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Der Diabetes mellitus ist mit einer Anzahl von über 171 Millionen erkrankten Menschen weltweit eine der größten metabolischen Volkserkrankungen. Die immer höhere werdende Zahl von Schwangeren mit Gestationsdiabetes lässt die Frage aufkommen, welche Konsequenzen für Schwangerschaft und Neugeborenen bestehen. Ziel dieser Arbeit war es, anhand von einem erkrankten Probandenkollektiv sowie einer gesunden Referenzgruppe den Einfluss der Glukosestoffwechselstörung auf den Fettsäuremetabolismus von werdender Mutter über die Plazenta zum Ungeborenen bzw. Neugeborenen näher zu charakterisieren. Konkret sollte die Frage beantwortet werden, ob Unterschiede in der plazentaren mRNA-Expression von Fettsäuretransportproteinen bei Schwangeren mit Diabetes mellitus bestehen. In die Studie konnten 11 schwangere Probandinnen mit Diabetes mellitus eingeschlossen werden. Weiterhin konnten als Referenzgruppen 10 gesunde Schwangere gewonnen werden. Alle Probandinnen waren Patientinnen der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe Innenstadt (Klinikum der Ludwig-Maximilians- Universität München; Direktor Prof. Dr. med. Klaus Friese). Die Probandinnen nahmen 12 Stunden vor einem geplanten Kaiserschnitt eine definierte Menge 13C-markierte Docosahexaensäure, Arachidonsäure und Ölsäure zu sich. Zum Zeitpunkt der Sectio wurde venöses Blut der werdenden Mutter, Nabelschnurvenen und –arterienblut sowie Plazentagewebe gewonnen. Die gewonnen Proben wurden bis zur weiteren Bearbeitung tiefgefroren konserviert. Die durchgeführten Versuche wurde alle mit den Methoden der Real-Time PCR, Immunhistochemie, Gaschromatographie und Massenspektrometrie gemessen. Die Real-Time PCRs wurden mit Primern für die Fettsäuretransportproteine der FATP-Familie FATP-1, FATP-4 und FATP-6, des Fettsäurebindungsproteins FABPpm, der Fettsäuretranslokase FAT/CD36 und des Adipozyten-Fettsäurebindungsproteins aFABP sowie der Fettsäuredesaturasen FADS-1 und FADS-2 und der Fettsäurelipasen hEL und hLPL durchgeführt. Immunhistochemisch wurde Plazentagewebe mit Antikörpern gegen FATP-1 und FATP-4 gefärbt. Mittels Gaschromatographie wurden die Fettsäureverteilungen in den verschiedenen Fettsäurekompartimenten Phospholipide, Triglyzeride, Cholesterinester und freie Fettsäuren im Blutplasma und Plazentagewebe bestimmt. Zusätzlich wurden Fettsäureanteile in der Phosphatidylcholin- und Phosphatidylethanolaminfraktion in Erythrozyten gemessen. Außerdem konnten mit Hilfe der Massenspektrometrie die Anteile der 13C-markierten Fettsäuren detektiert werden. Die mittels Real-Time PCR gemessene mRNA-Expression von Fettsäuretransportproteinen FATP-1, FATP-4 und FATP-6, FABPpm, FAT/CD36, aFABP, von den Fettsäuredesaturasen FADS-1 und FADS-2 und von den Fettsäurelipasen hEL und hLPL zeigten in beiden untersuchten Probandenkollektiven keine signifikanten Unterschiede. Auch der immunhistochemische Lokalisationsnachweis von FATP-1 und FATP-4 im Synzytiothrophoblasten und Kapillarendothel war für beide Gruppen gleich. Bezüglich der Tracer-Fettsäureverteilung in beiden untersuchten Gruppen zeigte sich eine signifikant niedrigere 13C-AA Anreicherung in der GDM-Gruppe. In Hinblick auf die Fettsäureverteilung von nicht-tracermarkierten Fettsäuren zeigten sich in der GDM- Gruppe signifikant höhere PUFA-Anteile in der Phospholipidfraktion des Nabelschnurvenenblutplasmas verglichen mit Nabelschnurarterienblutplasma. Die für diese Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass auf mRNA-Ebene keine Regulationsprozesse zu bestehen scheinen, die zu einer unterschiedlichen Verteilung von Fettsäuren von der Schwangeren auf den Neonatus führen. Auch die Darstellung mittels Immunhistochemie von FATP-1 und FATP-4 zeigt, dass diese Fettsäuretransportproteine in beiden untersuchten Gruppen gleich lokalisiert sind. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass Regulationsprozesse zu einem späteren Zeitpunkt aktiv werden, der jedoch in dieser Arbeit nicht untersucht wurde. Bezüglich der 13C-Fettsäureanreicherung ist zu vermuten, dass die niedrigeren 13C-AA-Anteile in der GDM-Gruppe dadurch zustande gekommen sein könnten, dass die Diabetikerinnen und ihre Neugeborenen aufgrund einer höheren inflammatorischen Grundaktivität im Metabolismus mehr 13C-AA direkt utilisieren und diese nach 12 Stunden nicht mehr in Blut und Plazenta messbar sind. Eine mögliche Erklärung für die Tatsache, dass in der GDM-Gruppe mehr PUFAs im Nabelschnurvenenblut als im Nabelschnurarterienblut aufzufinden waren, könnte sein, dass Neugeborene diabeteskranker Mütter mehr PUFAs benötigen und diese sofort aus dem venösen Nabelschnurblut in ihren Metabolismus utilisieren, sodass signifikant niedrigere Anteile im zurückfließenden Nabelschnurarterienblut vorzufinden sind. Weitere Untersuchungen hierzu müssen Aufschluss darüber geben, inwieweit diese Wissen zu interpretieren ist und ob sich hieraus Konsequenzen für die Schwangerschaft von Diabetikerinnen ergeben.

Das Schädel-Hirntrauma (SHT) ist bei Kindern und jungen Erwachsen bis zum 45. Lebensjahr mit einer Inzidenz von 332 Verletzten pro 100.000 Einwohner in Deutschland die häufigste Krankheits- und Todesursache. Neben dem persönlichen Leiden und der hohen Rate an posttraumatischer Pflegebedürftigkeit, sollte auch die sozioökonomische Tragweite mit, allein in Deutschland, gesamtgesellschaftlichen Kosten von 2,8 Milliarden Euro pro Jahr berücksichtigt werden. Zwei wesentliche Verletzungsmuster des SHT werden unterschieden: die fokale Kontusion sowie der diffuse Axonschaden. Beide Mechanismen führen zum posttraumatischen Hirnödem und intrakraniellem Druckanstieg, Hauptprädiktoren für ein schlechtes Ergebnis der Patienten. Die daraus resultierende zerebrale Minderperfusion und Hirnischämie münden in einen Circulus vitiosus mit Progredienz des Hirnödems. Ca. 50% des Hirnödems entsteht sekundär und wäre daher einer Behandlung prinzipiell zugänglich. Trotz intensiver Forschung fehlt weiterhin eine kausale und anti-ödematöse Therapie. Vasopressin und V1a-Rezeptoren scheinen eine wesentliche Rolle in der Pathophysiologie von Hirnschädigungen zu spielen, da einerseits die Höhe des Vasopressin-Serumspiegels positiv mit der Schwere von verschiedenen Hirnläsionen korreliert und andererseits eine pharmakologische Hemmung des V1a-Rezeptors das Hirnödem und den sekundären Hirnschaden nach experimentellem Schädel-Hirntrauma mindert. Während die systemische Regulation der Wasserhomöostase in der Niere über den antidiuretischen Effekt von Vasopressin sehr gut bekannt ist, vermittelt über V2-Rezeptoren und Aquaporin 2 (AQP2), ist sowohl die zentrale Funktion von Vasopressin als auch die Regulation zerebraler AQP noch unzureichend verstanden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher 1. den Einfluss von Vasopressin V1a-Rezeptoren auf den sekundären Hirnschaden nach experimentellem SHT an einem hochspezifischen V1a-Rezeptor knock-out Mausmodell zu untersuchen, 2. die Bedeutung der zerebralen AQP 1, 4 & 9 für den Hirnwassertransport und die post-traumatische Hirnödem Entstehung zu erforschen sowie 3. die Frage zu klären, ob die gezeigten anti-ödematösen Effekte des V1a-Rezeptors über zerebrale AQP nach Controlled Cortical Impact (CCI) im Mausmodell vermittelt werden. An tief anästhesierten Wildtyp und V1a-Rezeptor knock-out Mäusen wurde nach mikrochirurgischer Präparation ein standardisiertes und mittelschweres CCI ausgelöst. Die Hirnentnahme erfolgte je nach Zielparameter jeweils von unbehandelten Mäusen sowie 15 Minuten, 1, 3, 6, 12, 24 h oder 7 Tage nach Trauma. Für die Validierung des knock-out Modells wurden die physiologischen Parameter intrakranieller Druck, mittlerer arterieller Druck und die zerebrale Durchblutung vor und über 30 Minuten nach CCI bestimmt. Für die Untersuchung der neuroprotektiven Effekte des V1a Rezeptors waren die Zielparameter: Hirnwassergehalt, sekundäres Nekrosevolumen, die neurologische Funktion, Gewichtsänderung sowie die Mortalität. Die Entwicklung von maushirnspezifischen Primern war wesentliche Voraussetzung für die Quantifizierung von AQP1, 4 & 9 mRNA durch quantitative Real-Time PCR. Immunhistochemisch wurden mit der Fluorchrom-Methode und dem Infrarot Scan AQP1 & 4 lokalisiert und quantifiziert. Wesentliche Ergebnisse waren der Nachweis der neuroprotektiven Effekte durch die Deletion des V1a-Rezeptors, wodurch das posttraumatische Hirnödem und der sekundäre Hirnschaden 24 h nach Trauma um knapp 30% reduziert wurde, der posttraumatische Gewichtsverlust über 7 Tage verringert sowie die neurologische Funktion über 7 Tage nach experimentellem SHT signifikant verbessert war. Die murinen AQP1, 4 & 9 Primer waren spezifisch und für die quantitative RT-PCR geeignet. Auf Transkriptionsebene wurde AQP1 V1a-Rezeptor-abhängig 24 h nach CCI hochreguliert. AQP4 mRNA wurde konstitutiv exprimiert. AQP9 unterlag auf Transkriptionsebene keiner posttraumatischen Regulation. Auf Proteinebene wurde AQP1 nicht nur auf dem Ependym des Plexus choroideus, sondern erstmals auf kortikalen Neuronen im Maushirn detektiert. AQP4 war ubiquitär auf kortikalen und subkortikalen Astrozyten lokalisiert. Posttraumatisch wurde AQP1 kontralateral und AQP4 periläsional V1a-Rezeptor-abhängig sowohl kurz- als auch langfristig reguliert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass Vasopressin an der Entstehung des sekundären Hirnschadens über V1a Rezeptoren nach experimentellem SHT im Mausmodell beteiligt ist. Die gezeigten anti-ödematösen Effekte werden im V1a-Rezeptor knock-out Mausmodell über Aquaporine vermittelt. Die kurz- und langfristige V1a-Rezeptor-abhängige AQP1 & 4 Regulation im Hirnparenchym korreliert dabei mit der Bildung des posttraumatischen Hirnödems. Somit sind der V1a-Rezeptor sowie AQP1 & 4 ein möglicher pharmakologischer Angriffspunkt für die Prävention und Reduktion des posttraumatischen, sekundären Hirnödems.

Das Ziel der vorliegenden Untersuchung bestand darin, festzustellen, ob Unterschiede bei der Verlustrate von Brackets bei Verwendung von zwei verschiedenen self-etching Primern (SEP) (TransbondTM Plus oder ClearfilTM Protect Bond) innerhalb eines split-mouth-Designs vorhanden sind. Das weiteren sollte die Effektivität von ClearfilTM Protect Bond bezüglich einer möglichen Hemmung der Plaqueakkumulation und Demineralisation untersucht werden. Dazu wurden in dieser prospektiven, longitudinalen, klinischen Studie 24 gesunde Kinder (15 Mädchen und 9 Jungen) im Alter zwischen 12 und 15 Jahren (Durchschittsalter 13,12) untersucht. Die Probanden wiesen eine neutrale Bisslage (Klasse I), milden bis moderaten Engstand, keine Entkalkungen, keine Hypomineralisationen und eine adäquate Mundhygiene vor. Zum Einsatz kamen kieferorthopädische Metallbrackets (equilibrium® 2, Dentaurum, Ispringen, Deutschland). Die Brackets wurden mit dem Adhäsiv TransbondTM XT (3M Unitek, Monrovia, CA) befestigt. Während der Baseline-Untersuchung wurde die frühere Karieserfahrung des jeweiligen Patienten mittels des DMFS-Index erhoben. Eine Woche vor dem Bonding und an jedem dritten Recall wurde der Plaque-Index (PI) erhoben (Silness et al. 1964). Zudem wurde eine visuelle Beurteilung (VR) des Zahnschmelzes, welcher das Bracket umgibt (Bracketumfeld), inzisal und gingival am lateralen Schneidezahn und am ersten Prämolaren durch die Verwendung eines modifizierten Kariesindex (Ekstrand et al. 1998; Geiger et al. 1992; Marcusson et al. 1997) erhoben. Bei der Baseline und während der weiteren Untersuchung konnte mittels DIAGNOdent (KaVo, Biberach, Deutschland) eine Laserfluoreszenz-Messung (LF) jeweils für den gleichen Zahn erhoben werden. Um Unterschiede der gemessenen DIAGNOdent-Werte feststellen zu können, wurden die Differenzen zwischen den ersten Messungen und der jeweiligen Reevaluationen errechnet. Über den Untersuchungszeitraum von 12 Monaten konnten insgesamt 26 Verluste (5,4%) der insgesamt 480 in dieser Studie aufgenommen Brackets an den Zähnen registriert werden. Obwohl signifikant mehr Brackets bei Verwendung von ClearfilTM Protect Bond sich lösten (P=0,002), war der Bracketgesamtverlust (5,4%) klinisch akzeptabell. Die Verteilung der totalen Verlustrate im Ober- und Unterkiefer zeigt, dass eine signifikant höhere Verlustrate für den Oberkiefer festzustellen war (P=0,008). Der Vergleich der konstruierten Kaplan-Maier-Überlebenskurven zeigte, dass hinsichtlich des Verlustrisikos über den ganzen Untersuchungszeitraum hinweg ein signifikanter Unterschied zu Lasten der Brackets, die mit dem SEP ClearfilTM Protect Bond befestigt wurden, vorhanden war. Bei Bracketverlust konnte nur eine geringe Menge an Adhäsiv am Zahnschmelz festgestellt werden. Es kam vielmehr zu Verlusten an der Schnittstelle zwischen Zahnschmelz und Adhäsiv. Nebeneffekte im Sinne von Schmelzrissen oder Schmelzfrakturen wurden nicht festgestellt. Der Plaque-Index (PI), die visuelle Beurteilung (VR) sowie die Differenzen der Laser- Fluoreszenzwerte zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Zähnen, an denen die Brackets mit ClearfilTM Protect Bond befestigt wurden und jenen mit TransbondTM Plus (P>0,05).

Die Buruli-Ulkus-Erkrankung stellt ein gravierendes Problem der öffentlichen Gesundheitsfürsorge in tropischen Ländern dar. Unbehandelt kann die Erkrankung zu Kontrakturen und durch Sekundärinfektionen sogar zum Tode führen. Kontrollstrategien betroffener Länder beschränken sich auf die Früherkennung und die chirurgische Behandlung klinisch diagnostizierter Fälle. Die Diagnostik des Buruli-Ulkus kann anhand des mikroskopischen Nachweises von AFB, der Kultivierung von Mycobacterium ulcerans und der PCR durch die Untersuchung von Abstrichen und Biopsien sowie der histopathologischen Untersuchung von Biopsien durchgeführt werden. Ein diagnostischer Gold-Standard zur Laborbestätigung klinischer Verdachtsfälle existiert nicht. Sensitive Diagnostikmethoden wie Histopathologie oder PCR sind in Endemiegebieten aufgrund technischer Schwierigkeiten oder dem Fehlen ausgebildeten Personals meist nicht verfügbar. Hervorgerufen durch die verzögerte Diagnosestellung, können ausgedehnte Behandlungskosten durch lange Krankenhausaufenthalte entstehen, die ein großes sozioökonomisches Problem der betroffenen Länder darstellen. Es werden daher dringend sensitive Labormethoden, wie die PCR, zur Bestätigung von Verdachtsfällen im frühen Krankheitsstadium benötigt, die zusätzlich noch verlässlich und einfach durchzuführen sind. Allerdings wird die Durchführung konventioneller PCR-Techniken unter tropischen Bedingungen vor allem aufgrund des Klimas, der fehlenden Laborausstattung, unzuverlässiger Stromversorgung und den begrenzten finanziellen Möglichkeiten der Gesundheitssektoren der Endemiegebiete erschwert. Die im Rahmen dieser Arbeit anhand der derzeit zur Diagnose der Buruli-Ulkus-Erkrankung verwendeten Standard-PCR-Methode entwickelte, auf Trockenreagenzien basierende, DRB-PCR ist aufgrund ihrer vereinfachten Handhabung perfekt an tropische Bedingungen und die dort vorherrschenden schwierigen klimatischen und technischen Begebenheiten angepasst: Zur Durchführung der DRB-PCR werden keine Kühl- und Gefriergeräte oder Generatoren zur Stabilisierung der Stromversorgung benötigt, da alle Reagenzien bei Raumtemperatur gelagert werden können. Die Qualität der Reagenzien ist stets vergleichbar, da sie nicht, wie gefroren gelagerte PCR-Reagenzien, durch die in tropischen Ländern üblicherweise vorherrschende unzuverlässige Stromversorgung häufigen Auf- und Abtauprozessen unterliegen. Weiterhin ist das Kontaminationsrisiko gegenüber der Standard-PCR bedeutend vermindert, da außer den lyophyllisierten Primern nur die „PuReTaq Ready-To-Go-PCR-Beads“ und die DNA zugegeben werden muss. Die Materialkosten der DRB-PCR betragen nur ca. 2 – 3 € mehr als die herkömmlicher PCR-Methoden. Es konnte gezeigt werden, dass die DRB-PCR hinsichtlich Sensitivität und Spezifität der Standard-PCR zum Nachweis von M. ulcerans gleichzusetzen ist. Die DRB-PCR bietet sich daher zukünftig zur Routineanwendung in Laboren tropischer Endemiegebiete an. Zur Gewährleistung verlässlicher Ergebnisse ist allerdings optimale Qualität und Beschaffenheit des Untersuchungsmaterials essentiell. Allgemein scheint das Alter der Läsion einen nicht zu vernachlässigenden Einfluss auf die diagnostische Sensitivität der DRB-PCR zu besitzen: Die Untersuchung früher Läsionstypen ist offensichtlich zur Laborbestätigung klinischer Verdachtsfälle geeigneter als ältere Erkrankungsstadien, bei denen teilweise nur noch wenige Bakterien nachweisbar sind. Im Vergleich mit anderen Diagnostikmethoden erscheint die DRB-PCR als sensitivste vor Ort durchführbare Methode geeignet zur Laborbestätigung von Buruli-Ulkus-Verdachtsfällen: Die in dieser Studie ermittelte diagnostische Sensitivität der Mikroskopie betrug bis zu 40 %, die diagnostische Sensitivität der Kultur ist aufgrund der Vorbehandlung der meisten Patienten mit antimykobakteriellen Medikamenten im Studiengebiet nicht repräsentativ. Außerdem erscheint die Kultur aufgrund der langen Generationszeit von M. ulcerans als diagnostische Methode ungeeignet. Durch die DRB-PCR konnte eine diagnostische Sensitivität von bis zu 75 % erreicht werden, die diagnostische Sensitivität der Standard-PCR lag mit ca. 80,0 % nur geringfügig höher. Die Inter-Assay-Übereinstimmungsrate zwischen DRB-PCR und Standard-PCR betrug, abhängig vom Untersuchungsmaterial, > 96 %. Die Ergebnisse der Histopathologie stehen in Endemiegebieten nicht zeitnah zur Verfügung, so dass sich diese Methode lediglich als Referenzmethode bzw. zur Differentialdiagnosestellung eignet. Gemäß bestehenden WHO-Empfehlungen werden derzeit zwei positive Laborergebnisse zur gesicherten Diagnose des Buruli-Ulkus benötigt. Würde nur ein positiver Test als ausreichend angesehen, könnten anhand der im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten 20 % mehr Verdachtsfälle bestätigt werden. Da strukturelle, technische und finanzielle Beschränkungen eine umfassende Labordiagnose in Endemiegebieten erschweren, erscheint es daher sinnvoll, die bestehenden Empfehlungen zu überdenken. Vor dem Hintergrund der Kosten- und Zeitersparnis wäre eine nacheinander erfolgende Stufendiagnostik, beginnend mit weniger sensitiven Nachweismethoden, wie z. B. der Mikroskopie, gefolgt von der Untersuchung der mikroskopisch negativen Proben durch hochsensitive Diagnostikmethoden wie DRB-PCR denkbar. Bei prä-ulzerativen Läsionen würden so > 35 % aller Verdachtsfälle schon allein durch die Mikroskopie bestätigt, durch die DRB-PCR würden noch weitere fast 30 % der Verdachtsfälle bestätigt. Im Falle ulzerativer Läsionen würden präoperativ und nicht-invasiv durch Untersuchung der Abstriche durch Mikroskopie bis zu 35 % der klinischen Verdachtsfälle laborbestätigt, durch anschließende DRB-PCR würden zusätzlich > 30 % gefunden. Postoperativ könnten durch Mikroskopie und PCR der Biopsien weitere 6 % bzw. 5 % der Verdachtsfälle bestätigt werden. Dieser relativ niedrige zusätzliche diagnostische Gewinn ist jedoch in Verbindung mit dem hohen Laboraufwand und den entstehenden Kosten kritisch abzuwägen. Die Daten dieser Arbeit legen nahe, dass Supervision und unterstützendes, regelmäßiges Training des Laborpersonals zur Aufklärung von Faktoren wichtig ist, die die Durchführung und Auswertung diagnostischer Verfahren negativ beeinflussen könnten. Begleitend zur Labordiagnostik durchgeführte EQA-Maßnahmen erscheinen daher essentiell, um die Qualität der Ergebnisse sicherzustellen. Die Qualität der Ergebnisse ist beispielsweise bei der zukünftig denkbaren, vor der Operation durchzuführenden, laborbestätigten Bestimmung der Exzisionsausdehnung von entscheidender Bedeutung. Es war im Rahmen der Studie nicht möglich, visuell eine bakterienfreie Exzisionsweite zu bestimmen. Obwohl die Bakterienkonzentration vom Läsionszentrum zur Peripherie abnimmt, kann makroskopisch gesund erscheinendes, an eine Buruli-Ulkus-Läsion angrenzendes Gewebe M. ulcerans enthalten. Rezidive ließen sich möglicherweise durch die Gabe von antimykobakteriellen Medikamenten, kombiniert mit einer vor der Operation durchgeführten laborunterstützten Bestimmung von bakterienfreien Schnitträndern, vermindern.

Durch vergleichende Analysen von Genom-, cDNA- und EST-Datenbanken konnten neue Mitglieder der murinen CEA-Familie gefunden werden, die im Rahmen dieser Arbeit genauer charakterisiert werden sollten. So wurde das Expressionsverhalten dieser neuen Mitglieder der CEA-Familie auf mRNA-Ebene in einer Vielzahl von embryonalen und adulten Normalgeweben, sowie in einigen ausgewählten Tumoren und Tumorzelllinien mit Hilfe der RT-PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern untersucht. Die Auswertung der Versuchsergebnisse hat gezeigt, dass es erhebliche Unterschiede in der Gewebeverteilung der einzelnen Mitglieder der murinen CEA-Familie gibt. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang ist Ceacam20, das vorwiegend in den untersuchten Adenokarzinomen des Magens zu finden war. Es wird vermutet, dass CEACAM20 über ein funktionelles ITAM-Motiv direkt an der Entstehung epithelialer Neoplasien beteiligt ist. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse können als Grundlage für nachfolgende strukturelle und funktionelle Untersuchungen der neuen Mitglieder der murinen und humanen CEA-Familie gesehen werden.

Fragestellung: Ziel der vorliegenden Untersuchung war es festzustellen, ob durch die Verwendung eines fluoridfreisetzenden, lichthärtenden Versieglers ProSeal (Reliance Orthodontics Inc.) Unterschiede der Scher-Abschäl-Festigkeit bei Anwendung konventionell und mit SEP konditionierten Zähnen vorhanden sind. Weiter galt es zu untersuchen, ob ProSeal die von den Herstellern empfohlenen Haftvermittler ersetzen kann. Material und Methode: Zur Durchführung dieser Studie wurden 300 extrahierte Molaren (ISO 11405) randomisiert 12 verschiedenen Gruppen zugeteilt (n=25). Die verwendeten Brackets (Victory SeriesTwin UBi 0T/0A .022. 3M Unitek) wurden mit der gleichen Adhäsivschichtstärke platziert. Die Zähne wurden im Folgenden 24h in aqua dest. (37°C) gelagert und anschließend einem Thermocycling untezogen. Das Debracketing erfolgte mittels einer Universalprüfmaschiene (quickTest) mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,5 mm/min. Zur statistischen Auswertung wurden eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA), der post hoc Tukey-Test und eine Weibull-Analyse herangezogen. Ergebnisse: Es konnte festgestellt werden, das bei Anwendung von ProSeal, die Scher-Abschäl-Festigkeit nicht negativ beeinflusst wird. Bei Verwendung des Kompomers Assure zeigte ProSeal sagar eine erhöhte Scher-Abschäl-Festigkeit, insbesondere wenn es mit dem vom Herstellr empfohlenen Haftvermittler angewandt wurde. Der höhste Weibull modulus (m) konnte für den selbstkonditionierenden Primer IDEAL 1 ohne Anwendung von ProSeal (m=6,46) und der niedrigste für First Step SEP bei Anwendung von ProSeal (m=2,20) gefunden werden. Die charakteristische Scher-Abschäl-Festigkeit zeigte auch deutliche Unterschiede innerhalb einiger der untersuchten Gruppen. Schlussfolgerung: Obwohl anhand der statistischen Auswertung keine signifikante negative Beeinflussung der Scher-Abschäl-Festigkeit bei zusätzlicher Verwendung von ProSeal sowie auch bei Ersatz des vom Hersteller empfohlenen Haftvermittlers mit diesem fluoridfreiseztenden , lichthärtenden Versiegler vorlag, zeigte die Weibull-Analyse dass der Einsatz von ProSeal in Kombination mit selbstkonditionierenden Primern weniger zuverlässig reproduzierbare Festigkeitswerte ergab.

Bislang wurde angenommen, dass Shiga Toxin 1 (Stx1) im Gegensatz zu Stx2, von dem zahlreiche Varianten existieren, relativ homogen ist. Es waren nur wenige Stx1-Varianten bekannt und diese wiesen mit einer Ausnahme eine Homologie von 99 % mit dem Prototyp aus Phage 933J auf. Neuere Untersuchungen zeigten jedoch, dass auch von Stx1 mehrere Varianten existieren (Stx1c bzw. Stx1OX3, Stx1d und Stx1v52), die deutlich vom Prototyp abweichen (92-97 % Homologie der Aminosäuresequenzen). In der vorliegenden Arbeit wurde das Vorkommen von Stx1-Varianten bei klinisch unauffälligen Rindern, einem wichtigen Reservoir für STEC, untersucht. Dazu wurden 247 Rinderkotproben aus 38 südbayerischen Betrieben nach einer Anreicherungskultur mit PCR auf das Vorhandensein von stx-Genen untersucht und positive Proben mit spezifischen Primern für die unterschiedlichen stx-Suptypen bzw. stx1-Varianten typisiert. Die Isolierung der Keime erfolgte durch Kolonieblothybridisierung. Von den 247 Fäzesproben waren in 124 (50,2 %) Shigatoxin-Gene nachweisbar. Bei der Feindifferenzierung der positiven Proben wiesen 33 nur stx1, 31 nur stx2 und 60 beide Subtypen auf. Von den 93 stx1-positiven Proben enthielten jeweils 16 die Variante stx1c bzw. stx1d. Von den 35 isolierten STEC wiesen sechs, von welchen fünf zu typischen EHEC-Serogruppen (O26, O103 und O157) gehörten, das eae-Gen auf. Ein stx1-, stx2-, eae- und EHEC-hly-positiver O157:H7 sowie ein Sorbit fermentierender O157:H- wurden isoliert. Bei 23 Isolaten konnte EHEC-hly nachgewiesen werden. Vier Isolate mit drei verschiedenen Serotypen (O76:H19, O113:H4, O163:H12 [n=2]) wiesen die Variante stx1c auf, wobei zwei dieser Isolate zusätzlich ein stx2-Gen und das EHEC-hly besaßen. Bei den sechs stx1d-positiven STEC, die den Serogruppen O11:H48, O141:H19, On.t.:H12, On.t.:H48 und Osp:H48 [n=2] angehörten, konnten keine weiteren Virulenzfaktoren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse bestätigen die hohe Prävalenz von STEC beim Rind. Außerdem konnte belegt werden, dass die stx1-Varianten stx1c und stx1d mit einer Häufigkeit von je 6,5 % in einem beachtlichen Anteil der 247 Kotproben vorhanden waren. Das Auftreten von stx1c konnte dabei nicht in direkten Bezug mit dem Kontakt zu Schafen gebracht werden. Da die stx1d-positiven Isolate keine anderen Virulenzfaktoren besaßen, dürfte ihre Pathogenität eher niedrig sein.

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss des potentiellen Tumorsuppressors Pdcd4 auf das invasionsassoziierte Urokinase-Rezeptorgen(uPAR), sowie auf den Invasionsvorgang selbst, untersucht. In verschiedenen gastrointestinalen Karzinomzelllinien wurde eine gegenläufige Expression von uPAR und Pdcd4-mRNA und -Protein nachgewiesen. In Reportergen-Assays unter Verwendung von Wildtyp- und mutiertem uPAR-Promotor zeigte sich nach gleichzeitiger Transfektion von Pdcd4 eine dosisabhängige Suppression der uPARPromotoraktivität. Ferner wurden verschiedene cis-Elemente innerhalb des Promotors als potentielle Mediatoren dieser Regulation identifiziert. Bei diesen handelt es sich potentiell um die Region -402/-350bp mit mutmaßlichen Bindestellen für Sp-1, GATA-1, NF-1 und einem PEA3/ets Element an Position -245 bp. Zusätzlich konnte durch eine Mutation der kombinierten Bindungstelle für Sp-1 und Sp-3 an Position -152/-135bp, die über Pdcd4 ermittelte Suppression der Promotoraktivität aufgehoben werden. In Gelshiftanalysen zeigte sich neben einer verminderten Bindung von Transkriptionsfaktoren der GATA- und Sp-Familie innerhalb der Region -402/-350bp insbesondere eine Erhöhung der Bindung von Sp-3 an Promotorregion - 152/-135bp. Dies impliziert neben den oben genannten Mediatoren, dass Pdcd4 durch Induktion der Bindung von Sp-3 an dieses Element den uPAR-Promotor supprimiert. Darüber hinaus konnte durch die Expression von Pdcd4 die Invasionsfähigkeit der Kolonkarzinomzellinie HCT-116 in vivo reduziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pdcd4 die Promotoraktivität von uPAR über verschiedene cis-aktive Elemente des Promotors supprimiert und belegen erstmals die Regulation eines invasionsassoziierten Gens durch den potentiellen Tumorsuppressor Pdcd4. Ferner wird erstmals Sp-3 als Mediator der Pdcd4 vermittelten Genexpression vorgeschlagen. Daneben postulieren die Invasionsdaten auch eine Funktion von Pdcd4 als potentiellen Suppressor von Teilschritten der Metastasierungskaskade. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit ein neues quantitatives CAM-Modell etabliert werden, das die Invasion und Intravasation von Tumorzellen in vivo spezifisch im Hühnerei-Modell untersucht. Das Protokoll unterscheidet sich von den bisher publizierten Arbeiten durch die Verwendung einer spezifischen TaqMan®-Probe in Zusammenfassung 116 Kombination mit Primern, die spezifisch humane Alu-Sequenzen der YB8-Unterfamilie nachweisen. Durch diese Modifikationen wurde eine höhere Sensitivität der quantitativen Alu-PCR erreicht. Zusätzlich eröffnet die Spezifität der hier entwickelten Primer über den CAM-Assay hinaus die Möglichkeit, humane Zellen und Mikrometastasen auch in murinen in vivo Modellen wie SCID- oder Nacktmäusen nachzuweisen.

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war den Krebspesterreger Aphanomyces astaci, in den drei nordamerikanischen Flusskrebsarten Signalkrebs (Pacifastacus leniusculus), Kamberkrebs (Orconectes limosus) und Roter Amerikanischer Sumpfkrebs (Procambarus clarkii) nachzuweisen. Diese Flusskrebsarten sind zwar gegen die Krebspest resistent, können aber als latent infizierte Tiere Ausscheider des Erregers sein und somit die für die Krebspest empfänglichen Edelkrebse (Astacus astacus) infizieren. Bei dieser in Europa heimischen Art geht die Erkrankung mit 100 % iger Mortalität einher. Daher ist die Bestimmung des Träger-Status der nordamerikanischen Krebse von großer Bedeutung um eine weitere Verbreitung dieser hochinfektiösen Erkrankung in europäischen Gewässern zu verhindern. Im Vergleich zu den Edelkrebsen konnten bereits bei der makroskopischen und post sectionem bei der mikroskopischen Betrachtung der nordamerikanischen Flusskrebse Unterschiede festgestellt werden. Die letztgenannten weisen im Bereich der weichen Abdominalkutikula sowie an den dünnen Gelenkhäuten der Schreitbeine häufig Melanisierungen auf. Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung kann eine Wachstumshemmung der Pilzhyphen durch Melanineinlagerungen beobachtet werden. Unmittelbar nach der Invasion des Pilzes wird das Immunsystem aktiviert und verhindert normalerweise einen Krankheitsausbruch. Lediglich bei Einfluss von Stressoren kommt es zur Immunsuppression nordamerikanischer Krebse und daraufhin nach dem Auftreten der für die Krebspest typischen Symptome häufig zum Tod. Um mittels PCR Aphanomyces astaci in den nordamerikanischen Krebsen nachzuweisen musste zunächst die Pilz-DNA extrahiert werden. Dazu wurde das DNeasy® Tissue-Kit (Qiagen) verwendet. Es wurden unterschiedliche Flusskrebsgewebe zur DNA-Extraktion eingesetzt um die am besten geeignete Stelle zu finden. Die bereits bei Edelkrebsen verwendete weiche Abdominalkutikula erwies sich auch bei den nordamerikanischen Krebsen als äußerst zweckmäßig. Des weiteren konnte bei DNA-Extraktionen aus den Beinansätzen, dem dorsalen Abdomen und dem Telson der Erreger in der nachfolgenden PCR nachgewiesen werden. Da die nordamerikanischen Flusskrebse aufgrund ihres angepassten Immunsystems häufig nur sehr geringe Mengen an Pilz-DNA aufweisen, stellt der Nachweis hier ein Problem dar. Bei nur 50 mg eingesetzter Kutikula, laut Insekten-Protokoll des Tissue Kits, ist unsicher ob gerade in diesem kleinen Gewebestück Pilz-DNA vorhanden ist. Daher wurden auch Zusammenfassung ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 132 Extraktionsversuche vorgenommen bei denen ein kompletter Krebspanzer eines Kamberkrebses (3000 mg) zur DNA-Isolierung eingesetzt wurde. Die benötigte Lysis-Puffermenge wurde dementsprechend erhöht und die Inkubationszeit wurde verlängert. Das Ergebnis der PCR war bei diesem Krebs positiv. Trotzdem wurde beim Großteil der Kamberkrebse nur die weiche Kutikula in die DNA-Extraktion eingesetzt. Hierfür wurden Kutikula-Segmente ausgewählt, die bereits im Lichtmikroskop Melanisierungen oder sogar Pilzhyphen aufwiesen. Bei zahlreichen Krebsen war das Ergebnis der nachfolgenden PCR ebenfalls positiv. Zusammenfassend wird somit deutlich, dass der molekularbiologische Nachweis des Krebspesterreger Aphanomyces astaci auch bei nordamerikanischen Flusskrebsen möglich ist. Sowohl die DNA-Extraktion als auch die PCR, mit teilweise neu entwickelten Primern, können zur Feststellung des „Carrier-Status“ eines nordamerikanischen Krebses dienen.

In dieser Arbeit wurden vier Gene aus T. versicolor isoliert und charakterisiert, die an der Kupferversorgung des Trans-Golgi-Netzwerks, in dem Laccase mit Kupfer beladen wird,beteiligt sind. Die zwei Kupferpermease-Gene cupA und cupB (copper uptake permease) konnten durch Komplementation der S. cerevisiae Deletionsmutanten ∆ctr1 bzw. ∆cup5 mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert werden. Die aus den beiden Genen abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen strukturelle Homologien zu den Proteinen aus der Ctr-Familie und weisen ein in dieser Familie konserviertes MxxxM-Motiv auf. Die Expression beider Gene wird in T. versicolor durch Kupfermangel induziert und durch Kupfergabe reprimiert. Das Gen für das cytosolische Kupferchaperon TahA (Trametes ATX1 homolog) wurde mittels PCR mit degenerierten Primern isoliert. TahA zeigt deutliche Homologie zu Atx1 aus S. cerevisiae, HAH1 aus dem Menschen und CCH aus A. thaliana. TahA kann in Hefe Atx1 funktionell ersetzen: sowohl als Kupfertransportprotein zur im Golgi lokalisierten Kupfer-ATPase Ccc2, als auch bei der Entgiftung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Der Promotor des tahA-Gens enthält Motive, die im Promotor der durch Kupfer regulierten Gene Metallothionein (CUP1) und Cu/Zn-Superoxiddismutase (SOD1) aus S. cerevisiae konserviert sind. Das tahA-Gen wird unter erhöhten Kupferkonzentrationen (>0,25 µM) exprimiert und unter Kupfermangel reprimiert. Es unterscheidet sich somit in der Regulation deutlich vom ATX1-Gen, das unter Eisenmangel und oxidativem Stress induziert wird. Das Gen für die im Golgi-Netzwerk lokalisierte Kupfer-P-Typ-ATPase, ctaA (copper transport ATPase), wurde durch die funktionelle Komplementation einer Hefe ∆ccc2-Mutante mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert. Dadurch wurde zugleich die physiologische Funktion des Proteins bei der Kupferversorgung des Golgi-Netzwerks gezeigt. CtaA weist deutliche Homologien zu den bekannten Kupfer-P-Typ-ATPasen aus dem Menschen (MNKP und WNDP), aus A. thaliana (RAN1) und S. cerevisiae (Ccc2) auf. CtaA enthält alle wichtigen Motive, die für die Kupfertransport- und ATPase-Funktionen in allen anderen Kupfer-P-Typ-ATPasen konserviert sind. Durch die deregulierte Koexpression von tahA und ctaA in S. cerevisiae sowie in T. versicolor konnte eine im Vergleich zum Wildtypstamm bis zu achtfach höhere Laccase-Expression erreicht werden. Dies zeigt, dass die Überexpression von Genen, die an der Versorgung des sekretorischen Systems mit Kupfer beteiligt sind, ein Mittel darstellt, um die Expression von sekretierten, kupferabhängigen Enzymen zu steigern. Durch Anzucht von T. versicolor unter Kupfermangel wurde eine Apo-Form der Laccase hergestellt und gereinigt, die kein für blaue Oxidasen typisches Absorptionsmaximum bei 600 nm besaß und die kaum Aktivität aufwies. AAS-Untersuchungen zeigten, dass weniger als ein Kupferion pro Laccase-Molekül in dieser Proteinpräparation vorhanden war. Durch die in vitro Beladung dieser Apo-Laccase mit Kupfer konnte die Enzymaktivität wiederhergestellt werden. Die Bedingungen hierfür waren ein niedriger pH-Wert,reduzierende Bedingungen und das Vorhandensein von NaCl. Eine spontane Beladung der Laccase im Golgi scheint daher ohne Mitwirkung eines weiteren Faktors möglich zu sein.