Podcasts about patientenseren

Aspergillus fumigatus ist der häufigste zum Tode führende opportunistische Erreger invasiver Mykosen des Menschen. Durch den zunehmenden Einsatz von Immunsuppressiva und agressiverer Chemotherapieschemata, aber auch durch Zunahme von Organ- und Stammzelltransplantationen, steigt die Zahl abwehrgeschwächter Patienten stetig an und mit ihnen die Zahl der Invasiven Aspergillosen. Bei steigender Inzidenz blieb die Letalität trotz weiterentwickelten Therapiemöglichkeiten in den letzten Jahren nahezu konstant. Einer der Hauptgründe dafür ist die meist späte Diagnostik der Erkrankung, welche bei Entdeckung häufig so weit fortgeschritten ist, dass jeder Therapieversuch zu spät kommt. Diese Situation erfordert dringend die Einführung von neuen diagnostischen Methoden zur Früherkennung der Invasiven Aspergillose. Ein Ansatz in dieser Arbeit sollte sein, herauszufinden welche Makromoleküle von A. fumigatus sezerniert, und damit beim Patienten in den Blutkreislauf oder Urin gelangen. Anschließend sollte untersucht werden, ob diese Pilz-Makromoleküle auch unter Infektionsbedingungen im Menschen exprimiert werden und letztendlich im Serum detektierbar sind. Dazu wurde A. fumigatus in unterschiedlichen Medien kultiviert und sezernierte Proteine analysiert. Pilzproteine sind für die Diagnostik so wichtig, da sie als erregerspezifische Antigene mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen werden können. Umgekehrt können diese Antigene auch im Patienten eine Antikörperantwort induzieren, die mittels Antigen nachgewiesen werden kann. Von den elf sezernierten Proteinen, die in dieser Arbeit identifiziert wurden, wurden zwei Proteine näher charakterisiert: Die Protease Aspergillopepsin1 (PEP1) und das Toxin Hämolysin (Hly). Gegen diese beiden Proteine wurden monoklonale Antikörper (mAk) generiert, wofür Hly zuerst rekombinant hergestellt werden musste. Mithilfe monoklonaler Antikörper wurden sowohl die Sekretionsbedingungen von PEP1 und Hly genauer charakterisiert als auch versucht, in Patientenserum diese zwei Proteine nachzuweisen. Leider konnte weder PEP1 noch Hly im Serum detektiert werden. Grund dafür könnte ein vorzeitig stattgefundener Verdau durch serumeigene Proteasen sein, oder eine zu geringe Konzentration der beiden Proteine im Serum. Die Sensitivität dieses Test könnte verbessert werden, in dem diese monoklonalen Antikörper z.B. innerhalb eines Sandwich-ELISAS eingesetzt werden. Neben Proteinen haben sich in der Vergangenheit auch Polysaccharide von A. fumigatus als geeignete diagnostische Marker einer invasiven Aspergillose erwiesen. Zwar haben sie den Nachteil, als Zellwandbestandteil von Pilzen nicht Aspergillus spezifisch zu sein. Dagegen haben sie für den Nachweis im Serum andere Vorteile: Sie sind sehr stabile Moleküle (z.B. hitzebeständig) und werden in größeren Mengen von A. fumigatus produziert und freigesetzt, sodass sie bereits mit weniger sensitiven Methoden detektierbar sind. In dieser Arbeit wurden nach Immunisierung zweier Mäuse mit A. fumigatus-Kulturüberstand u.a. zwei Antikörper gegen Galaktofuranose (Galf) identifiziert. Galaktofuranose kommt nicht nur als Seitenkette des Galaktomannans, einem Hauptbaustein der Aspergillus-Zellwand, vor, sondern ist auch Bestandteil vieler sezernierter Pilz-Glykoproteine. Das Vorkommen sowohl als fester Bestandteil der Zellwand und gleichzeitig als in die Umgebung abgegebenes Molekül macht den Zuckerrest Galaktofuranose nicht nur zu einem brauchbaren Marker für histopathologische Untersuchungen sondern auch für die Serologie. Anhand einer Galf-Deletionsmutante von A. fumigatus konnte die Spezifität zweier monoklonaler Antikörper (L-10-1 und L-99-13) gezeigt werden. Diese Antikörper wurden im Folgenden genutzt, um die Expressionsbedingungen von Galaktofuranose-Resten in A. fumigatus näher zu untersuchen. Es fiel auf, dass die Freisetzung von Zellwandbestandteilen mit Galaktofuranose-Resten stark von der Zusammensetzung des Kulturmediums abhängig ist und erst mit Auskeimung der Sporen einsetzt. Des weiteren sollte mit Hilfe der beiden α-Galf-Antikörper versucht werden in Patientenserum Galaktofuranose-Reste zudetektieren. Hierzu wurde ein Sandwich-ELISA aufgebaut, der in zwei Varianten jeweils einen der beiden α-Galf-Antikörper als Fänger-Ak nutzte und den mAk L-10-1 (nach Konjugation mit Peroxidase) als Detektor-Ak. Es konnte gezeigt werden, dass dieser ELISA in Patientenseren sehr sensitiv Galaktofuranose-haltige Bestandteile nachweist und damit die Differentialdiagnostik einer invasiven Infektion durch A. fumigatus verbessern könnte. Nach den in dieser Arbeit erhobenen Daten kann die Sensitivität gegenüber dem kommerziell verfügbaren ELISA vermutlich noch erhöht werden. Bezüglich der Spezifität konnten die Probleme mit Galaktofuranose-Reste enthaltenen Antibiotika (wie Augmentan®) jedoch nicht beseitigt werden. Die guten Ergebnisse, die in dieser Arbeit mit dem L-10-1-ELISA erzielt wurden, führten dazu, dass dieser ELISA zur Zeit für den Einsatz in der Routinediagnostik am Max-von-Pettenkofer-Institut validiert wird.

Extraintestinal pathogene Escherichia coli (ExPEC) sind die häufigsten Erreger von Harnwegsinfektionen beim Menschen. Darüber hinaus können sie eine Vielzahl weiterer Erkrankungen wie Pneumonie, Wundinfektion, Neugeborenenmeningitis oder Sepsis hervorrufen. Hierzu verfügen ExPEC über ein breites Repertoire von Pathogenitätsfaktoren wie Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahmesysteme. Wesentlicher Bestandteil von Eisenaufnahmesystemen sind Rezeptoren in der bakteriellen Außenmembran, wie z. B. die Siderophorrezeptoren FyuA und IroN sowie der Häminrezeptor ChuA. Ihre Assoziation mit der Virulenz von ExPEC und die Lokalisation in der Außenmembran bzw. an der bakteriellen Oberfläche lassen Eisenaufnahmerezeptoren als geeignete Zielstrukturen eines Impfstoffes gegen ExPEC erscheinen. Die vorliegende Arbeit erbrachte grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der Eignung von Eisenaufnahmerezeptoren als potentielle Zielstrukturen, indem Seren von Patienten mit einer E. coli-Infektion und Seren aus dem Mausinfektionsmodell im Immunoblot auf Antikörper gegen FyuA, ChuA und IroN untersucht wurden. Hierzu wurde eine Sammlung von E. coli-Patientenisolaten und der entsprechenden Patientenseren angelegt. Die Isolate wurden mittels PCR hinsichtlich mehrerer ExPEC-assoziierter Gene, u. a. fyuA, chuA, iroN und usp charakterisiert. Im Immunoblot wurden dann die Seren auf Antikörper gegen die rekombinanten Proteine FyuA, IroN, ChuA und Usp getestet. Im Unterschied zu FyuA, ChuA und IroN handelt es sich bei dem zusätzlich untersuchten Usp um ein ExPEC-Protein mit bisher weitgehend unklarer Funktion. Die unterschiedliche Prävalenz von ExPEC-assoziierten Faktoren unter den Patientenisolaten konnte bestätigt werden. Es gelang erstmals, bei Patienten spezifische Antikörper gegen Eisenaufnahmerezeptoren von ExPEC nachzuweisen. Für die hierzu durchgeführten Immunoblot-Untersuchungen konnte in dieser Arbeit erstmals der Häminrezeptor ChuA rekombinant exprimiert und aufgereinigt werden. Die humorale Immunantwort gegen die einzelnen Eisenaufnahmerezeptoren wies ein relativ heterogenes Bild auf. Während bei den Patienten einerseits Antikörper unter der Infektion gebildet wurden (ChuA), waren sie andererseits bei IroN offenbar schon vorher vorhanden oder konnten, wie für FyuA gezeigt, nicht nachgewiesen werden. Auch im Mausmodell der ExPEC-Peritonitis fanden sich nur Antikörper gegen IroN, die in einem entsprechenden Tiermodell der ExPEC Harnwegsinfektion nicht darstellbar waren. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit ist es denkbar, dass die Bildung von Antikörpern gegen ExPEC-Außenmembranproteine zum einen von der Intensität und der Dauer der Infektion und zum anderen von Unterschieden in der Expression und in der Immunogenität der einzelnen Eisenaufnahmerezeptor-Proteine abhängig ist. Es ist jedoch nicht völlig auszuschließen, dass auch methodische Gründe(z. B. bei der Durchführung des Immunoblots) die Antikörpernachweise negativ beeinflusst haben. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten die Bedeutung von Eisenaufnahmerezeptoren als potentielle Zielstrukturen eines Impfstoffes bestätigen. Insbesondere die Rolle von IroN wurde durch die Beobachtungen unterstrichen. Die unterschiedliche Prävalenz der einzelnen Eisenaufnahmesysteme unter ExPEC und die Unterschiede der humoralen Immunantwort deuten jedoch darauf hin, dass es nötig sein wird, einen polyvalenten Kombinationsimpfstoff herzustellen, der gleichzeitig gegen mehrere Eisenaufnahmerezeptoren sowie weitere Zielstrukturen wie Adhäsine und Toxine Antikörperantworten erzeugt

Die Toxocariasis des Menschen ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit. Die Übertragung erfolgt auf fäkal-oralem Weg durch Aufnahme von Wurmeiern, die von den natürlichen Wirten - Hunden und Füchsen - ausgeschieden werden. Die Pathologie wird durch Wanderung, Lokalisation, Anzahl der Larven und durch die Intensität der Abwehrreaktion des Wirtes bestimmt. Diese bedingt beim Menschen, der eigentlich Fehlwirt ist, ein klinisch sehr variables Erscheinungsbild. Unterschieden werden können das klinisch meist schwerwiegendere okuläre und das klinisch eher polymorphe viszerale Larva migrans- Syndrom. Aber nicht nur die klinische Diagnostik angesichts unterschiedlich häufiger und unterschiedlich ausgeprägter klinischer und laborchemischer Befunde und Symptome erscheint schwierig. Der Nachweis der Larve im Biopsat oder Punktat kann nur selten geführt werden, so dass der Immundiagnostik eine besondere Bedeutung zukommt. Die Aussagekraft der Antikörpernachweismethoden, wie der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder der Enzyme-linked Immunoelectrotransfer Blot (EITB) mit dem exkretorisch/sekretorischen (E/S) Antigen der Zweitlarve werden durch den fehlenden Goldstandard, durch die Kreuzreaktionen mit Antigenen verwandter Helminthen oder auch mit weit verbreiteten Antigenen wie dem Phosphorylcholin (PC) und durch den Durchseuchungstiter eingeschränkt. Da sich der IgG4-ELISA bereits in der Immundiagnostik anderer Helminthosen, wie den Filariosen und Echinokokkosen bewährt hat, erschien die Untersuchung des IgG4-ELISA auch bei einer Toxocariasis ein sinnvoller Ansatz zur Verbesserung der Diagnostik. Auf der Basis des bereits etablierten IgG-ELISA wurde daher ein IgG4-ELISA getestet. Als Untersuchungsmaterial standen uns 4298 Patientenseren mit dem Verdacht auf eine Toxocariasis, 59 kreuzreagierende Seren von Patienten mit einer nachgewiesenen anderen Helminthose und 997 Blutspenderseren zur Verfügung. Diese drei Kollektive wurden mit dem IgG-ELISA auf Antikörper gegen T.canis getestet. Auswahlkriterium war ein Antikörpertiter >100 Antikörpereinheiten (AKE). Das erste Kollektiv reduzierte sich dadurch auf 427 Seren. An Hand von 22 histologisch nachgewiesenen und publizierten Toxocariasis-Fällen haben wir ein klinisches Scoresystem entwickelt und konnten schließlich aus den 427 Patienten 100 gemäß Kriterien der CDC in eine Gruppe mit 43 wahrscheinlichen und eine Gruppe mit 57 möglichen Toxocariasis-Fällen einteilen. Für die Evaluation des IgG4-ELISA standen somit schließlich 100 Seren von Personen mit dem Verdacht einer Toxocariasis zur Verfügung. An Hand des Auswahlkriteriums reduzierte sich das zweite Kollektiv von 59 auf 18, und das dritte Kollektiv von 997 auf 24 Personen. Die Untersuchung dieser Kollektive schließlich mit dem IgG4-ELISA ergab: 33% positive Ergebnisse bei den Seren von Patienten mit dem Verdacht einer Toxocariasis (ohne Unterschied zwischen den beiden klinischen Gruppen), 17% bei den Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose und 21% bei den Blutspenderseren. Das bedeutet, dass nach Untersuchung mit zwei Testverfahren (IgG- und IgG4-ELISA) die Anzahl positiver Befunde bei den Patienten mit Verdacht einer Toxocariasis doppelt so groß wie bzw. um mehr als ein Drittel größer ist als bei den anderen Kollektiven. Ein positiver Befund in beiden Testverfahren kann somit als Indikator für eine Toxocariasis dienen und stellt zusammen mit klinischen und laborchemischen Befunden und Symptomen das beste Verfahren zur Diagnostik einer Toxocariasis dar, zumal bei den anderen beiden Kollektiven (Blutspenderseren, Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose) keine Assoziation zwischen den Testverfahren, laborchemischen und klinischen Befunden und Symptomen besteht. Der IgG4-ELISA trägt hierbei, wie die Untersuchungen zeigen, zu einer Verbesserung v.a. der Spezifität der serologischen Untersuchungen bei.

Die Toxocariasis des Menschen ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit. Die Übertragung erfolgt auf fäkal-oralem Weg durch Aufnahme von Wurmeiern, die von den natürlichen Wirten - Hunden und Füchsen - ausgeschieden werden. Die Pathologie wird durch Wanderung, Lokalisation, Anzahl der Larven und durch die Intensität der Abwehrreaktion des Wirtes bestimmt. Diese bedingt beim Menschen, der eigentlich Fehlwirt ist, ein klinisch sehr variables Erscheinungsbild. Unterschieden werden können das klinisch meist schwerwiegendere okuläre und das klinisch eher polymorphe viszerale Larva migrans-Syndrom. Aber nicht nur die klinische Diagnostik angesichts unterschiedlich häufiger und unterschiedlich ausgeprägter klinischer und laborchemischer Befunde und Symptome erscheint schwierig. Der Nachweis der Larve im Biopsat oder Punktat kann nur selten geführt werden, so dass der Immundiagnostik eine besondere Bedeutung zukommt. Die Aussagekraft der Antikörpernachweismethoden, wie der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder der Enzyme-linked Immunoelectrotransfer Blot (EITB) mit dem exkretorisch/sekretorischen (E/S) Antigen der Zweitlarve werden durch den fehlenden Goldstandard, durch die Kreuzreaktionen mit Antigenen verwandter Helminthen oder auch mit weit verbreiteten Antigenen wie dem Phosphorylcholin (PC) und durch den Durchseuchungstiter eingeschränkt. Da sich der IgG4-ELISA bereits in der Immundiagnostik anderer Helminthosen, wie den Filariosen und Echinokokkosen bewährt hat, erschien die Untersuchung des IgG4-ELISA auch bei einer Toxocariasis ein sinnvoller Ansatz zur Verbesserung der Diagnostik. Auf der Basis des bereits etablierten IgG-ELISA wurde daher ein IgG4-ELISA getestet. Als Untersuchungsmaterial standen uns 4298 Patientenseren mit dem Verdacht auf eine Toxocariasis, 59 kreuzreagierende Seren von Patienten mit einer nachgewiesenen anderen Helminthose und 997 Blutspenderseren zur Verfügung. Diese drei Kollektive wurden mit dem IgG-ELISA auf Antikörper gegen T.canis getestet. Auswahlkriterium war ein Antikörpertiter >100 Antikörpereinheiten (AKE). Das erste Kollektiv reduzierte sich dadurch auf 427 Seren. An Hand von 22 histologisch nachgewiesenen und publizierten Toxocariasis-Fällen haben wir ein klinisches Scoresystem entwickelt und konnten schließlich aus den 427 Patienten 100 gemäß Kriterien der CDC in eine Gruppe mit 43 wahrscheinlichen und eine Gruppe mit 57 möglichen Toxocariasis-Fällen einteilen. Für die Evaluation des IgG4-ELISA standen somit schließlich 100 Seren von Personen mit dem Verdacht einer Toxocariasis zur Verfügung. An Hand des Auswahlkriteriums reduzierte sich das zweite Kollektiv von 59 auf 18, und das dritte Kollektiv von 997 auf 24 Personen. Die Untersuchung dieser Kollektive schließlich mit dem IgG4-ELISA ergab: 33% positive Ergebnisse bei den Seren von Patienten mit dem Verdacht einer Toxocariasis (ohne Unterschied zwischen den beiden klinischen Gruppen), 17% bei den Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose und 21% bei den Blutspenderseren. Das bedeutet, dass nach Untersuchung mit zwei Testverfahren (IgG- und IgG4-ELISA) die Anzahl positiver Befunde bei den Patienten mit Verdacht einer Toxocariasis doppelt so groß wie bzw. um mehr als ein Drittel größer ist als bei den anderen Kollektiven. Ein positiver Befund in beiden Testverfahren kann somit als Indikator für eine Toxocariasis dienen und stellt zusammen mit klinischen und laborchemischen Befunden und Symptomen das beste Verfahren zur Diagnostik einer Toxocariasis dar, zumal bei den anderen beiden Kollektiven Blutspenderseren, Seren von Patienten mit einer anderen Helminthose) keine Assoziation zwischen den Testverfahren, laborchemischen und klinischen Befunden und Symptomen besteht. Der IgG4-ELISA trägt hierbei, wie die Untersuchungen zeigen, zu einer Verbesserung v.a. der Spezifität der serologischen Untersuchungen bei.