Podcasts about nukleins

In der neuen Folge von Entropia geht es um die geheimnisvolle Welt der RNA und DNA. Um diese besser erforschen zu können, macht unsere heute eingeladene Doktorandin Pauline sie sichtbar! Und zwar, so dass sie nicht dabei groß verändert werden. Solche Ergebnisse können zB. in der Erforschung von mRNA Impfstoffen oder Nukleinsäure Therapien beitragen. Erfahrt das Neuste in der fluorezente Basenanaloge-Szene in der Folge "RNA Spionage".

Jetzt KenFM unterstützen: https://www.patreon.com/KenFMde | Den vollständigen Tagesdosis-Text (inkl ggf. Quellenhinweisen und Links) findet ihr hier: https://kenfm.de/die-eine-wahrheit-von-walter-van-rossum/ Die „Faktenchecker“ des Spiegel schwören ihre Leser auf die reine Lehre über die Zuverlässigkeit der PCR-Tests ein. Von Walter van Rossum. Wer es mit der Wahrheit nicht so genau nimmt, muss dies durch selbstbewusstes Auftreten kompensieren, durch andauernde Wiederholung von Un- und Halbwahrheiten und durch systematische Diffamierung abweichender Meinungen. Wir kennen dieses Spiel, kennen es unter anderem natürlich vom Flaggschiff der medialen Propagandaflotte bezüglich des Corona-Virus: dem Spiegel. Ein neuer Artikel des Gesundheits-Ressortchefs Holger Dambeck versucht noch einmal massiv PR für den PCR-Test zu machen. Dumm nur, dass schon die Grundannahme darin falsch ist: die Behauptung nämlich, der Test könne „Infektionen mit dem Virus SARS-CoV-2“ nachweisen. Es wurde aber auch höchste Zeit, dass wieder Klarheit herrscht über den PCR-Test, dessen Qualität von zwielichtigen Figuren wie Dr. Wolfgang Wodarg infrage gestellt wurde. Der Ressortchef Wissenschaft beim Spiegel, Holger Dambeck, hat die Sache selbst in die Hand genommen. Er eröffnet seine Expertise (1) so: „Infektionen mit dem Virus SARS-CoV-2 werden mit sogenannten PCR-Tests nachgewiesen, die nach Gensequenzen des Erregers fahnden. Einzelne Mediziner und auch Corona-Skeptiker stellen die Qualität dieser Tests immer wieder infrage. Ein Vorwurf lautet: Der Test schlage auch bei anderen Coronaviren an, deshalb verzerrten massenhaft falsch positive Ergebnisse das Bild.“ Der erste Satz ist schon mal grundfalsch: PCR-Tests weisen keine infektiösen Viren nach, sondern eben nur ganz bestimmte Nukleinsäure-Genome, aber keine Infektionen. Eine Gesundheitsbehörde wie die amerikanische FDA (2) erklärt unzweideutig, „positive results … do not rule out bacterial infection or co-infection with other viruses. The agent detected may not be the definite cause of disease“ (3). Desgleichen die CDC (Centers for Disease Control and Prevention — eine Behörde des US-amerikanischen Gesundheitsministeriums) oder das Schweizer Bundesamt für Gesundheit sowie etliche andere weisen darauf ausdrücklich hin. Viele Hersteller solcher Tests betonen klar und deutlich: Nicht für diagnostische Zwecke geeignet. Auf der Gebrauchsanweisung des PCR-Tests der deutschen Firma creative diagnostics steht an erster Stelle, dass ihr Test auch bei anderen Viren anschlage, darunter „Influenza A Virus (H1N1), Influenza B Virus (Yamagata), Respiratory Syncytial Virus (type B), Respiratory Adenovirus (type 3, type 7), Parainfluenza Virus (type 2), Mycoplasma Pneumoniae, Chlamydia Pneumoniae“ (4). Zwischendurch bemerkt: Allein ein Wort wie „Corona-Skeptiker“ sagt alles über den herrschenden Pandemiejournalismus. In seinem Sinne widmet sich Dambeck sodann den teuflischen Thesen des Mediziners Wolfgang Wodarg: „Die Fallzahlen in den vergangenen Wochen seien nur deshalb angestiegen, weil viel mehr Menschen getestet wurden.“ „Je mehr Tests, umso mehr auch falsch positive Ergebnisse“, erklärt Wodarg…weiterlesen hier: https://kenfm.de/die-eine-wahrheit-von-walter-van-rossum/ KenFM bemüht sich um ein breites Meinungsspektrum. Meinungsartikel und Gastbeiträge müssen nicht die Sichtweise der Redaktion widerspiegeln. Alle weiteren Beiträge aus der Rubrik „Tagesdosis“ findest Du auf unserer Homepage: https://kenfm.de/tagesdosis/ Jetzt KenFM unterstützen: https://www.patreon.com/KenFMde | https://de.tipeee.com/kenfm | https://flattr.com/@KenFM Dir gefällt unser Programm? Informationen zu weiteren Unterstützungsmöglichkeiten hier: https://kenfm.de/support/kenfm-unterstuetzen/ Du kannst uns auch mit Bitcoins unterstützen. BitCoin-Adresse: 18FpEnH1Dh83GXXGpRNqSoW5TL1z1PZgZK | Abonniere jetzt den KenFM-Newsletter: https://kenfm.de/newsletter/ KenFM ist auch als kostenlose App für Android- und iOS-Geräte verfügbar! Über unsere Homepage kommst Du zu den Stores von Apple und Google. Hier der Link: https://kenfm.de/kenfm-app/ https://www.kenfm.de https://t.me/KenFM https://www.twitter.com/TeamKenFM https://www.instagram.com/kenfm.de/ https://www.youtube.com/KenFM https://soundcloud.com/ken-fm See acast.com/privacy for privacy and opt-out information.

Vortragsaudio rund um das Thema Nukleinsäuren. Überlegungen und Anregungen zum Wort bzw. Ausdruck Nukleinsäuren in diesem kurzen Improvisations-Vortrags-Podcast. Eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcasts von und mit Sukadev Bretz, Yogalehrer bei Yoga Vidya. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße aus dem Gebiet der Naturheilkunde. Bei eigener Erkrankung … „Nukleinsäuren“ weiterlesen

Definitionen und Betrachtungengänge zu Nukleinsäuren. Einige Infos zum Thema Nukleinsäuren in diesem feinen, kleinen Audio Vortrags-Podcast. Diese Audioshow ist eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcast. Sie ist ursprünglich aufgenommen als Diktat für einen Lexikonbeitrag im Yoga Wiki Bewusst Leben Lexikon von Yoga Vidya. Der Yogalehrer Sukadev behandelt hier das Wort, den Ausdruck Nukleinsäuren und streut Überlegungen aus dem Hatha Yoga mit ein. Um Yoga besser zu verstehen, kannst du ja auch überlegen, mal Yoga Ferien zu machen, vielleicht in einem Yoga Vidya Seminarhaus. Welche Gedanken hast du dazu?. Nukleinsäuren kommt aus Themengebieten wie Fasten, Diät, Gesundheit, Prävention, Heilmittel, Heilung. Mehr erfahren kannst du auch in einer Entspannungskursleiter Ausbildung. Willst du dazu etwas ergänzen? Schreibe es doch in die Kommentare. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße. Bei eigener Erkrankung brauchst du Arzt oder Heilpraktiker.

Definitionen und Betrachtungengänge zu Nukleinsäuren. Einige Infos zum Thema Nukleinsäuren in diesem feinen, kleinen Audio Vortrags-Podcast. Diese Audioshow ist eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcast. Sie ist ursprünglich aufgenommen als Diktat für einen Lexikonbeitrag im Yoga Wiki Bewusst Leben Lexikon von Yoga Vidya. Der Yogalehrer Sukadev behandelt hier das Wort, den Ausdruck Nukleinsäuren und streut Überlegungen aus dem Hatha Yoga mit ein. Um Yoga besser zu verstehen, kannst du ja auch überlegen, mal Yoga Ferien zu machen, vielleicht in einem Yoga Vidya Seminarhaus. Welche Gedanken hast du dazu?. Nukleinsäuren kommt aus Themengebieten wie Fasten, Diät, Gesundheit, Prävention, Heilmittel, Heilung. Mehr erfahren kannst du auch in einer Entspannungskursleiter Ausbildung. Willst du dazu etwas ergänzen? Schreibe es doch in die Kommentare. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße. Bei eigener Erkrankung brauchst du Arzt oder Heilpraktiker.

Die Identifizierung unbekannter oder unvermuteter Viren in Probenmaterial stellt eine Herausforderung im Diagnostikalltag dar. Sequenzunabhängige molekulare Methoden können eine Ergänzung zu konventionellen Techniken bieten. Ziele dieser Arbeit waren die vergleichende Prüfung der sequence-independent single primer amplification (SISPA) und random-PCR als Vertreter sequenz-unabhängiger Methoden zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren und die Evaluierung ihrer Tauglichkeit als universell einsetzbare, schnelle, einfache und kostengünstige Alternativen für die Routinediagnostik. Als Modell diente das Equine Herpesvirus-1 (EHV-1), das in verschiedenen Probenmaterialien in ab-steigender Konzentration bei ansteigendem Fremd-DNA-Gehalt vorlag. Durch Schritte zur physikalischen und enzymatischen Virusanreicherung, sequenz-unabhängigen Amplifikation in Kombination mit der konventionellen Sanger-Sequenzierung und einem Datenbankabgleich sollte EHV-1 wiedergefunden werden. Trotz variabler Inhibition durch Gewebebestandteile stellte sich die Enzymbehandlung unter Einsatz einer geeigneten DNase als effektive Methode zur Elimination von Fremd-DNA heraus. Die Protektion viraler Nukleinsäuren durch Viruskapsid bzw. -hülle, die die Voraussetzung für eine erfolgreiche Durch-führung darstellte, konnte in verschiedenen Materialien gezeigt werden. Weiterhin wurde ein gradueller Verlust an viraler DNA im Verlauf beider Methoden festgestellt, der eine hohe Viruslast im Ausgangsmaterial nötig macht. Sowohl die SISPA als auch die random-PCR führten zu einem vergleichbaren Erfolg beim Virusnachweis in Zellkulturüberstand, infizierten Zellen und Lebergewebe, was für ihre Anwendbarkeit in zellarmen wie auch in zellreichen Proben spricht. Der entscheidende Faktor für den Erfolg beider Methoden schien dabei vor allem die Viruslast zu sein. Ein hoher Zellgehalt in der Probe beeinflusste die Methodik hin-gegen offenbar weniger stark. Der nachgewiesene sequenzunabhängige Charakter stellte aufgrund einer damit einhergehenden erhöhten Kontaminationsanfälligkeit einen Schwachpunkt in der Methodik der random-PCR dar. In dieser Arbeit ist es gelungen, SISPA und random-PCR erfolgreich zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren in Gewebe anzuwenden. Für die universelle Einsetzbarkeit zur Diagnostik unbekannter bzw. unvermuteter Viren sollten als nächstes geeignete Schritte der reversen Transkription und Zweitstrangsynthese erprobt werden.

Thu, 24 Jul 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17347/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17347/1/Lehner_Julia_C.pdf Lehner, Julia

Obwohl die immunstimulatorischen Effekte viraler Nukleinsäursen, wie auch IFN -α und IFN-β, während Virusinfektionen eine wichtige Rolle spielen, ist wenig über ihre Funktion bei viraler Glomerulonephritis, wie beispielsweise HIV Nephropathie, bekannt. Virusinfektionen aktivieren, vor allem mittels IFN-α und IFN-β Produktion eine systemische antivirale Immunantwort. Es wurde gezeigt, dass diese inflammatorischen Zytokine einen pleiotropen immunmodulatorischen Effekt auf renale Mesangialzellen ausüben, was direkt zu glomerulären Krankheiten führt. Aber es ist bisher nicht bekannt, ob die viralen Nukleinsäuren und Typ I IFN einen Effekt auf die glomerulären Epithelzellen haben. (z.B. Podozyten und PECs). Um den Effekt von Nukleinsäuren auf Podozyten und PECs zu erforschen, stimulierten wir diese Zellen mit synthetischen dsDNA-(poly-dAdT) Komplexen mit lipofectamine, um eine virale Infektion zu imitieren. Wir haben herausgefunden, dass dsDNA stetig viele IFN-stimulierte Gene in Podozyten und PECs induziert. Desweitern haben wir herausgefunden, dass dsDNA die PECs Proliferation mindert und die CD24+/CD133+PECs Differenzierung zu ausgereiften Podozyten inhibiert. Um unsere Hypothese, dass deis aufgrund von der Sekretion von IFN-α und IFN-β passiert ist, zu bestätigen, haben wir den Effekt von diesen anitviralen Zytokinen auf PECs- und Podozyten-Homöostase etabliert. Wir haben herausgefunden, dass beide IFNs stetig Podozyten und PECs dazu anregen, stetig mehrere IFN-stimulierte Gene zu exprimieren. Trotzdem hat nur IFN-β das Podozytensterben induziert und die Permeabilität der Podozyten-Monolayer erhöht. In der Adriamycin-induzierter Nephropathie bei SCID Mäusen haben Injektionen mit IFN-α oder IFN-β die Proteinurie, den Makrophagen Influx und die Glomerulosklerose verstärkt. Trotzdem induziert nur IFN-β das mitotische Podozytensterben (katastrophale Mitose), welches zu einer reduzierten Podozytenanzahl führt. Wir haben führt, dass IFN-α einen Zellzyklusarrest in-vivo bei PECs induziert, der zur glomerulären Schädigung führt. Balb/c Mäuse, die Adriamycin gespritzt bekommen haben und täglich mit IFN-α und IFN-β behandelt wurden zeigten einen aggravierten Phänotyp mit vermehrter Proteinurie. Im Gegensatz zu dem, was an Studien in SCID Mausen gezeigt wurde, war der Effekt auf die Proteinurie nach IFN-α Behandlung prominenter bei Balb/c Mäusen, verglichen mit IFN-β. Deshalb haben Typ I IFNs einen deutlichen Effekt auf Podozyten und Parietalzellen. Zusammen fördern die Typ I IFNs die Glomerulosklerose durch verstärkten Untergang der Podozyten sowie durch Unterdrückung ihrer Regeneration aus Vorläuferzellen.

Thu, 28 Jun 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14592/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14592/2/Haiser_Karin.pdf Haiser, Karin ddc:530, ddc:500, Fakult

Eine Glomerulonephritis kann durch eine virale Infektion verschlechtert werden, sie kann aber auch erst durch diese entstehen. Die Erkennung der viralen Bestandteile erfolgt über Pathogenerkennungsrezeptoren, wie beispielweise Toll-like Rezeptoren und RIG-like Rezeptoren. Die Hypothese der vorliegenden experimentellen Arbeit war, dass die nierenspezifischen Podozyten Pathogenerkennungsrezeptoren besitzen, die pathogen-assoziierte molekulare Muster erkennen und daraus Zytokine und antivirale Typ-I Interferone produzieren. Hierbei könnten Podozyten zu der Entstehung bzw. Veschlechterung einer virusassoziierten Glomerulonephritis beitragen. Murine Podozyten exprimieren, mit Ausnahme des Toll-like Rezeptors 8, alle bis dato bekannten Toll-like Rezeptoren (TLR-1 bis -11) in verschiedener Ausprägung. Sie exprimieren außerdem die zytosolische Rezeptoren RIG-1, MDA-5, DAI sowie deren Adaptermolekül IPS-1. Die Aktivierung dieser Rezeptoren verursacht die Produktion von Zytokinen und Typ-I Interferonen. Um die intrazelluläre Aufnahme der Nukleinsäuren zu gewährleisten, wurden diese mit kationischen Lipiden komplexiert. Dieser Vorgang wurde durch Cytochalasin D, Chlorpromazin und Methyl-β-Cyclodextrin unterbrochen. Daraufhin ergeben sich die Phagozytose, die Clathrin-abhängige Endozytose und die Caveolae-vermittelte Endozytose als mögliche Transportmechanismen. Das Adaptorprotein MyD88 zeigte bei Podozyten keine Bedeutung für die Nukleinsäureaufnahme in die Zelle zu besitzen. Die Stimulation von Podozyten mit Typ-I Interferonen veranlasste die Produktion von großen Mengen an Interleukin-6 und führte zu einer starken Expression von Pathogenerkennungsrezeptoren sowie proinflammatorischen Zytokinen auf Transkriptionsebene. Eine autokrin-parakrine Aktivierung der Podozyten durch ausgeschüttete Typ-I Interferone konnten wir ausschließen. Weder die Durchlässigkeit für Albumin noch die Viabilität der Zellen wurde durch die Aktivierung von Pathogenerkennungsrezeptoren beeinflusst. Eine Funktionseinschränkung der Podozyten nach Stimulation der TLRs oder RLRs im Sinne eines direkten Einflusses auf die Permeabilität oder die Fußfortsatzzahl fand sich nicht, jedoch zeigten Podozyten eine vermehrte Zytokinproduktion, was zur glomerulären Entzündung bei viraler Glomerulonephritis beitragen könnte.

Molecular Aesthetics | Symposium Symposium at ZKM | Center for Art and Media, July 15 -17, 2011 in cooperation with DFG-Center for Functional Nanostructures (CFN) Karlsruhe Institute for Technology (KIT). Deleuze and Guattari's concept of the 'molecular' is not, as Eugene Thacker has recently remarked, necessarily about 'molecules' in a conventional scientific sense. Rather the concept is at the heart of a Deleuzian challenge to hierarchies of matter/form and molar/molecular. In A Thousand Plateaus the 'molecular' is synonymous with concepts of becoming, deterritorialisation and multiplicity. In practice, this means that Deleuze and Guattari challenge the genetic determinism that is often associated with molecular biology. When drawing on the work of Jacob and Monod, for example, they conceptualise the relationship between nucleic acids and proteins in terms of 'expression' and 'content'. The existence of what Deleuze and Guattari call a 'pure line of expression' (DNA) gives living organisms a high degree of deterritorialisation. This 'molecular' vision is developed most fully in Deleuze's work on aesthetics, and in particular his work on music, literature and film. In all of this work Deleuze adopts a radically materialist perspective. As far as music is concerned, he suggests that it might be possible to move away from thinking in terms of a musical 'matter' on which 'form' is imposed (this would in turn imply a hierarchy of matter, life, and spirit). In short, the coupling of 'matter-form' might be replaced by 'matter-force'. In this way, certain kinds of music would be able to render audible forces that would otherwise be non-audible. Similarly, as far as literature is concerned, Deleuze's molecular perspective highlights the ways in which writing is capable of rendering impersonal affects, percepts and singularities. In the case of film, Deleuze's reading of Bergson's materialism leads him to propose a radical immanence of the image in matter. /// Der Begriff des „Molekularen“ bei Gilles Deleuze und Pierre-Félix Guattari bezieht sich, wie Eugene Thacker jüngst angemerkt hat, nicht unbedingt auf „Moleküle“ im wissenschaftlichen Sinn. Vielmehr ist er die Spitze, die Deleuze gegen die Hierarchien von Materie/Form und Molar/Molekular wendet. „Molekular“ steht in Tausend Plateaus gleichbedeutend mit Werden, Deterritorialisierung, Multiplizität. Die beiden Autoren formulieren daraus eine Kampfansage an den genetischen Determinismus, der beharrlich mit der Molekularbiologie in Zusammenhang gebracht wird. In ihrer Behandlung des Werks von François Jacob und Jacques Monod interpretierten sie die Beziehung zwischen Nukleinsäuren und Proteinen unter dem Aspekt von „Ausdruck“ und „Inhalt“. Die Existenz dessen, was Deleuze und Guattari als „reine Linie des Ausdrucks“ (DNS) bezeichnen, verleiht dem lebenden Organismus einen hohen Grad an Deterritorialisierung. Am stärksten ausgeprägt ist der „molekulare“ Blick in Deleuzes Schriften zur Ästhetik, insbesondere in jenen zu Musik, Literatur und Film, in denen er eine radikal materialistische Position bezieht. In Bezug auf die Musik spekuliert er, dass es möglich sein müsse, von der Vorstellung einer musikalischen „Materie“, die in eine „Form“ gezwungen wird (und ihrerseits eine Hierarchie von Materie, Leben und Geist voraussetzt), abzugehen und die Dualität Materie-Form durch Materie-Kraft zu ersetzen. Bestimmte Arten der Musik könnten damit unhörbare Kräfte hörbar machen. In der Literatur erhellt der molekulare Blick, wie unpersönliche Affekte, Empfindungen und Singularitäten sich in Worte fassen lassen. Und in seiner Filmtheorie postuliert Deleuze ausgehend vom Materialismus Bergsons eine radikale Immanenz des Bilds in der Materie.

Thu, 11 Mar 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11499/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11499/1/Andrea_Ablasser.pdf Ablasser, Andrea ddc:610, ddc:600, Medizinisch

Im Exzellenzcluster Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) entwickeln führende Münchener Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler eine neue Art der Proteinforschung. Im Mittelpunkt des Interesses steht dabei die Rolle der Proteine, die als zentrale biologische Makromoleküle unter anderem die Struktur und Funktion aller Organismen bestimmen. Dazu ist Forschung auf verschiedenen Komplexitätsebenen erforderlich – vom isolierten Protein bis zum Protein im lebenden Organismus. Ein Schwerpunkt von CIPSM ist die Untersuchung von Proteindynamik. Moderne Techniken helfen dabei, Proteine in lebenden Zellen und unterschiedlichen Gewebearten, aber auch im Tier, zu beobachten. In verschiedenen Teilbereichen geht es um die biophysikalische Untersuchung der Proteine, die Proteinfaltung, die Struktur von Proteinkomplexen, die Interaktionen von Proteinen mit Nukleinsäuren, die Manipulation von Proteinfunktionen und um neurodegenerative Erkrankungen.

Hintergrund und Ziele der Arbeit: Bakterien und DNA Viren werden anhand unmethylierter CpG-Motive innerhalb ihrer DNA von den TLR 9 tragenden PDCs und den B Zellen des humanen Immunsystems als Gefahrensignale erkannt. Mittels synthetischer, CpG-enthaltender ODN nutzt man diese Grundsatzmechanismen, um vergleichbare Immunantworten auszulösen. Auf Grundlage eines unterschiedlichen immunologischen Aktivierungsprofils wurden bislang drei CpG-Klassen definiert: CpG-A, CpG-B und CpG-C. Mit Hilfe von CpG-A war es erstmals möglich, IFN-α in PDCs (den endogenen Hauptproduzenten dieses Zytokins) in Mengen zu induzieren, wie es bislang nur mit Viren selbst möglich war. Auch CpG-C stimuliert PDCs zur Sekretion von IFN α und aktiviert darüber hinaus B Zellen - eine Eigenschaft, die CpG-A nicht besitzt. Die sequenzspezifischen und strukturellen Voraussetzungen für diese differenziellen Wirkprofile waren bislang unzureichend verstanden, auch weil die Struktur-Analysen nur begrenzt auf die tatsächlichen Vorgänge im physiologischen Milieu übertragbar waren. Um CpG-ODN für die therapeutische Anwendung zu optimieren, sind die genauen Kenntnisse der Struktur-Wirkungsbeziehungen jedoch unverzichtbar. Ein zweiter Ansatzpunkt zur Optimierung der Anwendung liegt in der Verbesserung der systemischen Stabilität von CpG-ODN. Die Bindung von CpG-ODN an partikuläre Trägersysteme (z.B. Gelatine-Nanopartikel) wurde bereits in unserer Abteiliung als mögliches drug-delivery-System etabliert. Eine Weiterentwicklung dieses Prinzips wären partikuläre Strukturen, die aus immunstimulatorischen Nukleinsäuren aufgebaut keiner weiteren Trägermaterialien bedürfen. Beide Ansatzpunkte führen zu den Zielen dieser Arbeit: 1) Die Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen der CpG-Klassen A und C durch Etablierung geeigneter Methoden zur Untersuchung im physiologischen Milieu. 2) Die Entwicklung immunstimulatorischer partikulärer Strukturen auf Basis der in Teil 1) identifizierten wirksamen Strukturelemente beider CpG-Klassen. Ergebnisse: 1) Struktur-Wirkungsbeziehungen von ODN 2216 (CpG-A) und ODN M362 (CpG-C): CpG-A bildet im physiologischen Milieu spontan multimolekulare Strukturen, deren mittlere Durchmesser mit 24 40 nm im Größenbereich von Viren liegen. Es zeigte sich, dass für diese Multimerisierungen das Zusammenspiel aus flankierenden Poly-G-Motiven, palindromischem Zentrum und eingelagerten Natrium- oder Kaliumionen entscheidend ist. Physiologisches Milieu wirkt sich sowohl den Umgebungs-pH und die Na+/K+-Konzentrationen als auch die Temperatur (37 °C) betreffend optimal förderlich auf die Strukturbildung aus. Die Identifizierung dieser maßgeblichen Faktoren machte es möglich, den Strukturaufbau von CpG-A experimentell zu kontrollieren und die immunologischen Wirkungen der verschiedenen Strukturen direkt zu vergleichen. Für die rasche und hohe Induktion von IFN-α und anderen inflammatorischen Zytokinen durch PDCs sind große Partikel verantwortlich. Die Multimerisierungen von ODN 2216 werden bei pH < 6 zunehmend aufgehoben. Unterbindet man die Multimerisierungen durch Präinkubation der ODN bei Temperaturen > 60 °C oder durch Entzug der stabilisierenden Natriumionen (indem man sie zuvor in Aqua ad inj. löst), so verliert ODN 2216 seine immunstimulatorische Aktivität in Bezug auf PDCs. Die schwache Wirkung der CpG-A-Monomere kann jedoch durch Präinkubation von PDCs mit IFN β deutlich gesteigert werden. Im Gegensatz zu den ebenfalls einzelsträngig vorliegenden ODN 2006 (CpG-B) haben auch Monomere von ODN 2216 keine aktivierende Wirkung auf B Zellen. CpG-C hat durch die palindromische Sequenz die Möglichkeit, Hairpins und Duplices zu bilden. ODN M362 zeigt jedoch keine Hairpinstrukturen. Die Duplexformationen sind bei 37 °C in vitro nicht stabil und spielen keine Rolle bei der durch diese ODN initiierten B-Zell-Aktivierung. Duplices haben jedoch Anteil an der Induktion von IFN-α in PDCs. Die in dieser Arbeit etablierten Protokolle der Temperatur-Präinkubation ermöglichen erstmalig eine experimentelle Kontrolle der Strukturbildungen von CpG-A und CpG-C und dadurch den Vergleich von Struktur und Wirkung. Das Standardprotokoll für Gelelektrophorese wurde dahingehend modifiziert, dass ein physiologisches Milieu sowohl durch die anwesenden Ionen als auch durch die Umgebungstemperatur (37°C) simuliert werden konnte. 2)Design Nukleinsäure-basierter Nanopartikel: Zentrale Elemente von CpG-A und CpG-C (palindromische Sequenz, gerüstartige Verbindung mehrerer Nukleinsäuren) wurden eingesetzt, indem ODN M362-Sequenzen (CpG-C) an bi- und trivalenten Grundgerüsten (Linkern) für den Strukturaufbau optimiert wurden. Trivalente Linker ermöglichen die variierende Zusammenlagerung der palindromischen Nukleinsäuren in drei Richtungen des Raumes und dadurch die Bildung großer Partikel. Diese sind den bisher bekannten Maximalstimuli CpG-B und CpG-C hinsichtlich der Aktivierung von B-Zellen gleichwertig. Erstmalig konnten auf diese Weise B-Zellen durch partikuläre Strukturen stark aktiviert werden. Nach Vor-Komplexierung der Partikel mit Poly-L-Arginin wird die Aktivität bei B-Zellen nochmals verstärkt. Kurze, nicht-palindromische CpG-DNA-Sequenzen an trivalenten Grundgerüsten induzieren nach Vor-Komplexierung mit Poly-L-Arginin deutlich mehr IFN-α in PBMCs als CpG-A, obwohl sie selbst nicht multimerisieren. Wird die (palindromische) RNA-Sequenz von CpG-C an einem trivalenten Linker verwendet, so können ebenfalls große Strukturen generiert werden, die nach Transfektion vergleichbare Mengen IFN-α in PBMCs induzieren wie CpG-A. Ausblick: Die vorliegende Dissertation verbindet Fragestellungen der Immunologie und der pharmazeutischen Technologie mit den Möglichkeiten der Biochemie. Es werden nicht nur verschiedene Methoden zur strukturellen Untersuchung von CpG-ODN im physiologischen Milieu etabliert, sondern auch die experimentelle Kontrolle der Strukturbildung von CpG-A ermöglicht. Die entwickelte Technik der Generierung dreidimensionaler, über palindromische Nukleinsäuren aufgebauter Partikel ist nicht auf CpG-Motive in DNA begrenzt, sondern kann auf eine andere für Viren charakteristische Nukleinsäure (Einzelstrang-RNA) übertragen werden. Dadurch würde zusätzlich möglich, die immunologischen Profile von ssRNA, dsRNA und CpG in einem Partikel zu kombinieren und die Art der Immunantwort je nach Zusammensetzung der Partikel gezielt zu bestimmen. Die klinische Relevanz dieser Arbeit ergibt sich aus den neuen Erkenntnissen über die Multimerisierungen von CpG-A, welche dessen therapeutischen Einsatz optimieren und besser standardisierbar machen sollen. Außerdem werden neue Hinweise auf die unterschiedlichen Aufnahme- und Erkennungsmechanismen beider CpG-Klassen und deren Aktivierung der Synthese von IFN-α gewonnen. Darüber hinaus wurde durch die Entwicklung der Polyvalenten Linker eine grundsätzlich neue Technik im Stil eines Baukastensystems etabliert, welche als Grundstein einer neuen Generation von immunstimulatorischen Multimeren dienen soll. Die Koadministration von Adjuvans und Antigen in direkter räumlicher Nähe bietet neue Gestaltungsmöglichkeiten in der Vakzineentwicklung. Zudem ist zu erwarten, dass unter Einbeziehung der RNA basierten immunologischen Wirkprofile innerhalb eines Partikels der Einsatz von CpG-ODN zur Therapie von Virusinfektionen und Tumoren weiter verbessert werden kann.

Der labordiagnostische Nachweis von Mikrosporidieninfektionen bereitet noch immer Probleme. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer unspezifischen Färbeeigenschaften ist der lichtmikroskopische Direktnachweis schwierig. Der elektronenmikroskopische Nachweis ist aufwendig und insbesondere aus Stuhl wenig sensitiv. Nicht alle Mikrosporidien können in Zellkulturen vermehrt werden. Die beim Menschen häufigste Spezies, Enterocytozoon bieneusi, ist nicht kultivierbar. Molekularbiologische Nachweisverfahren wie die PCR sind ebenfalls aufwendig, noch nicht standardisiert und derzeit noch Speziallaboratorien vorbehalten. Zuverlässige immundiagnostische Tests mit ausreichender Sensitivität und Spezifität fehlen insbesondere für E. bieneusi, da aufgrund der fehlenden Kultivierbarkeit die für eine Testentwicklung nötige Menge und Reinheit des Antigens kaum zu erzielen ist. Gene, durch deren rekombinante Expression dieses Problem gelöst werden könnte, sind bisher noch nicht bekannt. Dabei wäre zum Beispiel die Entwicklung eines Koproantigen-ELISA zum Nachweis von E. bieneusi aus Stuhl von großem praktischem Nutzen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war es, die Voraussetzungen hierfür zu verbessern. Als aussichtsreichstes Antigen wurde das so genannte „Sporenwandprotein“ (SWP) gewählt, der Hauptbestandteil der Sporenwand von Mikrosporidien. In eigenen Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass es allerdings wenig aussichtsreich ist, alleine anhand der bis dahin ausschließlich für Encephalitozoon cuniculi und E. intestinalis bekannten SWP-Gensequenzen PCR-Primer zur Amplifikation des homologen Gens aus E. bieneusi zu konstruieren. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst der bis dahin unbekannte, vollständige kodierende Bereich des SWP-Gens einer weiteren Encephalitozoon-Spezies, E. hellem, einschließlich benachbarter Genabschnitte auf Nukleinsäureebene charakterisiert. Durch die Vergleichsmöglichkeit mit dem SWP-Gen einer dritten Mikrosporidienart wurden die Voraussetzungen zur Konstruktion „universeller“ Primer, die homologe Abschnitte des wahrscheinlich auch in E. bieneusi vorhandenen SWP-Gens amplifizieren können, verbessert. Ein weiteres Ziel, das in dieser Arbeit erreicht wurde, war bei dieser Charakterisierung ganz auf das Anlegen von Banken zu verzichten. Im Hinblick auf die fehlende Kultivierbarkeit von E. bieneusi und die damit verbundene Schwierigkeit, das Ausgangsmaterial für genomische oder cDNA-Banken (genomische DNA bzw. mRNA) in ausreichender Menge und Reinheit zu gewinnen, sollte nämlich bewiesen werden, dass es möglich ist, das SWP-Gen einer Mikrosporidienart alleine durch die Anwendung von PCR-Techniken bestimmen zu können. Als Ausgangspunkt für die Charakterisierung des SWP-Gens aus E. hellem war die Amplifizierung eines ersten Genfragments. Dies konnte durch die Konstruktion so genannter „degenerierter“ Primer (Primermischungen) erreicht werden. Nach Kenntnis dieser ersten E. hellem-spezifischen DNA-Sequenz konnten anschließend Primer konstruiert werden, die vollständig zum SWP-Gen von E. hellem passten. In einer „klassischen“ PCR können jedoch nur DNA-Abschnitte zwischen bekannten Bereichen amplifiziert werden, da diese zur Konstruktion der beiden PCR-Primer bekannt sein müssen. Um dennoch die DNA-Sequenz aus dem ersten Genfragment nach beiden Seiten („upstream“ und „downstream“) verlängern zu können, wurden „inverse“ und „verankerte“ PCR-Reaktion als Spezialtechniken eingesetzt und durch Kombination mit bekannten Techniken („geschachtelte“, „halb-geschachtelte“ und „Touch Down“-PCR) optimiert. Schließlich wurden in der vorliegenden Arbeit aus der Primärstruktur (Nukleotidabfolge) ableitbare Eigenschaften des SWP-Gens von E. hellem diskutiert. Durch Sequenzvergleich mit den bereits bekannten SWP-Genen aus E. cuniculi und E. intestinalis wurden zwei konservierte Loci identifiziert, die zur Konstruktion „universeller“ SWP-Primer vorgeschlagen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde somit (a) das bis dahin unbekannte Gen des Sporenwandproteins aus E. hellem erstmals auf Nukleotidebene charakterisiert, (b) bewiesen, dass die Charakterisierung eines unbekannten SWP-Gens durch ausschließliche Anwendung von PCR-Spezialtechniken und ohne die Herstellung von genomischen oder cDNA-Banken möglich ist und (c) Methoden der „inversen“ und der „verankerten“ PCR in der Arbeitsgruppe etabliert und optimiert.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Tyrosinphosphatase hVH-5 nach Genveränderungen untersucht. Als Mitglied der Familie der dual-spezifischen Phosphatasen ist hVH-5 (homologue of vaccinia virus H1 phosphatase gene clone 5) an der Signaltransduktion der Zelle durch Dephosphorylierung von stress-aktivierter Proteinkinase (SAPK) und p38 beteiligt. Aufgrund seiner Rolle als potentielles Tumorsuppressorgen können Genveränderungen oder Fehlregulationen von hVH-5 zur Entstehung von Tumoren beitragen. Wie bereits bekannt ist, zählt die Lokalisation dieses Gens auf Chromosom 11p15.5 zu häufig beobachteten Loss Of Heterozygosity (LOH)-Regionen bei Krebserkrankungen, u.a auch bei Brustkrebs. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Expressionsanalyse der hVH-5 Phosphatase in Normalgewebe und Brustkrebszelllinien durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass hVH-5 nicht nur, wie schon bekannt, in humanem Gehirn, Herz und Skelettmuskel transkribiert wird, sondern eine Trankription darüber hinaus auch noch in 10 weiteren humanen Geweben sowie in allen untersuchten Brustkrebszelllinien nachgewiesen werden konnte. Um ein zeitsparendes und effektives Mutationsscreening zu ermöglichen, wurde eine neue Methode, Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE), etabliert. Dadurch konnte bereits im ersten Exon dieser Phosphatase eine Heteroduplexbildung als Hinweis auf eine Genveränderung sichtbar gemacht werden. Mittels Sequenzierungs- sowie Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Analyse konnte die exakte Nukleotidsequenz bestimmt werden. Es wurde festgestellt, dass es sich hierbei um eine bisher unbekannte Gensequenz eines prozessierten Pseudogens der hVH-5 Phosphatase handelt. Prozessierte Pseudogene sind dadurch definiert, dass sie typischerweise durch einen Verlust des Promotors transkriptionell inaktiv sind. Eine Datenbankrecherche (Sanger Center) ermöglichte die Lokalisation des Pseudogens auf Chromosom 10q22.2. Phylogenetische Analysen führten zu dem Ergebnis, dass das Gen vor ca. 6,8 Mio. Jahren entstanden sein müsste. Es konnte gezeigt werden, dass das in dieser Arbeit beschriebene Pseudogen von hVH-5 (ψhVH-5) entgegen der Definition eines Pseudogens in gesunden menschlichen Geweben transkribiert wird. Diese Tatsache deutet auf eine evtl. funktionelle Bedeutung dieses Gens hin. Weiterhin konnte ein möglicher Zusammenhang zwischen der Transkription des Pseudogens und der Entstehung von Brustkrebs nicht ausgeschlossen werden, da dieses in drei von 14 untersuchten Brustkrebszelllinien nicht transkribiert wird. Aus der Übersetzung der Nukleinsäuresequenz von ψhVH-5 in Aminosäuren resultierte ein Peptid von 8.8 kDa, welches sich stark vom hVH-5 Wildtyp unterscheidet und keinerlei funktionelle Domänen aufweist. Es konnte weder ein Nachweis des transient überexprimierten Proteins noch eines in vivo translatierten Proteins erbracht werden. Die Akkumulation der zahlreichen Mutationen im Pseudogen verglichen mit dem Wildtyp deutet stark darauf hin, dass dieses Gen in der Evolutionsgeschichte aufgrund fehlender funktioneller Bedeutung zumindest zeitweise keinem Selektionsdruck unterlag oder aber sich zu einem selbständigen Gen mit noch unbekannter Funktion weiterentwickelte. In der vorliegenden Arbeit konnten Hinweise dafür gebracht werden, dass ψhVH-5 sich möglicherweise derart entwickelt hat, um durch andere Regulationsmechanismen, beispielsweise solche, die für nicht-kodierende RNAs bekannt sind, mit dem Wildtypgen der hVH-5 Phosphatase zu interagieren.

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.

Ziel der vorliegenden Studie war es, abzuklären, wie verlässlich die Serotypisierung von HIV-1 die in einem ostafrikanschen Land vorkommenden, seit Jahren nebeneinander existierenden, unterschiedlichen Genotypen bestimmen kann. Hierzu wurden die genetischen Subtypen von 86 AIDS-Patienten aus Mbeya-Stadt im südwestlichen Tansania durch die Nukleinsäuresequenzierung eines env-Abschnitts bestimmt. Die Daten wurden mit den Ergebnissen der V3-Serotypisierung verglichen, welche durch 4 verschiedene Testverfahren erhoben wurden. In den zur Verfügung stehenden Patientenproben konnten 4 genetische Subtypen identifiziert werden: A (25,29%), C (47,55%), D (13,15%) und G (1,1%). Im Vergleich der serologischen Tests untereinander konnte gezeigt werden, dass die Sensitivität und Spezifität der verwendeten ELISAs beträchtlich variierte. Weiterhin konnten verschiedene Aminosäurereste im V3-loop identifiziert werden, die größte Bedeutung für eine erfolgreiche und gleichzeitig spezifische Antikörperbindung haben. Abweichungen hiervon waren in hohem Maße mit einer serologischen Fehlklassifizierung verbundn. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Tests zumindest auf Populationsebene die Subtypenverteilung in den richtigen Proportionen vorharsagen. Auf individueller Ebene ist die Vorhersagekraft jedoch nicht ausreichend. Die Schuld dafür ist in den extrem ähnlichen Aminosäuresequenzen der prävalenten genetischen Subtypen zu suchen, die eine Unterscheidung von A und C bzw. D und C in vielen Fällen unmöglich machten. Um in groß angelegten Studien die genetischen HIV-1-Subtypen untersuchen zu können, sind modifizierte Algorithmen nötig, mit deren Hilfe die durch regionale Besonderheiten der Viren verursachten Schwierigkeiten der serologischen Tests erkannt und korrigiert werden können.

Zusammenfassung Freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies, die in zahlreichen Teilprozessen des Sauerstoffmetabolismus gebildet werden, können biologische Moleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren nachhaltig schädigen. Der Körper verfügt deshalb über eine große Vielfalt an antioxidativen Abwehrmechanismen, um eine Schädigung zu vermeiden bzw. möglichst gering zu halten. In dieser Arbeit wurde der antioxidative Status im Blut von Kälbern und deren Müttern untersucht, wobei das Hauptaugenmerk bei den Kälbern lag. Dazu wurden bei dreißig Kühen bzw. deren Kälbern Blutproben zu bestimmten Zeitpunkten peripartal bzw. von der Geburt bis zum Alter von drei Monaten genommen und auf verschiedene für die antioxidative Kapazität im Blut relevante Parameter untersucht. Die TEAC (Trolox equivalent antioxidative capacity) wurde für Kühe und Kälber als Maß für den antioxidativen Status genommen. Darüber hinaus wurden neben den Vitaminen C und E bei den Kälbern auch das Gesamteisen und die latente Eisenbindungskapazität postnatal bis zum Alter von 79 Tagen bestimmt. Zur Charakterisierung des jeweiligen Stoffwechsel- und Gesundheitsstaus der Versuchstiere wurden auch typische Metabolite (Glucose, Bilirubin), Proteine (Gesamteiweiß, Albumin) und Enzyme (ALT, AST, GLDH, CK) im peripartalen (-30 d bis 30 d) und postnatalen (0 bis 79 d) Zeitraum erfasst. Die Untersuchung der Kuh-Proben erbrachte vor der Geburt ein signifikantes Absinken der Vitamine C und E im Blutplasma. So betrug der Vitamin-Gehalt im Mittel vor der Geburt (Tag -20) 15,4±2,5 µmol/l (Vit C) bzw. 6,7±3,1 µmol/l (Vit E) und fiel bis zum Tag der Geburt signifikant auf Werte von 10,3±2,5 µmol/l (Vit C) bzw. 3,5±1,3 µmol/l (Vit E) ab. Da die TEAC-Kurve im gesamten peripartalen Zeitraum keine Schwankungen zeigte, ist beim präpartalen Absinken der Vitamin C- und Vitamin E- Konzentrationen von einem speziellen Effekt auf die Vitamine C und E auszugehen. Möglicherweise spiegelt sich hierbei der Vitamin- Abfluss über die Kolostralmilch wieder. Bei der Betrachtung der Metabolite, Proteine und Enzymaktivitäten im Serum der Kühe konnte ein für die Transitionsperiode und das Geburtsereignis typischer Verlauf dieser Parameter beobachtet werden. So herrschten z.B. hohe Glucose- bzw. Gesamtbilrubin- Spiegel am Tag der Geburt bzw. auch bis zum 5. Tag danach. Der Gesamteiweißgehalt im Serum war kurz vor und nach der Geburt undeutlich niedriger und die Enzymaktivitäten von AST und GLDH erhöhten sich tendenziell in der ersten zehn Tagen nach der Geburt. Bei der Analyse der Kälberblutproben konnte eine deutlich schlechtere Ausgangslage bezüglich des antioxidativen Status (gemessen als TEAC) nach der Geburt im Vergleich zu den Kühen festgestellt werden. Dies hatte verschiedene Gründe: Es konnte ein Einfluss des Geburtsverlaufs gezeigt werden. Demnach hatten Kälber aus Schwergeburten im Beobachtungszeitraum durchgehend im Mittel um 15,5 % erniedrigte antioxidative Kapazität, gemessen über die TEAC-Konzentration im Plasma, als Kälber aus einfacher Geburt. Außerdem war der Abfall des TEAC-Wertes bei Schwergeburtskälbern ausgehend von einem TEAC-Wert von 0,36±0,14 µmol/l (Tag der Geburt) und 0,25±0,06 mmol/l (Tag 1) sehr viel deutlicher bzw. stärker ausgeprägt als bei Kälbern aus einfacher Geburt (von 0,33±0,04 mmol/l am Tag 0 auf 0,32±0,05 mmol/l am Tag 1). Die Hypoxie, welche beim Geburtsvorgang unweigerlich auftritt, war vermutlich bei Kälbern aus Schwergeburten ausgeprägter. Die Glucose-Konzentration im Blut der Schwergeburtskälber war in den ersten Lebenstagen zum Teil signifikant höher als bei Kälbern aus einfacher Geburt. Bei den weiteren gemessenen Parametern konnten keine Unterschiede in den Geburtsgruppen beobachtet werden. Sie zeigten einen für die neonatale Periode charakteristischen Verlauf, so war zum Beispiel die Gesamtbilirun-Konzentration nach der Geburt erhöht („Hyperbilirubinämie der Neugeborenen“) und auch die CK zeigte eine deutliche Aktivitätserhöhung zu diesem Zeitpunkt. Um den Einfluss abzuschätzen, den der Abbau des fetalen Hämoglobins auf den antioxidativen Status der Kälber hat, wurden die latente Eisenbindungskapazität, freies Eisen und das Gesamteisen im Serum der Kälber bestimmt. Mit der verwendeten Analysemethode konnte kein freies Eisen nachgewiesen werden. Die latente Eisenbindungskapazität verdreifachte sich vom Tag der Geburt (7,6±2,8 µmol/l) bis zum elften Lebenstag (20±4,4 µmol/l) und sank dann wieder auf das Niveau von 15,4±5,2 µmol/l (Tag 49) ab. Die geringen LEBK-Werte kurz nach der Geburt sind vermutlich auf die freien Eisenionen, die beim Abbau des fetalen Hämoglobins freiwerden, zurückzuführen. Die Konzentration des Gesamteisens im Serum zeigte erwartungsgemäß einen gegensätzlichen Verlauf, und sank nach der Geburt auf 60% des Ausgangswertes (16,4±6,7 µmol/l am tag 0) ab, um dann ab dem fünften Lebenstag kontinuierlich bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes auf 26,5±3,2 µmol/l (Tag 79) anzusteigen. Es wurden die TEAC-Werte von kranken und gesunden Kälbern gegenüber gestellt. Dabei konnten keine Unterschiede im Niveau und im Verlauf der TEAC-Kurven nachgewiesen werden. Bei der geringen Anzahl an kranken Tieren (nur sechs Kälber) in dieser Untersuchung stellte sich die TEAC nicht als deutlicher prognostischer Faktor hinsichtlich der Morbidität heraus. Um eine endgültige Aussage darüber zu treffen, muss eine größere Tierzahl untersucht werden.

Die Rolle der Transduktion beim horizontalen Gentransfer ist bislang wenig untersucht. Die Bedeutung, die diesem Mechanismus beim Austausch von genetischem Material in der Natur zukommt, kann nur geklärt werden, wenn möglichst umfassende Informationen über das Vorkommen von transduzierenden Bakteriophagen verfügbar sind. Zur Erforschung des Ausmaßes des phagenvermittelten Gentransfers war es notwendig, Methoden zu entwickeln, die nicht auf die Verfügbarkeit kultivierbarer Indikatorbakterien zum Nachweis von Phagen sowie Spender- und Empfängerstämme zum Nachweis der Transduktion angewiesen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur indikatorunabhängigen Identifizierung transduzierender Bakteriophagen entwickelt. In Phagenpartikel verpackte DNA wurde als Template für die PCR-Amplifikation von bakterieller 16S rDNA eingesetzt. Dabei wurden PCR-Primer verwendet, die eine Amplifikation der 16S rRNA-Gene der meisten Eubakteria ermöglichen. Die Sequenzierung der klonierten Amplifikationsprodukte ermöglichte die retrospektive Identifizierung der Wirtsbakterien. Zur Etablierung dieser Methode wurde der generell transduzierende Salmonella-Phage P22 eingesetzt. Erste Anwendungen auf verschiedene Umweltproben zeigten, daß dieser Ansatz den Nachweis generell transduzierender Bakteriophagen ohne Isolierung und Kultivierung der Wirtszellen ermöglicht. Daher ist es auch möglich, Phagen, die am Gentransfer beteiligt sind, ohne Selektion durch die derzeit kultivierbaren Wirte zu detektieren. Schon in den ersten Testanwendungen konnten Phagen von 26 verschiedenen Gramnegativen Bakterienspezies nachgewiesen werden, bei denen bisher keine transduzierenden Viren bekannt waren. Die Untersuchung einer Moorquellwasserprobe brachte Informationen über Phagen mit bisher unbekannten Wirtszellen. Die hier vorgestellte Methode kann als Prototyp des indikatorunabhängigen Nachweises generell transduzierender Phagen für prinzipiell alle Bakterienarten gelten. Unter Einsatz verschiedener 16S rDNA-Primerpaare ist der Suche nach transduzierenden Partikeln in der Umwelt nahezu keine Grenze gesetzt. Dieser Ansatz erlaubt sowohl die Überprüfung einer Probe auf das Vorkommen transduzierender Phagen mit unterschiedlichen Wirtsspezifitäten als auch die gezielte Suche nach am DNA-Transfer beteiligten Phagen spezieller Vertreter der Prokaryonten. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der bisher unbekannten Salmonella-Phagen 7D, PS79 und A12. Es konnte gezeigt werden, daß diese nicht mit P22 sowie anderen prominenten Bakterienviren verwandt sind und daher drei neue Phagenfamilien repräsentieren. Mikrobiologische Untersuchungen erbrachten, daß es sich dabei um zwei temperente und einen virulenten generell transduzierenden Phagen handelt. Bezüglich ihrer morphologischen und Nukleinsäure-Merkmale zählen sie zur Familie der Caudovirales. Die Phagen wurden in Hinsicht auf ihr Wirtsspektrum sowie auf phagenvermittelte Schutzmechanismen lysogener Zellen untersucht. Im Rahmen der molekulargenetischen Analyse konnte die Größe der Phagengenome ermittelt werden und für 7D und PS79 konnten Restriktionskarten für acht bzw. sieben Enzyme erstellt werden. Der Phage A12 entzog sich, wahrscheinlich aufgrund ausgeprägter DNASekundärstrukturen, einer ausführlichen Restriktionskartierung, so daß diese auf ein Enzym beschränkt werden mußte. Untersuchungen PS79-lysogener Zellen weisen darauf hin, daß der Prophage als extrachromosomale Replikationseinheit vorliegt. Für den Phagen 7D wurde die Integration durch ortsspezifische Rekombination sowie der Integrationsort auf dem Chromosom von Salmonella nachgewiesen. Die Charakterisierung der Phagen 7D, PS79 und A12 erbrachte neue Informationen über die Vielfalt generell transduzierender Bakteriophagen bei Salmonella. Insgesamt zeigen die erzielten Ergebnisse deutlich, daß der horizontale Transfer genetischen Materials durch Transduktion, insbesondere im Hinblick auf die Sicherheitsforschung im Zusammenhang mit der Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen, nicht länger als vernachlässigbarer Faktor eingestuft werden kann.