter Einbeziehung zweier bereits publizierter Real-time PCR-Protokolle und zwar von Pusterla et al. (1999a) und von Courtney et al. (2004), validiert. Bei der Entwicklung der Real-time PCR für A. phagocytophilum wurde als Zielgen die 16S rDNA herangezogen, da nur hierfür vergleichbare Sequenzen nahe verwandter Ehrlichienspezies verfügbar waren. Alle drei vorliegenden Testverfahren wurden auf ihre analytische Spezifität und ihre analytische Sensitivität überprüft und zusätzlich im Rahmen einer extern kontrollierten Validierung mittels geblindeter Proben verglichen. Hierbei zeigte sich, dass nur die PCR nach Courtney et al (2004), hier als PCR AP-MSP2 bezeichnet, eine sehr gute Spezifität für A. phagocytophilum besaß. Die anderen Tests lieferten auch für N. risticii und A. platys positive Ergebnisse. Die analytische Sensitivität war bei diesem Test ebenfalls um mindestens eine Zehnerpotenz höher als bei den anderen beiden PCRs. Im Rahmen der Validierung wurde für die PCR AP-MSP2 eine diagnostische Spezifität von 96 % ermittelt, während die im Rahmen dieser Studie entwickelte PCR AP-16S eine Spezifität von 64 % und die PCR nach Pusterla et al. (1999a) einen Wert von 36 % erreichten. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses betrug für die drei PCRs somit 96 %, 74 % bzw. 61 %. Für die Untersuchung von Patientenproben auf Befall mit A. phagocytophilum wurde deshalb die PCR AP-MSP2 ausgewählt. In die Studie wurden Hunde aus Deutschland einbezogen, und zwar sowohl 72 Blutproben, die eigens für diese Studie auf Anforderung von Tierärzten eingesandt worden waren, als auch 133 Proben, die aus verschiedensten Gründen in das Routinelabor des Institutes eingesandt worden waren. Die 72 eigens für die Studie gewonnenen Proben wurden mittels Buffy-coat-Ausstrich, PCR und IFAT auf A. phagocytophilum untersucht. Lichtmikroskopisch konnten in keinem Fall Einschluss¬körperchen des Erregers in den Granulozyten nachgewiesen werden. Mittels PCR wurde jedoch bei einem Hund (1,4 %) der Nachweis von A. phagocytophilum erbracht. Im IFAT konnten bei 16,7 % der 72 untersuchten Hundeseren spezifische Antikörper gegen den Erreger nachgewiesen werden. Eine Übereinstimmung der Ergebnisse von PCR und Buffy-coat-Ausstrichen lag bei 98,6 % der Proben vor. Beim Vergleich der Ergebnisse der Buffy-coat-Ausstriche mit den Ergebnissen des IFAT wurde eine prozentuale Übereinstimmung von 65,3 % errechnet. Identische Ergebnisse bei PCR und IFAT wurden bei 66,7 % der untersuchten Hunde erzielt. Die 133 Proben, die zufällig aus allen Einsendungen in das Routinelabor des Instituts für vergleichende Tropenmedizin und Parasitologie ausgewählt worden waren, wurden mittels PCR und IFAT untersucht, wobei zwei Tiere (1,5 %) in der PCR und 34,6 % im IFAT ein positives Ergebnis lieferten. Die Identität des PCR-Produktes eines der positiven Tiere wurde durch Klonierung und anschließende Sequenzierung bestätigt. Eine Übereinstimmung der Testergebnisse von IFAT und PCR bestand bei 52,6 % der untersuchten Proben. Diese Ergebnisse stützen die Auffassung, dass Hunde in Deutschland häufig mit A. phagocytophilum in Kontakt kommen, dass es sich dabei aber meist um eine selbstlimitierende, klinisch inapparente Infektion handelt.

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.

Im Literaturüberblick der vorliegenden Arbeit wird besonders auf die ökonomische und ökologische Bedeutung der Flusskrebse, den derzeitigen Stand der Forschung die Krebspest betreffend und die aktuelle taxonomische Klassifikation des Krebspesterregers, Aphanomyces astaci, eingegangen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine zuverlässige und schnelle Methode zum spezifischen und sensitiven Nachweis von Aphanomyces astaci direkt aus Krebsgewebe zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein kommerzielles Fertigkit (DNeasy® Tissue Kit, Qiagen) als geeignete DNA-Extraktionsmethode ausgewählt. Als Untersuchungsmaterial wurde die Abdominalkutikula von Edelkrebsen (Astacus astacus) eingesetzt. Anhand von Genomanalysen der ITS-Regionen (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen) verschiedener Oomycota wurden Oligonukleotid-Primer konstruiert, optimiert und auf ihre Eignung überprüft. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurden zwei PCR-Protokolle etabliert: eine Semi-Nested und eine Nested PCR. Die Semi-Nested PCR, die sich für die Routinediagnostik von Aphanomyces astaci als wenig geeignet erwiesen hat, bietet das Potential, als Grundlage für weiterführende Studien an anderen Arten der Gattung Aphanomyces zu dienen. Die Nested PCR mit den äußeren Primern NS 166/NS 681 und den inneren Primern BO 525/BO 640 ergab mit allen 20 untersuchten Aphanomyces astaci-Stämmen ein PCR-Produkt von etwa 115 bp, das mit einer anschließenden Restriktionsenzym-Analyse mit der Endonuklease Hph I verifiziert werden konnte. Die Nested PCR zeigte sich hochspezifisch gegenüber Aphanomyces astaci, während die DNA von anderen bei Krebsen und im Wasser vorkommenden Krankheitserregern und die DNA von Wirtsgewebe nicht amplifiziert wurde, was Grundvoraussetzung für den Einsatz dieser PCR als Standardmethode ist. Die Nachweisgrenze der Nested PCR lag bei Verwendung von Plasmid-DNA bei 1,9 genomischen Einheiten und bei Einsatz von genomischer DNA aus Pilzmyzel bei 1 ag. Als Zusammenfassung 172 Aphanomyces astaci-Sporen in die DNA-Extraktion eingesetzt wurden, lag die Nachweisgrenze bei 1 Spore. Zusätzlich wurden Infektionsversuche durchgeführt, bei denen Edelkrebse mit 10, 100 und 1000 Aphanomyces astaci-Zoosporen/ml infiziert wurden. Ein positives PCR-Ergebnis konnte ab Tag 2 post expositionem (entspricht dem Tag der ersten Probenentnahme) mit der beschriebenen Methode bei allen untersuchten Tieren beobachtet werden. Schließlich wurde eine Validierung der entwickelten Nested PCR unter Einsatz von Wirtskutikula anhand 19 diagnostischer Proben unterschiedlicher Herkunft innerhalb Europas (aus Deutschland, der Schweiz, Österreich, Schweden und England) durchgeführt und die Ergebnisse mittels RFLP verifiziert. Mit der in der vorliegenden Arbeit entwickelten molekularbiologischen Nachweismethode steht ein Verfahren zur Verfügung, das eine zuverlässige Diagnose von Aphanomyces astaci bereits im Anfangsstadium der Infektion direkt aus Krebsgewebe ermöglicht und innerhalb von 12 bis 15 Stunden (Sektion, DNA-Extraktion, Nested PCR, Agarosegel-Elektrophorese und bestätigende Restriktionsenzym-Analyse) durchführbar ist. Diese Methode ist somit ein geeignetes und zuverlässiges Mittel, um in Programmen zur Seuchenbekämpfung der Krebspest (Aphanomyces astaci) eingesetzt zu werden.