Podcasts about zum nachweis

Nach der EU-Maschinenrichtlinie 2006/42/EG darf ein Hersteller von Maschinen keine Maschinen in Verkehr bringen, von denen eine Gefahr ausgeht. Zum Nachweis führt er eine CE-Konformitätsbewertung durch, die eine Risikoanalyse umfasst. Die Maschinenrichtlinie beschreibt den Prozess der Risikoanalyse sehr allgemein. Manche Normen geben jedoch ein Verfahren im informativen Anhang an. Der Maschinenhersteller ist in der Wahl des Verfahrens frei.Um welche Normen es sich dabei handelt, welche rechtlichen Hintergründe generell bestehen und welche Methoden und Verfahren für eine Risikoanalyse eingesetzt werden können, beschreibt Rolf Brunner, Senior Safety Expert bei Leuze, in diesem Podcast Maschinensicherheit des Fachmagazins konstruktionspraxis im Gespräch mit konstruktionspraxis-Redakteur Jan Vollmuth.In diesem Podcast erfahren Sie unter anderem:Welche Normen wichtig sind,welche Verfahren zur Risikoeinschätzung es gibt,worin sich diese unterscheidenund was man tut, wenn ein Risiko erkannt wird.Hier geht es zu den Seminaren zum Thema Maschinensicherheit der Vogel Akademie.

Thu, 07 Dec 2023 03:00:00 +0000 https://geschichteeuropas.podigee.io/t268-268 b86af7672c6e10cc4ed8e2074ed3be39 Y: Quellen Ressourcen Ich danke Frau Dr. Veruschka Wagner für die Unterstützung bei der Produktion dieses Quellentrailers. Verknüpfte Folgen Transottomanica: Sklaverei und Mobilität im frühneuzeitl. Istanbul, mit Dr. Veruschka Wagner [Univ. Leipzig] (14.12.2023) Zum Podcast UNTERSTÜTZE DEN PODCAST BEI STEADY! Marlon unterstützt den Podcast seit März 2023 mit einem Betrag, der den monatlichen Hosting-Kosten entspricht. Dafür möchte ich ihm hier ganz besonders danken! Podcast-Blog mit Kommentarfunktion #historytelling - Netzwerk unabhängiger Geschichtspodcasts Schick mir Kommentare und Feedback als Email! Der Podcast bei Fyyd Folge mir bei Mastodon! Frag mich nach deiner persönlichen Einladung ins schwarze0-Discord! Die Episoden werden thematisch und nicht nach Erscheinungsdatum nummeriert. Für einen chronologischen Durchgang zur europäischen Geschichte sollten die Episoden nach Namen sortiert werden. schwarze0fm hatte als Hobbyprojekt begonnen - inzwischen habe ich aber durch Auftragsproduktionen und Crowdfunding die Möglichkeit gewonnen, mehr und bessere Folgen für Geschichte Europas zu produzieren. Das Prinzip "schwarze Null" bleibt - die Einnahmen werden verwendet, für mich Rahmenbedingungen zu schaffen, den Podcast zu betreiben und weiterzuentwickeln. In dieser Folge habe ich das ausführlich erklärt. This episode of "Geschichte Europas" by schwarze0fm (Tobias Jakobi) first published 2023-12-07. CC-BY 4.0: You are free to share and adapt this work even for commercial use as long as you attribute the original creator and indicate changes to the original. 268 trailer Y: Quellen no Südeuropa,Istanbul,Osmanisches Reich,17. Jahrhundert,Quelle,Gerichtsakte,Sklavere

Wer elektrische (Medizin-)Produkte in den USA in den Markt bringen will, muss nicht nur die Anforderungen der FDA erfüllen. Zum Nachweis dieser Anforderungen wie z.B. der elektrischen Sicherheit müssen die Hersteller Nachweise erbringen. Dazu beauftragen diese meist Labors. Im Gespräch mit Beat Keller klärt Professor Johner - auf was die Hersteller bei der Auswahl der Labore achten sollten, - welche Nachweisdokumente die Labore erstellen (z.B. CB-Reports, NRTL Descriptive Reports) und - wann die Prüfungen sogar in den Räumlichkeiten der Hersteller stattfinden dürfen -- Stichwort "Witness Testing". Die beiden öffnen auch den Blick auf Länder außerhalb der USA.

Brasserie: Speicheltests zum Nachweis einer Corona-Infektion

Themen: - Zum Nachweis der Steuerbefreiung von Ausfuhr-Transportleistungen - Ergebnisverteilung bei Gesellschafterwechsel einer vermögensverwaltenden Personengesellschaft - Wohnungseigentümergemeinschaft als gewerbliche Mitunternehmerschaft Weitere Informationen finden Sie unter: http://blogs.pwc.de/steuern-und-recht/

Sat, 18 Jul 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18489/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18489/1/Acaroez_Ulas.pdf Acaröz, Ulaş

Sat, 18 Jul 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18595/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18595/1/Schulz_Catharina.pdf Schulz, Catharina

Cronobacter spp. sind opportunistische pathogene Erreger, die insbesondere nach der Aufnahme kontaminierter Lebensmittel schwere Infektionen mit hohen Letalitätsraten bei Neugeborenen und immungeschwächten Erwachsenen hervorrufen können. Um spezifische immunchemische Nachweisverfahren für diese Keimgruppe zu etablieren, wurden in der vorliegenden Arbeit monoklonale Antikörper (mAK) zum Nachweis von Cronobacter spp. generiert und umfassend charakterisiert. Zur Präparation der Immunogene wurden Cronobacter-Keime mit Polymyxin B behandelt und anschließend wurden Mäuse entweder mit dem durch Zentrifugation erhaltenem Zellpellet (Ghosts) oder mit dem zellfreien Überstand (Lysat) dieser Präparationen immunisiert. Beide Präparationen erwiesen sich als hoch immunogen, die nachweisbaren Titer lagen üblicherweise bei > 1:10.000. Insgesamt konnten 14 stabile Hybridomzelllinien (sieben je Ansatz) etabliert werden. Die Intra- bzw. Inter-Genus-Spezifität und Affinität der entsprechenden mAK wurde umfassend unter Verwendung von indirekten EIA-Verfahren überprüft. Für Studien zur Epitopspezifität der generierten mAK wurden Immunoblots und Immunfluoreszenz-Analysen eingesetzt. Alle mAK, die aus der Immunisierung mit Cronobacter-Ghosts resultierten, zeichneten sich durch ein sehr breites Reaktionsspektrum aus, Kreuzreaktionen wurden vorzugsweise mit Vertretern aus der Familie der Enterobacteriaceae aber auch mit anderen gramnegativen Keimen beobachtet. Für alle mAK konnten Proteine als antigene Determinanten identifiziert werden, die relativen Molekulargewichte reaktiver Proteinbanden lagen üblicherweise im Bereich von > 40 kDa. Demgegenüber zeigten sechs der sieben mAK, die aus der Immunisierung von Mäusen mit Polymyxin B generierten Lysat-Präparationen resultierten, eine hohe Affinität für die O-spezifische Seitenkette der Cronobacter-typischen Lipopolysaccharide (LPS): mAK 2G4 αL reagierte hochspezifisch mit dem C. turicensis-Stamm (MHI 21026; Serotyp O1). Im indirekten EIA war dieser Erreger bei Keimzahlen von ca. 104 KbE/ml noch nachweisbar. Für die weiteren fünf mAK, die alle spezifisch mit C. sakazakii des Serotyps O1 reagierten, wurden im indirekten EIA Nachweisgrenzen im Bereich von 105-107 KbE/ml ermittelt. Alle mAK gegen LPS gehören zum IgG-Subtyp und reagierten in der Immunfluoreszenz mit lebenden Cronobacter-Keimen.

Die Dissertation beschreibt den ersten Fall des endemischen Auftretens des "Neobitoten" Fascioloides magna bei Gehegewild in Deutschland und diskutiert mögliche Infektionswege, die Habitateignung des Geheges und die Bedeutung des Auftretens des Leberparasiten für Gehegewild, freilebendes Wild und landwirtschaftliche Nutztiere. Zudem geht sie auf den Befall mit weiteren, koproskopisch nachweisbaren Endoparasiten ein und vergleicht die drei im Gehege gehaltenen Zervidenspezies hinsichtlich ihres Parasitenspektrums und der Ausscheidungsintensität von Parasitenstadien im Jahresverlauf.

Die gebräuchliche Therapie gegen Milzbrand besteht aus der Gabe von Antibiotika. Als Therapie der Wahl gilt hierbei das Fluorochinolon Ciprofloxacin. Resistenzen gegen dieses Antibiotikum wurden bei B. anthracis in vivo noch nicht, in vitro jedoch im Rahmen mehrerer Studien beschrieben. Es existieren herkömmliche Resistenztests, wie der Gradientendiffusions- oder der Mikrodilutionstest, welche bei einer Milzbranderkrankung genutzt werden können. Diese nehmen jedoch aufgrund der kulturellen Anzucht in einem Labor der Schutzstufe 3 vor der Durchführung des Tests ein bis zwei Tage Zeit in Anspruch. Um diese Zeitspanne zu verkürzen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Schnelltests entwickelt. Diese basieren auf einer real-time-PCR Methode, mit welcher Ciprofloxacin-Resistenz verursachende Punktmutationen (= SNPs), nachgewiesen werden. Im ersten Abschnitt dieser Studie wurde der B. cereus Stamm ATCC10987 resistent gegen Ciprofloxacin generiert. Aufgrund der Dual-Use-Research-of-Concern-Problematik wurde dieser, wenig pathogene, aber genotypisch sehr nah mit B. anthracis verwandte, BSL-2-Organismus verwendet. Die Resistenzbildung erfolgte durch natürliche Selektion, indem der B. cereus Wildtyp mehrfach auf Ciprofloxacin-haltigen Agar-Platten, welche eine steigende Konzentration des Antibiotikums enthielten, angezüchtet wurde. Es folgte eine Sequenzierung der Quinolone Resistance Determinig Region (= QRDR), bestehend aus den Genen gyrA, gyrB, parC und parE, von neun B. cereus Mutanten, welche CIP-Resistenzen entwickelt hatten. Eine der Mutanten besaß einen SNP im Gen gyrA an Stelle 254 mit einer Mutation der Base Cytosin in ein Thymin. Solche SNPs stellen eine mögliche Ursache der Resistenz gegen Fluorochinolone dar. Acht der B. cereus Mutanten besaßen jedoch keine SNPs in der QRDR. Die Ursache für deren Resistenz wird in der erhöhten Funktion von Effluxpumpen vermutet. Im zweiten Teil der Studie wurden die Schnelltests entwickelt. Es wurden mehrere Protokolle für die beiden real-time-PCR Methoden TaqMan® und MeltMAMA (= Melt Analysis of Mismatch Amplification Mutation Assays) erstellt und getestet. Der Vergleich beider Methoden wertete den TaqMan® als die Methode der Wahl für die gesetzte Zielstellung. Daraufhin wurden für acht bekannte Ciprofloxacin-Resistenzen auslösende SNPs TaqMan®-Protokolle entwickelt. Im Abschluss wurden diese durch Versuche mit verschiedenen B. anthracis Stämmen, dem B. cereus ATCC10987 Wildtyp und seinen Mutanten, synthetisch hergestellten Templates, die als Mutationskontrollen genutzt wurden, sowie verschiedenen Bacillus Spezies hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität erprobt. Es wurden acht TaqMan® Protokolle erarbeitet, welche SNPs in der QRDR von B. anthracis nachweisen und somit eine schnelle Diagnose vieler Ciprofloxacin-resistenter Stämme gewährleisten. Der Einsatz dieser Schnelltests zusätzlich zu den herkömmlichen Empfindlichkeitstests gibt die Möglichkeit eine optimale Therapie von Milzbrandinfektionen in einem verkürzten Zeitraum zu gewährleisten.

Sat, 12 Jul 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17414/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17414/1/Mende_Katherina.pdf Mende, Katherina ddc:590, ddc:50

Mykobakterien sind heterogene Krankheitserreger und befallen Mensch und Tier. Der bekannteste Vertreter ist das Mycobacterium tuberculosis als Hauptverursacher der Tuberkulose und wichtigster Vertreter des M. tuberculosis-Komplexes. Daneben gibt es Mycobacteria other than tuberculosis, die MOTTS, die für verschiedene Krankheitsbilder bei unterschiedlichen Spezies verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurde der Versuch der molekularbiologischen Stammdifferenzierung bei einer größeren Zahl Formalin fixierter und in Paraffin eingebetteter Proben vorgenommen. Hierbei wurden sowohl Patientenproben als auch Proben aus dem veterinärmedizinischem Bereich herangezogen, die zunächst histologisch begutachtet wurden. Bei fünf von 12 veterinärmedizinischen Fällen wurden säurefeste Stäbchen in der Ziehl-Neelsen Färbung gefunden. In der molekularen Untersuchung wurden bei allen diesen Fälle bis auf einen, bei dem die DNA vermutlich gehemmt ist, und einem zweiten, der in der Färbung unauffällig war, die Anwesenheit von Mykobakterien bestätigt. Bei diesem in der Färbung unauffälligen Fall wurde das Vorhandensein von unbekannten Mykobakterien nachgewiesen. Bei den übrigen vier Fällen wurde dreimal das M. avium subsp. avium, normalerweise Erreger der Geflügeltuberkulose, und einmal das M. avium subsp. paratuberculosis nachgewiesen. M. avium subsp. paratuberculosis ist Erreger der Paratuberkulose, einer chronischen Enteritis bei Rindern. Es konnten keine Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes nachgewiesen werden. Aus dem Bereich der Humanmedizin wurden Patientenproben aus der Routinediagnostik histologisch und molekularbiologisch mit PCR und Spoligotyping untersucht. In der Ziehl-Neelsen-Färbung wurde histologisch nach Tuberkulose-typischen Auffälligkeiten wie Granulome, Epitheloidzellen und Nekrosen gefahndet. Anschließend wurden die Proben molekularbiologisch mit PCR auf β-Aktin als Hinweis auf replizierbare DNA und auf IS6110 als Hinweis auf Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes untersucht. IS6110-positive Proben wurden mit dem Ziel der genauen Stammdifferenzierung dem Spoligotyping zugeführt. Spoligotyping ist eine auf PCR basierende Technik, die gerne für epidemiologische Fragestellungen genutzt wird. Folgende weitere Ergebnisse wurden gewonnen: Die molekulare Untersuchung mittels PCR zeigte die Anwesenheit von M. tuberculosis-Komplex DNA in 36 von 65 humanen Fällen, wohingegen säurefeste Stäbchen in der Ziehl-Neelsen Färbung nur in elf Fällen entdeckt werden konnten. Alle IS6110 positiven Fälle wurden mit Spoligotyping weitergehend untersucht. Dreizehn Fälle boten M. tuberculosis spezifische Muster, während M. bovis spezifische Muster in vier Fällen erhalten wurden.

Sat, 8 Feb 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16954/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16954/1/Michels_Jessica.pdf Michels, Jessica ddc:59

Bisherige Testformate zum Nachweis von Antikörpern gegen enteropathogene Yersinia spp. bei Schweinen konnten lediglich eine Aussage darüber treffen, ob eine Infektion stattgefunden hat, jedoch nicht darüber, welcher der beiden Erreger, Y. enterocolitica bzw. Y. pseudotuberculosis, die Infektion verursachte. Ziel der Arbeit war daher die Entwicklung eines Immunoassays auf Basis der Beadtechnologie, der Serum und Fleischtropfsaft (FTS) von Schlachtschweinen sowohl als positiv bzw. negativ klassifizieren kann, als auch gezielt zwischen Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis differenziert. 551 Serum- sowie 368 Fleischtropfsaftproben wurden mit dem im Rahmen der Arbeit entwickelten recomBead Yersinia pig Assay (Firma Mikrogen, Neuried, Deutschland), der die rekombinant hergestellten Antigene YopD, YopE, YopH, YopM, YopN, MyfA, PsaA und VAG-A enthält, gegen einen Referenztest, den PIGTYPE® YOPSCREEN ELISA (QIAGEN Leipzig GmbH, Leipzig, Deutschland) auf IgG Antikörper gegen Yersinien getestet. Verglichen mit dem ELISA zeigte der Beadassay im Serum eine Sensitivität von 98,3% und eine Spezifität von 98,4 %. Für FTS lagen Sensitivität und Spezifität bei 93,6 % bzw. 99,0 %. Von 307 im Beadtest positiv getesteten Seren konnten 180 Seren einem Erreger zugeordnet werden; das entspricht einem Prozentsatz von 58,6 %. Dabei handelte es sich um 179 Y. enterocolitica positive Seren sowie ein Y. pseudotuberculosis positives Serum. Beim FTS wurden 164 als positiv getestet, von denen 85 dem Erreger Y. enterocolitica zugeordnet werden konnten, das entspricht einer Differenzierungsquote von 51,8 %. Kein FTS wurde als Y. pseudotuberculosis positiv differenziert. Dies ist die erste Evaluierung eines Testsystems zum Nachweis von Antikörpern gegenüber beiden enteropathogenen Yersinia-Spezies sowie der Fähigkeit einer gleichzeitigen Erregerdifferenzierung. Der entwickelte Beadassay eignet sich zum Nachweis von Antikörpern aus Blut- und Fleischtropfsaftproben von Hausschweinen.

Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) gehören zu den wichtigen, lebensmittelassoziierten Erregern von Gastroenteritiden. Schwere Erkrankungsverläufe, wie die postinfektiöse Komplikation HUS sind bekannt und betreffen meist Kinder unter 5 Lebensjahren. Als Primärquelle gelten Wiederkäuer, in deren Gastrointestinaltrakt das natürliche Habitat von Shigatoxin-bildenden E. coli liegt. Über fäkale Kontamination von Lebensmitteln, Wasser oder auch direkten Kontakt können STEC oral vom Menschen aufgenommen werden, wobei nicht alle STEC gleich virulent sind. Manche, wie z. B. die der Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 werden wesentlich häufiger bei erkrankten Menschen nachgewiesen als andere. Ziel dieser Studie war es zum einen fünf Singleplex Real-Time PCR-Systeme und ein Pentaplex Real-Time PCR-System zum Nachweis der oben genannten fünf E. coli-Serogruppen am LGL, Oberschleißheim, zu etablieren. Die in der Norm ISO/TS 13136:2012 als „hochpathogen“ eingestuften STEC-Stämme können somit anhand der dort beschriebenen Primer- und Sondensequenzen aus Probenisolaten detektiert werden. Für die Validierung wurden die Selektivität, Sensitivität, Präzision und Richtigkeit der PCR-Systeme bestimmt. Zum anderen wurden die Daten von 8272 humanen Proben (einschließlich der des EHEC O104:H4-Ausbruchs von 2011), 1521 Lebensmittelproben, 240 Tierkotproben, 69 Schlachtkörperproben und 29 Wasserproben aus den Jahren 2009 bis 2011 aus Bayern sowie die STEC-Serotypisierungsergebnisse von 09/2004 bis 12/2011 ausgewertet und beschrieben. Im Vergleich mit der gängigen Serotypisierung mittels Agglutination bietet das Real-Time PCR-Verfahren insbesondere bei großem Probenumfang einen enormen Zeitvorteil. Das Pentaplex PCR-System ermöglicht zudem eine zeitgleiche Analyse von Probenisolaten auf alle fünf Serogruppen. Alle E. coli-Stämme der Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 wurden durch die PCR-Systeme korrekt nachgewiesen. Die O103-Sondensequenz wurde hierfür zuvor modifiziert. Die Spezifität der Nachweissysteme für O26, O103 und O145 lag in Bezug auf E. coli bei 100 %. Bei den Nachweissystemen für O111 und O157 zeigten auch Bakterienstämme anderer Gattungen ein positives Ergebnis in der PCR (Serratia entomophila / rfbEO157-positiv und Shigella sp. LGL 2869 / wbd1O111-positiv). Die Datenauswertung ergab unter anderem einen hohen Anteil stx-positiver Tierkot- und Schlachtkörperproben von Rindern. Die meisten stx-positiven Lebensmittel stammten von Wiederkäuern. Vereinzelt waren auch potenziell humanvirulente STEC nachzuweisen. Der Großteil der nicht-humanen Proben war weder eae- noch EhlyA-positiv, während nur ein Viertel der humanen Proben keines der beiden Gene aufwies. Bei humanen Proben dominiert die Gruppe der unter 1 bis 5-jährigen Erkrankten und Frauen sind häufiger betroffen als Männer. Die E. coli-Serogruppen O26, O103, O111, O145 und O157 gehören zu den häufigsten in Bayern und 2011 infizierten sich 47 Menschen in Bayern mit EHEC O104:H4.

Thu, 25 Apr 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15697/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15697/1/Knappik_Michael.pdf Knappik, Michael

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern (mAk) zum Nachweis verschiedener relevanter Cephalosporin-Rückstände. Zu diesem Zweck wurden einfache, schnelle und effiziente Verfahren zur Synthese von Cephalosporin-Protein-Konjugaten entwickelt. Zur Gewinnung von Antikörpern wurden Mäuse mit den entsprechenden, mittels aktiver-Ester-Methode an Trägerproteine gekoppelten Cephalosporinen immunisiert. Mittels Zellfusion konnten verschiedene Hybridom-Zelllinien etabliert werden, die mAk zum Nachweis von Cefalexin und Ceftiofur sezernierten. Des Weiteren gelang es erstmals, auch mAk zum Nachweis von Cefapirin, Cefoperazon und Cefquinom herzustellen. Basierend auf diesen mAk wurden verschiedene, hauptsächlich indirekt kompetitive EIA-Verfahren entwickelt und für die Analyse von Milch optimiert. Hinsichtlich der angestrebten Sensitivität waren die in der VO (EU) Nr. 37/2010 festgelegten Rückstandshöchstmengen (MRL-Werte) maßgeblich. Alle mAks waren in der Lage, ihr Ziel-Antibiotikum in Konzentrationen weit unterhalb des entsprechenden MRLWerts nachzuweisen; die Nachweisgrenzen der optimierten EIA-Verfahren betrugen 0,3 ng/ml (Ceftiofur), 0,4 ng/ml (Cefquinom), 2,7 ng/ml (Cefalexin), 6,1 ng/ml (Cefoperazon) bzw. 17,2 ng/ml (Cefapirin) und lagen damit ca. 3,5- bis 330-fach unterhalb dem jeweiligen Grenzwert. Die Spezifität der Antikörper wurde v. a. durch die C-7-Seitenkette des zur Immunisierung verwendeten Cephalosporins geprägt. Nachweisbare Kreuzreaktionen der mAks traten daher nur mit solchen Cephalosporinen auf, die einen strukturell verwandten C-7- Substituenten aufwiesen. Diese kreuzreaktiven Cephalosporine sind jedoch nicht zur Therapie Lebensmittel liefernder Tiere zugelassen. Mit Ausnahme von Ceftiofur ermöglichen die Antikörper daher den substanzspezifischen Nachweis von Cephalosporin- Rückständen in Lebensmitteln. Die Anwendbarkeit der etablierten EIA-Verfahren zum Nachweis von Rückständen in Milch wurde anhand künstlich dotierter Milchproben überprüft. In einem Konzentrationsbereich entsprechend dem ½-, 1- sowie 2-fachen des jeweiligen MRLWerts von 20 – 100 μg/kg wurden Wiederfindungsraten von 90 – 120 % erreicht. Damit stehen erstmals unter Routinebedingungen einsetzbare quantitative immunchemische Analyseverfahren zur Verfügung, die den spezifischen Nachweis fast aller der derzeit in der Therapie von Lebensmittel liefernden Tieren eingesetzten Cephalosporine weit unterhalb der festgelegten Rückstandshöchstmengen ermöglichen.

Infektionen mit Mykobakterien sind beim Vogel weit verbreitet. Am häufigsten werden die Subspezies M. avium ssp. avium und M. avium ssp. silvaticum nachgewiesen, die schwere chronische Erkrankungen bei einem breiten Spektrum von Vogelarten verursachen. Außerdem muss von einem zoonotischen Potential dieser Keime ausgegangen werden. Da die Mykobakteriose beim Vogel letztlich immer zur Erregerausscheidung führt und meist letal verläuft, ist es insbesondere zur Infektionsprophylaxe in Beständen wichtig, eine Infektion frühzeitig und sicher diagnostizieren zu können. Für die Diagnostik standen neben einer serologischen Untersuchung bisher die Ziehl-Neelsen-Färbung zum Nachweis säurefester Stäbchen und die lang dauernde Anzucht von Mykobakterien aus Organmaterial zur Verfügung. Neuere molekularbiologische Nachweisverfahren können Mykobakterien nur bis auf die Speziesebene differenzieren oder sie sind sehr aufwendig. Insbesondere Kot wurde bisher selten direkt als Ausgangsmaterial für einen Nachweis beim Vogel verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s. in Organproben und Vogelkot entwickelt. Da vor allem bei Kotproben mit dem Vorkommen von PCR-Inhibitoren zu rechnen ist, wurde zur Qualitätssicherung eine interne Kontrolle in die Extraktion und PCR integriert. Basierend auf den Ergebnissen von Sequenzanalysen von hsp65, der 16SrRNA und von Insertionselementen wurde als Zielgen für die Realtime-PCR das Insertionselement IS901 ausgewählt. Für den Nachweis von M.a.a und M.a.s. wurden anschließend Primer und eine Taqman-Sonde konstruiert, die auf dieses Insertionselement gerichtet sind. Als interne Kontrolle wurde eine Realtime-PCR nach WAKELEY et al. (2006) für Taylorella equigenitalis verwendet und die gesamte Realtime-PCR in Form einer Duplex-PCR konzipiert. Die Reaktionsbedingungen dieser Realtime-PCR wurden anschließend hinsichtlich der Konzentrationen von Magnesiumchlorid, dNTP, Primer und Sonden optimiert. Zur Ermittlung der Spezifität wurden 13 Mykobakterien-Referenzstämme mit dieser PCR untersucht. Zur Ermittlung der Nachweisgrenze und Überprüfung der Sensitivität wurden zudem Kotproben von SPF-Tauben mit Suspensionen aus unterschiedlichen Mykobakterienkonzentrationen gespickt und dann geblindet sowohl mittels Ziehl-Neelsen-Färbung als auch mit der Duplex-Realtime-PCR untersucht. Des Weiteren wurden 27 Organproben, 18 Kotproben sowie 12 asservierte Mykobakterienstämme, die aus Organproben von Vogelpatienten angezüchtet worden waren, einer Testung mittels PCR unterzogen. Bei der Etablierung der internen Kontrolle wurde die DNA-Menge der internen Kontrolle so eingestellt, dass keine Hemmung der PCR für M.a.a und M.a.s auftrat. Die Relevanz der Verwendung dieser internen Kontrolle wurde insbesondere bei der Untersuchung von 18 Kotproben von Vogelpatienten deutlich, bei der in drei Ansätzen bei der Verwendung von unverdünnter DNA aus der Extraktion eine Inhibition der PCR angezeigt wurde. Bei der Untersuchung der Referenz-Stämme wurde eine DNA-Amplifikation anhand eines spezifischen Fluoreszenzsignals nur bei den vogelpathogenen Erregern M.a.a. und M.a.s. nachgewiesen. In der geblindeten Untersuchung von mit M.a.a gespickten Kotproben wurde für die Duplex-Realtime-PCR eine Nachweisgrenze von 104 Mykobakterien pro Gramm Kot ermittelt, was rechnerisch einem Nachweis von 1,25 Mykobakterien pro PCR-Ansatz entspricht. Die mikroskopische Untersuchung nach Ziehl-Neelsen-Färbung zeigte eine höhere Nachweisgrenze mit 105 Mykobakterien pro Gramm Kot als die PCR und erlaubt zusätzlich keine Aussage darüber, ob es sich um vogelpathogene Mykobakterien handelt. Mit der Realtime-PCR wurden alle negativen Ansätze als negativ erkannt. Bei der Untersuchung von klinischem Material von Vogelpatienten (27 Organproben, 18 Kotproben) und von 12 asservierten Mykobakterienstämmen, bei denen vergleichend auch mikroskopische Untersuchungen nach Ziehl-Neelsen-Färbung durchgeführt wurden, wurde bei 32 von 34 Proben mit Nachweis von säurefesten Stäbchen auch DNA von M.a.a./M.a.s. mittels Realtime-PCR festgestellt. Dies belegt die Bedeutung dieser beiden Unterarten als Krankheitserreger für Vögel. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s erwies sich als sehr gut für die Diagnostik von klinischem Material und ist somit für die Untersuchung von Vogelpatienten und zur Bestandsuntersuchung geeignet. Insbesondere die in die PCR integrierte interne Kontrolle ist für die Qualitätskontrolle der Diagnostik bedeutend, da, wie hier gezeigt wurde, vor allem Kot- und Darmproben hinsichtlich eines hohen Gehalts an Inhibitoren problematisch sind.

Die hygienische Qualität von Trink- und Tränkwasser wird durch den Nachweis von Indikatorbakterien bestimmt. Bakteriologisch einwandfreies Wasser kann jedoch Viren enthalten und somit eine Gesundheitsgefahr für Mensch und Tier darstellen, weil Viren resistenter gegen Umwelteinflüsse und Desinfektionsmaßnahmen sind als Bakterien. Da es keine standardisierten Verfahren gibt, sollten im Rahmen dieser Arbeit Methoden zum Nachweis von viralen Indikatoren in Trink- und Tränkwasser etabliert und ihre Praxistauglichkeit überprüft werden. Aufgrund ihrer Widerstandsfähigkeit und weiten Verbreitung wurden als Indikatoren für menschliche und tierische virale Belastungen humane und porzine Adenoviren sowie bovine Polyomaviren ausgewählt. Die etablierte Methode sollte auch für Influenzaviren als empfindlichere Viren geeignet sein. Da im Trink- und Tränkwasser geringe Konzentrationen an Viren zu erwarten waren, mussten die Proben zunächst aufkonzentriert werden. Hauptsächlich wurde ein Adsorptions-/Elutionsverfahren mit Glaswolle als Filtrationsmaterial angewandt. Die Konzentrate wurden in der Regel nur molekularbiologisch untersucht. Die Methoden konnten für alle ausgewählten Viren erfolgreich etabliert werden. In zahlreichen Versuchsansätzen wurden Stufen des Aufkonzentrierungsprozesses verändert und solche identifiziert, die für die größten Virusverluste verantwortlich waren. Die Ergebnisse wiesen hierbei eine hohe Schwankungsbreite auf. Dies lässt sich mit der Komplexität des Verfahrens und den geringen Viruskonzentrationen in großen Wasservolumina begründen. Die Wiederfindungsraten in zehn Litern betrugen im Mittel ca. 3 bzw. 6 % für humane Adenoviren und Influenzaviren. Die ermittelten Raten lagen etwas höher als die Werte einer aktuellen Studie. In 39 Proben von zehn bayerischen Wasserversorgungen wurden keine Viren detektiert, obwohl eine Mehrzahl der Proben bakteriologisch und chemisch-physikalisch nicht einwandfrei war. Es wurden zwar mehrere Hundert Liter Wasser filtriert, trotzdem war die Konzentration an Viren für einen Nachweis zu gering. Die entwickelten Methoden können zum Nachweis vieler verschiedener Viren verwendet werden und sind sehr sensitiv. Da sie aber recht aufwändig sind, eignen sie sich nicht für Routineuntersuchungen. Für spezielle Fragestellungen, z. B. zur Ursachenforschung bei Ausbruchsgeschehen, können sie jedoch sinnvoll angewandt werden.

Reports on autochthonous Hepatitis E virus (HEV) infection in humans with genotype 3 assume a zoonotic transmission from domestic pigs. But for domestic pigs only limited information on the seroprevalence of HEV in Germany is available. The aim of this study was to develop an ELISA for the detection of anti-HEV IgG and IgM in porcine serum and meat juice, and furthermore asses the seroprevalence in domestic pigs from Bavaria, Germany. 516 serum samples from pigs and 198 corresponding meat-juice samples from 41 different fattening units were collected in four Bavarian slaughterhouses from august 2009 to february 2010. These samples were tested for anti-HEV antibodies using the newly developed recomWell HEV pig (Mikrogen GmbH, Neuried, Germany) with recombinantly produced antigens of genotype 1 and genotype 3 of HEV. The results were compared to a competitor ELISA (Axiom HEV Ab, Axiom GmbH, Bürstadt, Germany). The data were verified by a HEV line-immunoassay (recomLine HEV, Mikrogen), which also uses antigens of genotype 1 and genotype 3 of HEV. Compared to the line-immunoassay the Mikrogen / Axiom ELISA showed a sensitivity of 90.9% / 95.6% and a specificity of 94.0% / 80.8% respectively. The correlation of optical densities (ODs) between serum and meat-juice was 0.939. Taking all three antibody tests into account, we found an overall anti-HEV IgG seroprevalence of 68.60%. 7.0% of the pigs showed IgM antibodies against HEV. We found a significant difference for two slaughterhouses concerning the seroprevalence rates. One fattening unit was free of antibodies against HEV, nine fattening units showed significant influence on the overall seroprevalence rate. This is the first study showing a (very high) anti-HEV reactivity rate in meat-juice of domestic pigs, which corresponds to the seroprevalences measured consistently by three different assays. A positivity rate of 7.0% for IgM has also never been shown before. The used test-systems seem to be suitable for antibody-testing in blood and meat-juice samples from domestic pigs.

Sat, 13 Feb 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11540/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11540/1/Paasche_Leonie.pdf Paasche, Leonie ddc:590, ddc:

Fri, 17 Jul 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10677/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10677/1/huthmann_eva.pdf Huthmann, Eva

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a powerful, innovative gene amplification technique which is emerging as an easy to perform and rapid diagnostic tool for detection and identification of microbial diseases. Early and accurate detection is of paramount importance concerning the diagnosis of the highly contagious bacteria Yersinia ruckeri and Renibacterium salmoninarum. An easy to perform diagnostic technique is also required if assays should be carried out in field inquiries. The method provides a single step, reaction tube assay only requiring a temperature-controlled water bath. In the experiments of the presented study, LAMP assays were conducted for Y. ruckeri (the pathogen causing Enteric Redmouth Disease, ERM) and R. salmoninarum (the pathogen causing Bacterial Kidney Disease, BKD). In the case of ERM, the amplified target was a sequence stretch of the gene yruI/yruR encoding the quorum sensing system which controls the expression of virulence genes. In the case of BKD, a sequence stretch of the gene encoding the major soluble antigen protein (p57) in R. salmoninarum was amplified. This protein indicates an active infection because it is the predominant cell surface-associated and secreted protein by the bacterium. The newly established LAMP assays for ERM and BKD enabled amplification of a stretch of each target gene at a temperature of 63°C in less than one hour, with no need of thermal cycling. Assays are carried out with a reaction mix containing four specific primers, the sample and Bst DNA polymerase. Amplification products were detected by visual inspection, agarose gel electrophoresis, and in real-time using a turbidimeter. Assays specificity were demonstrated using DNAs from other related bacteria yielding no amplification product, and by restriction analysis with HphI and EcoRV enzymes producing a specific bands´ pattern of the amplified products. Compared to regular PCR-based detection methods, the developed LAMP assays were consistently faster and ten-fold more sensitive. A safe detection of the specific sequence stretches with high specificity and efficiency was possible using DNA isolated both from bacterial extracts and from clinical fish specimens. These findings showed that LAMP assays are more sensitive than other detection methods such as time consuming culture methods and PCR assays. In conclusion, for the first time LAMP assays developed and optimised to detect Y. ruckeri and R. salmoninarum were introduced as diagnostic tools. In comparison with the performance of already established diagnostic methods, LAMP assays are superior in sensitivity, rapidness, specificity, and cost-efficiency. Both assays are highly appropriate for application in field inquiries to monitor the spread of ERM and BKD.

Fri, 17 Jul 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10839/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10839/2/Ziegler_Eva.pdf Ziegler, Eva ddc

Thu, 12 Mar 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10009/ https://edoc.ub.uni-muenchen

Fri, 6 Feb 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9895/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9895/1/Prohaska_Sarah_Nicole.pdf Prohaska, Sarah Nicole

Thu, 22 Jan 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9660/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9660/1/Schraut_Bettina.pdf Schraut, Bettina

In verschiedenen tierexperimentellen Studien wurde die Knochenneubildung aus be-siedelten Biomaterialien sowohl im heterotopen als auch orthotopen Lager unter-sucht. Die erzielten Ergebnisse waren dabei maßgeblich von den verwendeten Zel-len, der Leitschienenart und den Kultivierungsbedingungen in vitro abhängig. Ziel dieser Studie war es daher, den Einfluss der in vitro Kultivierung von Zell-Matrix Kon-strukten auf deren Integration und die Knochenneubildung in vivo zu untersuchen. Klinisch zugelassene Leitschienen (Tutubone, h=3mm, d=9mm) wurden mit huma-nen mesenchymalen Stammzellen besiedelt und danach statisch (12 Stunden oder 14 Tage) oder dynamisch (14 Tage) unter kontinuierlichem Medienfluss kultiviert. Die Kontrollleitschienen blieben unbesiedelt und wurden analog den 12 Stunden statisch kultivierten Leitschienen behandelt. Danach wurden die Konstrukte in athyme Nacktmäuse subkutan paravertebral implantiert. Nach 2 und 12 Wochen in vivo er-folgte die histologische bzw. immunohistochemische Auswertung der Konstrukte. Unabhängig von der Kultivierungsart und -dauer konnte bereits nach 2 Wochen ein Einwachsen des umliegenden Gewebes in die Konstrukte mit einer begleitenden Entzündungsreaktion beobachtet werden. In der weiteren Untersuchungsperiode wurden die signifikante Abnahme der Entzündungsreaktion sowie eine Zunahme von Blutgefäßen und multinuklearen Riesenzellen festgestellt. Zusätzlich konnten Fettzel-len überwiegend in den statisch besiedelten Konstrukten nachgewiesen werden. Die Knochenneubildung in den implantierten Konstrukten wurde nicht beobachtet. Immu-nohistochemisch konnten die hMSC mit Hilfe von HLA-1-Antikörpern nur in besiedel-ten Leitschienen nach 2 und 12 Wochen Implantationsdauer detektiert werden. Es konnte eine gute Integration der Leitschienen in das umliegende Gewebe sowie ein Überleben der implantierten Zellen über einen Untersuchungszeitraum von 12 Wochen nachgewiesen werden, wobei keine signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Kultivierungsformen beobachtet wurden. Das Auftreten von Fettzellen ist möglicherweise auf eine adipogene Differenzierung der implantierten Zellen zurück-zuführen.

Persistent infizierte (PI) Tiere stellen die wichtigste Transmissionsquelle für BVDV-Infektionen dar. Neuere Studien konnten zeigen, dass sich der Virusnachweis aus Ohrgewebeproben für die sichere und frühzeitige Detektion von neugeborenen PI-Kälbern eignet. Inwieweit transiente Infektionen mit dieser Methode erkannt werden, ist bisher nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die transiente BVDV-Infektion mit Hautgewebeproben zu untersuchen. Im Rahmen eines Tierversuches wurden sechs Kälber intranasal mit BVDV inokuliert. Bei fünf Tieren konnte in der Folge eine transiente Infektion beobachtet werden, deren Verlauf mit verschiedenen Diagnostikmethoden untersucht wurde. Der BVDV-Nachweis gelang mittels Virusisolierung, Erns-Antigen-ELISA und real time RT-PCR in Blutleukozyten, Plasma sowie Nasen- und Speichelsekreten. Die höchste Sensitivität zeigte dabei der RNA-Nachweis mittels PCR. Eine Serokonversion konnte zwischen Tag 17 und 21 nach der Virusinokulation durch Antikörper-ELISA nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung von Hautgewebeproben (Tag 2, 4, 7, 10, 14, 17, 21 p. inf.) konnten nur bei einem Kalb zwischen 2. und 17. Tag p. inf. geringe Mengen Virus-RNA (maximal 4000 RNA-Kopien/Probe an Tag 14 p. inf.) detektiert werden. Aus lysierten Hautproben konnte bei keinem Tier Erns-Antigen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Daten von transient infizierten Rindern aus dem Bayerischen Feldprojekt „Studie zur Eignung der Ohrstanzmethode bei neugeborenen Kälbern zur Bekämpfung der BVD/MD“ näher betrachtet. Bei 22 Tieren ließ sich BVDV mittels PCR sowohl im Ohrgewebe (Ct-Werte zwischen 28 und 39) als auch im Blut nachweisen. Die Ohrstanze von drei dieser Tiere war mit dem Erns-ELISA schwach positiv (OD 0,4 bis 0,5), bei vier Tieren konnten deutlich positive (OD >1,1) Ergebnisse beobachtet werden. Darunter waren auch Kälber, deren Muttertiere in der Spätgravidität mit einer Lebendvakzine geimpft wurden. Auffallend waren weiterhin sechs Tiere, die eine sehr lange Virämie (bis zu 99 Tage p. p.) zeigten. Bei einer weiteren Gruppe (elf Tiere) konnte das Virus nur im Ohrgewebe mit PCR (Ct-Werte zwischen 31 und 35) nachgewiesen werden. Diese Kälber wurden in Herden geboren, in denen später mehrere PI-Tiere geboren wurden. Ein Tier aus der Feldstudie zeigte über ein Jahr hinweg abfallende Virusmengen mittels Virusisolierung, real time PCR und Erns-ELISA in Hautbiopsien, Blutproben und Sekreten. Im Alter von zehn Lebensmonaten konnten mittels PCR im Hodengewebe große Mengen an Virus-RNA (Ct-Wert 21) detektiert werden. Das Virus war aus nur 20 Hodenzellen isolierbar, gleichzeitig erwiesen sich Sekrete und Blut als nicht infektiös in der Zellkultur. Im 14. Lebensmonat gelang nur noch der Nachweis der Virus-RNA in der Haut. Weiterhin konnte ein starker Anstieg homologer neutralisierender Antikörper gegen das persistierende Virus bis zum Titer von 25600 gemessen werden. Insgesamt ist festzustellen, dass transiente fetale und postnatale BVDV Infektionen mittels Hautbiopsien bei jungen Kälbern vereinzelt nachweisbar sind. Die PCR war hierbei deutlich sensitiver als der BVDV-Erns-Antigennachweis. Bei Neuinfektionen in Herden werden transient infizierte Kälber bereits vor den persistent infizierten geboren. Auch nach der Vakzination mit BVDV-Lebendimpfstoff sind transiente Infektionen mittels Untersuchung von Hautbioptaten nachweisbar. Erstmals konnte die fetale Infektion eines männlichen Rindes im Feld mit folgender partieller Immuntoleranz charakterisiert werden, bei dem eine Viruselimination im Blut und auf den Schleimhäuten erfolgte, nicht jedoch im Hodengewebe.

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8823/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8823/1/Hocke_Katja.pdf Hocke, Katja Bernhardine

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9101/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9101/1/Knoedl_Christine.pdf Knödl, Christine

Thu, 28 Feb 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8146/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8146/1/Kara_Esma.pdf.pdf Kara, Esma

Die Mukoviszidose (engl: cystic fibrosis, CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung der kaukasischen Bevölkerung. Der Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, einem membranständigen Chloridionenkanal, manifestiert sich an diversen Organsystemen, wobei Infektionen des Respirationstraktes im Vordergrund stehen. CF-Patienten produzieren ein viskoses Tracheobronchialsekret, welches die mukoziliäre Clearance behindert. In der Folge etablieren sich chronisch verlaufende Lungeninfektionen mit einem CF-typischen Erregerspektrum (v.a. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia-Komplex, Haemophilus influenzae und Stenotrophomonas maltophilia), die letztendlich lebenslimitierend sind. Durch die frühzeitige und regelmäßige Gabe von Antibiotika wird versucht, die inflammatorische und erregerassoziierte Schädigung des Lungengewebes zu kontrollieren. Dabei ist eine mikrobiologische Diagnostik, die die Erreger schnell und mit hoher Sensitivität und Spezifität identifiziert, von großer Bedeutung. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit markierten Oliginukleotidsonden zum Nachweis ribosomaler RNS ist eine spezifische und sensitive Methode zum Erregernachweis. Sie benötigt im Vergleich zum mindestens 48h in Anspruch nehmenden kulturellen Nachweis nur wenige Stunden und erfasst auch bereits nicht mehr kultivierbare Erreger, z.B. nach erfolgter Antibiotikatherapie. Das relativ begrenzte Erregerspektrum der Lungeninfektionen bei CF bietet gute Voraussetzungen für den Einsatz der FISH-Diagnostik. Als problematisch hat sich hierbei das viskose und inhomogene CF-Sputum erwiesen, das aufgrund seiner Zusammensetzung bei der Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Sonden eine ausgeprägte Hintergrundfluoreszenz zeigt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz der FISH-Technik zum Nachweis CF relevanter Erreger weiter zu optimieren. Zum einen sollte der Einfluss, den die Probenlagerung bis zur Weiterverarbeitung auf den Erregernachweis hat, untersucht werden. Dabei erwies sich 4ºC als geeignete Lagerungstemperatur, da die Mikroorganismen trotz Verringerung der Ribosomenzahl und damit etwas abgeschwächtem Fluoreszenzsignal bis zu 72h nach Probenentnahme mit FISH unverändert sensitiv nachweisbar sind, ohne dass eine Überwucherung langsamer wachsender Keime eintritt. Zum anderen sollte eine Minimierung der Hintergrundfluoreszenz erreicht werden. Verschiedene Modifikationen des Hybridisierungsprotokolls wurden miteinander verglichen. Durch die Absättigung unspezifischer Bindungsstellen der Oligonukleotidsonden mittels einer 30minütigen Vorinkubation mit freiem Biotin wurde die Hintergrundfluoreszenz erfolgreich vermindert, wobei die markierten Bakterien unverändert gut nachweisbar waren. Um die quantitative Auswertung der Sputumproben zu vereinfachen, wurde weiter ein Protokoll zur Analyse der FISH-Proben im Durchflusszytometer entwickelt. Durch diese schnelle, automatisierte Technik entfällt die zeitraubende manuelle Auswertung der Proben. Eine Integration dieser neu entwickelten Ergänzungen in bestehende Protokolle vereinfacht und beschleunigt die mikrobielle Diagnostik CF-typischer Erreger und eröffnet die Möglichkeit eines größeren Probendurchsatzes ohne zusätzliche Kosten.

Das Krankheitsbild der rezidivierenden Candidose ist sowohl diagnostisch als auch therapeutisch nach wie vor eine Herausforderung für den behandelnden Gynäkologen. Ziel der Untersuchung war mehr über die lokale Immunreaktion der Scheide herauszufinden, um somit eine effektive und gezielte Behandlung der Patientinnen zu erlangen. Wir untersuchten 184 Patientinnen die klinisch Symptome wie Erythem, Pruritus und weißlichen Fluor aufwiesen und bei mindestens 4 Episoden pro Jahr die Diagnose einer CRVVC gestellt wurde. Zum Nachweis von Candida und der Spezifizierung wurden die Methoden der kulturelle Anzüchtung sowie die der PCR verwendet. Die candidaspezifischen Immunglobuline IgA und IgG wurden mittels ELISA bestimmt. Ergebnisse: In der Gruppe der symptomatischen Patientinnen konnte nur bei 17% mittels Kultur, in 28% mittels PCR eine Pilzinfektion nachgewiesen werden. Ein negativer ELISA von CIgA und CIgG spricht gegen eine Infektion. Ein positiver CIgG-Nachweis spricht für eine Infektion, CIgG könnte somit als diagnostisches Zusatzkriterium und der Verifizierung der Beschwerden dienen. So könnte auch die Anwendung neuer therapeutischer Möglichkeiten, wie Gabe von Immunstimulanzien, bei Patientinnen mit lokaler Immunsuppression Vorteile zeigen. Das diagnostische Ziel sollte eine genaue Keim-Identifikation und Feststellung des lokalen "Immunstatus" sein. Somit ist der Arzt in der Lage ein individuelles Therapieschema zu erstellen, und so mit einer effektiven Behandlung auch Kosten einzusparen.

Fri, 8 Feb 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8333/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8333/1/Roczek_Alexandra.pdf Roczek, Alexandra

Sinus-lining cells (SLC) of lymph nodes (LN) are referred to as (immune-accessory) dendritic cells (DC) and as such, they are part of the Monocyte Macrophage System (MMS). Chimerism of various kinds of DC after sex-mismatched stem cell transplantation (SCT) has been reported, but data on chimerism of SLC have not been available so far. We examined 13 LN of different female individuals after sex-mismatched SCT, using a combined podoplanin immunostain and Y-FISH on single section slides. Twelve out of 13 LN contained chimeric cells, obviously predominantly lymphocytes, and eleven LN stained positive with podoplanin in SLC. In one of the LN simultaneously podoplanin-marked SLC revealed Y-chromosomal chimerism. Our results demonstrate that bone marrow derived cells are capable of regenerating SLC, at least at low frequency. These bone marrow derived cells are most likely hematopoietic stem cells (HSC) differentiating into blood monocytes which then form SLC, and after antigen contact SLC might, again, differentiate into FDC.

Zum Nachweis von dissemnierten Tumorzellen im Blut bei gastro-intestinalen Karzinomen wurde die real-time PCR von Cytokeratin 20 untersucht. Die Evaluation der Methode erfolgte durch die Untersuchung von Negativkontrollen sowie von hergestellten Positivproben mit HT29-Zellen. Hierbei zeigte sich eine Spezifität von 100%. In 10ml Vollblut konnten noch fünf Tumorzellen nachgewiesen werden. Von den untersuchten Patientenproben wurden 16,2% positiv auf Cytokeratin 20 getestet. Es gab keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem positiven Nachweis von Cytokeratin 20 im Blut und klinisch-pathologischen Parametern.

Early detection and elimination of cattle persistently infected (PI) with bovine viral diarrhoea virus (BVDV) is a key element for eradication programs. Testing dried skin biopsies derived from ear tagging might be useful for detection of BVDV in newborn calves. The aims of this study were the development of methods for antigen solubilization and RNA preparation, the investigation of the stability of these viral components and the comparison of the analytical sensitivity of different tests. Commercial antigen capture ELISAs for NS3, Erns and mixed antigens, a blocking ELISA for BVDV antibodies and two real time RT-PCR assays for 5’UTR were used as BVDV specific tests. Ear biopsies were collected from nine BVDV antibody free PI animals (infected with BVDV-I CR4043) after slaughter and from twelve PI calves (fetal infection with BVDV-I PT810) after euthanasia at the age of 5-13 days in the time of colostral antibodies. For solubilization of the BVDV antigens the detergents dodecyl sulfate, sodium deoxycholate and EMPIGEN were inappropriate. Out of the suitable detergents (CHAPS, Triton X100, Nonidet P-40, Tween 20, n-Octyl-ß-D-glucopyranoside and Digitonin) Triton X100 in a concentration of 1% was chosen for antigen solubilization. Best RNA yield was obtained using a mixer mill and a guanidine thiocyanate containing buffer, followed by RNA isolation with Qiagen RNeasy® kits (Fibrous Tissue Mini Kit and Lipid Tissue Mini Kit). RNA isolation kits provided by Roche were less efficient. NS3-ELISAs were of low analytical sensitivity for ear biopsies, maternal antibodies led to negative results. In addition NS3 epitopes are very heat sensitive. In contrast Erns-ELISAs showed high analytical sensitivity. Samples of PI animals without maternal antibodies gave mean titers above 30. Maternal antibodies had limited effects. In samples of nine PI animals with colostral antibodies the lowest titer was 13. Relevant temperatures by sample drying and storage led to minor titer reductions. The real time RT-PCR resulted in a sensitivity more than 104 fold over the detection limit, even in calves in the time of neutralizing antibodies. Bacterial or fecal contamination before sample drying had no relevant influence on the stability of Erns and 5’UTR RNA. Erns-ELISAs and real time RT-PCR seem to be suitable for detecting BVDV in dried ear notch samples of PI animals. Before appliance in BVDV eradication programs, the diagnostic sensitivity and specificity of tests using ear biopsies have to be evaluated by studies in the field with an adequate number of samples and an appropriate monitoring.

Die Buruli-Ulkus-Erkrankung stellt ein gravierendes Problem der öffentlichen Gesundheitsfürsorge in tropischen Ländern dar. Unbehandelt kann die Erkrankung zu Kontrakturen und durch Sekundärinfektionen sogar zum Tode führen. Kontrollstrategien betroffener Länder beschränken sich auf die Früherkennung und die chirurgische Behandlung klinisch diagnostizierter Fälle. Die Diagnostik des Buruli-Ulkus kann anhand des mikroskopischen Nachweises von AFB, der Kultivierung von Mycobacterium ulcerans und der PCR durch die Untersuchung von Abstrichen und Biopsien sowie der histopathologischen Untersuchung von Biopsien durchgeführt werden. Ein diagnostischer Gold-Standard zur Laborbestätigung klinischer Verdachtsfälle existiert nicht. Sensitive Diagnostikmethoden wie Histopathologie oder PCR sind in Endemiegebieten aufgrund technischer Schwierigkeiten oder dem Fehlen ausgebildeten Personals meist nicht verfügbar. Hervorgerufen durch die verzögerte Diagnosestellung, können ausgedehnte Behandlungskosten durch lange Krankenhausaufenthalte entstehen, die ein großes sozioökonomisches Problem der betroffenen Länder darstellen. Es werden daher dringend sensitive Labormethoden, wie die PCR, zur Bestätigung von Verdachtsfällen im frühen Krankheitsstadium benötigt, die zusätzlich noch verlässlich und einfach durchzuführen sind. Allerdings wird die Durchführung konventioneller PCR-Techniken unter tropischen Bedingungen vor allem aufgrund des Klimas, der fehlenden Laborausstattung, unzuverlässiger Stromversorgung und den begrenzten finanziellen Möglichkeiten der Gesundheitssektoren der Endemiegebiete erschwert. Die im Rahmen dieser Arbeit anhand der derzeit zur Diagnose der Buruli-Ulkus-Erkrankung verwendeten Standard-PCR-Methode entwickelte, auf Trockenreagenzien basierende, DRB-PCR ist aufgrund ihrer vereinfachten Handhabung perfekt an tropische Bedingungen und die dort vorherrschenden schwierigen klimatischen und technischen Begebenheiten angepasst: Zur Durchführung der DRB-PCR werden keine Kühl- und Gefriergeräte oder Generatoren zur Stabilisierung der Stromversorgung benötigt, da alle Reagenzien bei Raumtemperatur gelagert werden können. Die Qualität der Reagenzien ist stets vergleichbar, da sie nicht, wie gefroren gelagerte PCR-Reagenzien, durch die in tropischen Ländern üblicherweise vorherrschende unzuverlässige Stromversorgung häufigen Auf- und Abtauprozessen unterliegen. Weiterhin ist das Kontaminationsrisiko gegenüber der Standard-PCR bedeutend vermindert, da außer den lyophyllisierten Primern nur die „PuReTaq Ready-To-Go-PCR-Beads“ und die DNA zugegeben werden muss. Die Materialkosten der DRB-PCR betragen nur ca. 2 – 3 € mehr als die herkömmlicher PCR-Methoden. Es konnte gezeigt werden, dass die DRB-PCR hinsichtlich Sensitivität und Spezifität der Standard-PCR zum Nachweis von M. ulcerans gleichzusetzen ist. Die DRB-PCR bietet sich daher zukünftig zur Routineanwendung in Laboren tropischer Endemiegebiete an. Zur Gewährleistung verlässlicher Ergebnisse ist allerdings optimale Qualität und Beschaffenheit des Untersuchungsmaterials essentiell. Allgemein scheint das Alter der Läsion einen nicht zu vernachlässigenden Einfluss auf die diagnostische Sensitivität der DRB-PCR zu besitzen: Die Untersuchung früher Läsionstypen ist offensichtlich zur Laborbestätigung klinischer Verdachtsfälle geeigneter als ältere Erkrankungsstadien, bei denen teilweise nur noch wenige Bakterien nachweisbar sind. Im Vergleich mit anderen Diagnostikmethoden erscheint die DRB-PCR als sensitivste vor Ort durchführbare Methode geeignet zur Laborbestätigung von Buruli-Ulkus-Verdachtsfällen: Die in dieser Studie ermittelte diagnostische Sensitivität der Mikroskopie betrug bis zu 40 %, die diagnostische Sensitivität der Kultur ist aufgrund der Vorbehandlung der meisten Patienten mit antimykobakteriellen Medikamenten im Studiengebiet nicht repräsentativ. Außerdem erscheint die Kultur aufgrund der langen Generationszeit von M. ulcerans als diagnostische Methode ungeeignet. Durch die DRB-PCR konnte eine diagnostische Sensitivität von bis zu 75 % erreicht werden, die diagnostische Sensitivität der Standard-PCR lag mit ca. 80,0 % nur geringfügig höher. Die Inter-Assay-Übereinstimmungsrate zwischen DRB-PCR und Standard-PCR betrug, abhängig vom Untersuchungsmaterial, > 96 %. Die Ergebnisse der Histopathologie stehen in Endemiegebieten nicht zeitnah zur Verfügung, so dass sich diese Methode lediglich als Referenzmethode bzw. zur Differentialdiagnosestellung eignet. Gemäß bestehenden WHO-Empfehlungen werden derzeit zwei positive Laborergebnisse zur gesicherten Diagnose des Buruli-Ulkus benötigt. Würde nur ein positiver Test als ausreichend angesehen, könnten anhand der im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten 20 % mehr Verdachtsfälle bestätigt werden. Da strukturelle, technische und finanzielle Beschränkungen eine umfassende Labordiagnose in Endemiegebieten erschweren, erscheint es daher sinnvoll, die bestehenden Empfehlungen zu überdenken. Vor dem Hintergrund der Kosten- und Zeitersparnis wäre eine nacheinander erfolgende Stufendiagnostik, beginnend mit weniger sensitiven Nachweismethoden, wie z. B. der Mikroskopie, gefolgt von der Untersuchung der mikroskopisch negativen Proben durch hochsensitive Diagnostikmethoden wie DRB-PCR denkbar. Bei prä-ulzerativen Läsionen würden so > 35 % aller Verdachtsfälle schon allein durch die Mikroskopie bestätigt, durch die DRB-PCR würden noch weitere fast 30 % der Verdachtsfälle bestätigt. Im Falle ulzerativer Läsionen würden präoperativ und nicht-invasiv durch Untersuchung der Abstriche durch Mikroskopie bis zu 35 % der klinischen Verdachtsfälle laborbestätigt, durch anschließende DRB-PCR würden zusätzlich > 30 % gefunden. Postoperativ könnten durch Mikroskopie und PCR der Biopsien weitere 6 % bzw. 5 % der Verdachtsfälle bestätigt werden. Dieser relativ niedrige zusätzliche diagnostische Gewinn ist jedoch in Verbindung mit dem hohen Laboraufwand und den entstehenden Kosten kritisch abzuwägen. Die Daten dieser Arbeit legen nahe, dass Supervision und unterstützendes, regelmäßiges Training des Laborpersonals zur Aufklärung von Faktoren wichtig ist, die die Durchführung und Auswertung diagnostischer Verfahren negativ beeinflussen könnten. Begleitend zur Labordiagnostik durchgeführte EQA-Maßnahmen erscheinen daher essentiell, um die Qualität der Ergebnisse sicherzustellen. Die Qualität der Ergebnisse ist beispielsweise bei der zukünftig denkbaren, vor der Operation durchzuführenden, laborbestätigten Bestimmung der Exzisionsausdehnung von entscheidender Bedeutung. Es war im Rahmen der Studie nicht möglich, visuell eine bakterienfreie Exzisionsweite zu bestimmen. Obwohl die Bakterienkonzentration vom Läsionszentrum zur Peripherie abnimmt, kann makroskopisch gesund erscheinendes, an eine Buruli-Ulkus-Läsion angrenzendes Gewebe M. ulcerans enthalten. Rezidive ließen sich möglicherweise durch die Gabe von antimykobakteriellen Medikamenten, kombiniert mit einer vor der Operation durchgeführten laborunterstützten Bestimmung von bakterienfreien Schnitträndern, vermindern.

Zum Nachweis von PrPc und PrPsc wurde eine Kapillarelektrophorese-Immunofluoreszenz-Methode (CE-LIF) etabliert und mit konventionellen Verfahren (ELISA, Westernblot, Dot-EIA) verglichen. Zur CE-LIF wurde der monoklonale Antikörper F89 und ein Fluoreszenz-markiertes Peptid (FITC-P3) eingesetzt. Die Nachweisgrenze für rekombinantes bovines PrPc liegt bei 1 pg/Test. Zur Anreicherung von PrPsc aus Hirn und Liquor wurden (Ultra-) Zentrifugations-, Extraktions- (HFIP) und Chromatographieverfahren (HPLC, Festphasenextraktion) einzeln oder in Kom-binationen geprüft; darüber hinaus wurden Anreicherungsversuche mit Affinität- bzw. Immu-nomagnetischer Separation vorgenommen. Die Überprüfung des PrPsc-Gehaltes ausgewählter Extrakte im Vergleich zum Ausgangsma-terial mittels ELISA ergab deutliche Substanzverluste. Eine selektive Bindung von PrPsc an Dynabeads® gekoppeltem Plasminogen konnte nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde eine Anlagerung an Antikörper-beschichteten Beads festgestellt. Allerdings war die Bin-dungskapazität der Beads bei Versuchen in mit in PBS gelöstem PrPc oder PrPsc höher als bei vergleichbaren Versuchen mit Liquor. Bei der kapillarelektrophoretischen Analyse erwiesen sich alle mittels einfacher Probenauf-bereitung hergestellten Extrakte als ungeeignet. Sie führten entweder zu technischen Prob-lemen (Verstopfung der Kapillare; Durchbrennen) oder zu Interferenzen im Elektrophe-rogramm, die eine Auswertung nicht ermöglichten. Die Aufbereitung mittels HPLC ergab zwar verwendbare Präparationen, allerdings variierte die Retentionszeit von PrPsc derart stark, dass dieses Verfahren nicht weiter eingesetzt wurde. Bezüglich der Verwertbarkeit von CE-LIF wurden die besten Resultate mit Hilfe einer Aufreinigung nach Bio-Rad® mit an-schließender Festphasenextraktion erzielt. Während der Nachweis von PrPsc mittels CE-LIF aus Hirngewebe eindeutig gelang, führte die Untersuchung des Liquors eines bekannt BSE-positiven Tieres zu keinem eindeutigen Ergebnis. Prinzipiell ist die CE-LIF zum Nachweis von PrPsc geeignet. Allerdings handelt es sich dabei um ein sehr störanfälliges Verfahren. Die Sensitivität kann deutlich erhöht werden, wenn die Konzentration von PrPsc in kleine Volumina noch besser gelingt.

Nachdem die MRT- Darstellung von Gelenken beim Menschen zur Erkennung von ligamentären und chondralen Verletzungen heute Routine geworden ist, galt das Interesse der vorliegenden Studie einer optimalen Darstellung des Ge-lenkknorpels und Validierung von standardisierten Knorpeldefekten im Kniege-lenk des Hundes mit Hilfe der Hochfeld-Magnetresonanztomographie. Die klinische Relevanz der gewählten Fragestellung liegt zum einen in der Fest-legung minimaler Nachweisgrenzen als Voraussetzung für die diagnostische Zuverlässigkeit der Magnetresonanztomographie bei Gelenkknorpeldefekten ganz allgemein und zum anderen speziell im Kniegelenk des Hundes, das auf-grund seiner kleineren Größe und geringeren Gelenkknorpeldicke schwieriger zu beurteilen ist, als das Kniegelenk des Menschen, bei dem die MRT heute als Verfahren der Wahl zur Dokumentation von Knorpelschäden eingesetzt wird. Insbesondere sind Verlaufsbedingungen von Knorpelschäden unter Anwendung von Chondroprotektiva von großem Interesse, da die vielen auf dem Markt an-gebotenen Präparate hinsichtlich ihrer Wirkung bislang nicht hinreichend über-prüft sind. Erst wenn bekannt ist, bis zu welcher minimalen Größe Knorpel-schäden sicher als solche mit der MRT beurteilbar sind, können Heilungsverläu-fe nicht invasiv dokumentiert und objektiv bewertet werden. Als Untersuchungssequenz wurde die T1-FLASH-3D-WE-Sequenz gewählt, die sich beim Menschen schon länger zum Nachweis von Knorpelschäden etabliert hat. Sie wurde mit isotroper und anisotroper Darstellung gemessen. Für die Herstellung von standardisierten Knorpeldefekten mit einer Größe bis minimal 0,3 mm Tiefe wurde eine Methodik entwickelt, die reproduzierbare artefaktfreie Ergebnisse lieferte. Bei der Untersuchung mit der Magnetresonanztomographie wurden neben der Knorpeldicke alle Signalintensitäten, Signal-zu-Rausch- und Kontrast-zu-Rausch- Verhältnisse bestimmt. Es zeigte sich, dass Knorpeldefekte bis zu einer Größe von 3 mm Durchmesser und einer Tiefe von 0,4 mm in anisotroper Darstellung zuverlässig erkennbar sind. Des Weiteren wurde festgestellt, dass für eine optimale Sichtbarmachung des Gelenkknorpels und seiner Defekte eine geringe In-plane-Auflösung mit größerer Schichtdicke, wie in der anisotropen Darstellung, einem besseren Signal-zu-Rausch- und Kontrast-zu-Rausch- Verhältnis in der isotropen Darstel-lung vorzuziehen ist. Dies ist letztlich nur durch eine bessere anatomische „Schärfe“ der Anisotropie zu erklären, deren Effekte den SNR- und CNR- Effekt überkompensiert. Für geplante Verlaufskontrollen von Knorpelschäden liefern diese Erkenntnisse gute Grundlagen zur Beurteilung von Knorpelregeneration und deren zeitliche Einschätzung.

In der vorliegenden Arbeit wurden Real-time PCR-basierte Nachweisverfahren für E. canis und A. phagocytophilum entwickelt, validiert und im Anschluss für die Untersuchung von Patientenproben eingesetzt. Für E. canis wurden für zwei Tests Primer und Sonden des Typs „Molecular Beacon“ konstruiert, die auf unterschiedliche Zielgene gerichtet waren, die Reaktionsbedingungen optimiert und die Leistungsfähigkeit beider Tests verglichen. Die PCR EC-16S hatte hierbei die 16S rDNA als Zielgen, während die PCR ECP-p30 auf das p30-10-Gen von E. canis gerichtet war. Bei der Ermittlung der analytischen Sensitivität und analytischen Spezifität ergab sich, dass beide Tests in ihren Leistungen sehr ähnlich waren. Beide PCRs waren spezifisch und lieferten nur für DNA von E. canis ein positives Ergebnis, während die übrigen getesteten Erreger A. platys, N. risticii, A. phagocytophilum, Babesia canis, B. gibsoni und H. canis in der PCR negativ reagierten. Da die PCR ECP-p30 bei der Sensitivitätsprüfung geringfügig besser beurteilt wurde, wurde entschieden, die weiteren Untersuchungen mit diesem PCR-Protokoll durchzuführen. Zur Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität dieses Tests wurde eine extern kontrollierte Validierung mit geblindeten Proben durchgeführt. Hierbei ergab sich eine diagnostische Spezifität von 100 %. Die diagnostische Sensitivität der Real-time PCR betrug 82 %. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses lag für die PCR ECP-p30 bei 100 %, während der prädiktive Wert des negativen Testergebnisses 87,5 % erreichte Als Nachweisgrenze wurden 14,5 Moleküle des Zielgens pro 50 µl Ansatz ermittelt. Im Anschluss wurde die Eignung des Tests an Blutproben von Hunden aus einem für E. canis endemischen Gebiet untersucht. Dabei wurden 244 Blutproben einbezogen und die Ergebnisse der PCR mit denen eines IFATs verglichen. Die Blutproben stammten aus Kampanien, Italien und wurden dort durch Tierärzte von Hunden gewonnen, die in einer Tierarztpraxis mit angeschlossenem Tierheim vorgestellt wurden. Die Tiere waren drei Gruppen zuzuordnen: Ein Teil der Hunde, und zwar 19 Tiere, wurde von privaten Besitzern in der Praxis vorgestellt, 52 Tiere waren unmittelbar zuvor von der Strasse aufgelesen worden und die dritte Gruppe, die 173 Hunde umfasste, hielt sich zum Zeitpunkt der Probennahme schon längere Zeit im Tierheim auf. Innerhalb des Tierheims wird ein hoher diagnostischer und medikamenteller Aufwand zur Erkennung und Bekämpfung von E. canis mittels antibiotischer Therapie und Zecken¬prophylaxe betrieben. In die Untersuchung einbezogen wurden jedoch nur Hunde, die mindestens drei Monate lang nicht mehr mit einem gegen E. canis wirksamen Medikament behandelt worden waren. Bei der serologischen Untersuchung der Hunde mittels IFAT ergab sich ein Anteil seropositiver Tiere von insgesamt 41,8 %, der auch bei Betrachtung der drei verschiedenen Gruppen nur wenig variierte. So betrug der Anteil seropositiver Tiere innerhalb der Gruppe der Hunde aus dem Tierheim 43,4 %, während 40,4 % der Straßenhunde und 31,6 % der Tiere in privatem Besitz seropositiv waren. Diese Unterschiede waren nicht signifikant. Ein direkter Erregernachweis mittels Real-time PCR erfolgte bei 13,9 % der untersuchten Tiere. Beim Vergleich der Untersuchungsergebnisse von PCR und IFAT wurde eine Überein¬stimmung bei 61,9 % der untersuchten Proben ermittelt. Bei Betrachtung der einzelnen Hundegruppen lag der Anteil der in der PCR positiven Tiere bei den Straßenhunden mit 23,1 % ungefähr doppelt so hoch wie bei den Tieren in Privatbesitz (10,5 %) oder den Tierheim¬hunden im Tierheim (11,6 %). Der Unterschied zwischen den Straßenhunden und den Tierheimhunden war somit signifikant. Diese Ergebnisse weisen auf ein häufiges Vorkommen von E. canis im Untersuchungsgebiet hin und stützen die Auffassung, dass eine Erreger¬elimination mittels Antibiotikatherapie nur schwer zu erreichen ist. Für A. phagocytophilum wurde in der vorliegenden Studie ebenfalls eine Real-time PCR entwickelt und das Testverfahren unter Einbeziehung zweier bereits publizierter Real-time PCR-Protokolle und zwar von Pusterla et al. (1999a) und von Courtney et al. (2004), validiert. Bei der Entwicklung der Real-time PCR für A. phagocytophilum wurde als Zielgen die 16S rDNA herangezogen, da nur hierfür vergleichbare Sequenzen nahe verwandter Ehrlichienspezies verfügbar waren. Alle drei vorliegenden Testverfahren wurden auf ihre analytische Spezifität und ihre analytische Sensitivität überprüft und zusätzlich im Rahmen einer extern kontrollierten Validierung mittels geblindeter Proben verglichen. Hierbei zeigte sich, dass nur die PCR nach Courtney et al (2004), hier als PCR AP-MSP2 bezeichnet, eine sehr gute Spezifität für A. phagocytophilum besaß. Die anderen Tests lieferten auch für N. risticii und A. platys positive Ergebnisse. Die analytische Sensitivität war bei diesem Test ebenfalls um mindestens eine Zehnerpotenz höher als bei den anderen beiden PCRs. Im Rahmen der Validierung wurde für die PCR AP-MSP2 eine diagnostische Spezifität von 96 % ermittelt, während die im Rahmen dieser Studie entwickelte PCR AP-16S eine Spezifität von 64 % und die PCR nach Pusterla et al. (1999a) einen Wert von 36 % erreichten. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses betrug für die drei PCRs somit 96 %, 74 % bzw. 61 %. Für die Untersuchung von Patientenproben auf Befall mit A. phagocytophilum wurde deshalb die PCR AP-MSP2 ausgewählt. In die Studie wurden Hunde aus Deutschland einbezogen, und zwar sowohl 72 Blutproben, die eigens für diese Studie auf Anforderung von Tierärzten eingesandt worden waren, als auch 133 Proben, die aus verschiedensten Gründen in das Routinelabor des Institutes eingesandt worden waren. Die 72 eigens für die Studie gewonnenen Proben wurden mittels Buffy-coat-Ausstrich, PCR und IFAT auf A. phagocytophilum untersucht. Lichtmikroskopisch konnten in keinem Fall Einschluss¬körperchen des Erregers in den Granulozyten nachgewiesen werden. Mittels PCR wurde jedoch bei einem Hund (1,4 %) der Nachweis von A. phagocytophilum erbracht. Im IFAT konnten bei 16,7 % der 72 untersuchten Hundeseren spezifische Antikörper gegen den Erreger nachgewiesen werden. Eine Übereinstimmung der Ergebnisse von PCR und Buffy-coat-Ausstrichen lag bei 98,6 % der Proben vor. Beim Vergleich der Ergebnisse der Buffy-coat-Ausstriche mit den Ergebnissen des IFAT wurde eine prozentuale Übereinstimmung von 65,3 % errechnet. Identische Ergebnisse bei PCR und IFAT wurden bei 66,7 % der untersuchten Hunde erzielt. Die 133 Proben, die zufällig aus allen Einsendungen in das Routinelabor des Instituts für vergleichende Tropenmedizin und Parasitologie ausgewählt worden waren, wurden mittels PCR und IFAT untersucht, wobei zwei Tiere (1,5 %) in der PCR und 34,6 % im IFAT ein positives Ergebnis lieferten. Die Identität des PCR-Produktes eines der positiven Tiere wurde durch Klonierung und anschließende Sequenzierung bestätigt. Eine Übereinstimmung der Testergebnisse von IFAT und PCR bestand bei 52,6 % der untersuchten Proben. Diese Ergebnisse stützen die Auffassung, dass Hunde in Deutschland häufig mit A. phagocytophilum in Kontakt kommen, dass es sich dabei aber meist um eine selbstlimitierende, klinisch inapparente Infektion handelt.

In der Literaturübersicht wird der derzeitige Kenntnisstand zum epizootischen ulzerativen Syndrom (EUS), einer Erkrankung bei zahlreichen Süß- und Brackwasserfischen, die sich innerhalb kurzer Zeit in vielen Teilen der Welt ausgebreitet hat und eine potentielle Bedrohung für europäische Süß- und Brackwasserfische darstellt, zusammengefasst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zuallererst, eine PCR-Methode geeignet zum Nachweis von Aphanomyces invadans direkt aus erkrankten Fischen zu entwickeln, und weiterhin, die Empfänglichkeit ausgewählter Süßwasser-fischarten, die von Bedeutung für die europäische Aquakultur sind, gegenüber diesem Erreger zu untersuchen. Hierzu wurde eine Semi-Nested PCR-Methode angewandt, die Teile der ITS-Region amplifiziert (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen). Die PCR-Methode erwies sich sowohl als hochspezifisch gegenüber allen untersuchten Aphanomyces invadans-Stämmen als auch hochsensitiv. Die Spezifität wurde unter Einsatz von DNA verschiedener Oomyceten, anderer relevanter Pathogene und Kommensalen sowie Wirts-DNA in die PCR untersucht. Die untere Nachweisgrenze der Semi-Nested PCR lag bei Einsatz von genomischer DNA aus Mycel bei 25 fg und bei Einsatz von Aphanomyces invadans-Zoosporen in die DNA-Extraktion bei 0,025 Zoosporen. Um die PCR-Methode an diagnostischen Proben zu testen, wurden Infektionsversuche durchgeführt. Hierzu wurden Blaue Fadenfische (Trichogaster trichopterus) und drei in Deutschland wirtschaftlich bedeutsame Fischarten ausgewählt: Regenbogenforellen (Oncorynchus mykiss), Europäische Welse (Silurus glanis) und Europäische Aale (Anguilla anguilla). 36 Fischen von jeder der vier Spezies wurde intramuskulär eine Aphanomyces invadans-Sporensuspension injiziert. Während eines Versuchszeitraumes von 35 Tagen wurden laufend Fische zu vorher festgelegten Entnahmezeitpunkten euthanasiert, auf Hautveränderungen untersucht und Probenmaterial aus dem Injektionsbereich für die PCR-Untersuchung und eine histopathologische Untersuchung entnommen. Die Fadenfische und die Welse zeigten im Versuchsverlauf deutlich sichtbare, teilweise ulzerative Hautläsionen. Während bei der histopathologischen Untersuchung der Fadenfische die EUS-typischen mykotischen Granulome, die die Hyphen umschlossen, auftraten, konnten bei den Welsen zwar zahlreiche Hyphen nachgewiesen werden, die Entzündungreaktion bestand hier jedoch aus einer losen Anordnung von Makrophagen, wenigen Lymphozyten und Riesenzellen. Bei den Regenbogenforellen traten nur geringgradige, bei keinem Tier ulzerative Hautveränderungen auf. Nur bei vier Regenbogenforellen konnten die EUS-typischen mykotischen Granulome nachgewiesen werden. Keiner der Aale wies makroskopisch sichtbare Hautveränderungen auf mit Ausnahme eines Aals mit einer geröteten Injektionsstelle, der an Tag 2 post infectionem entnommen wurde. Bei diesem Tier konnten mit Hilfe der Grocott-Reaktion lokalisiert einzelne Hyphen sichtbar gemacht werden. Das Auftreten mykotischer Granulome oder einer zellulären Wirtsreaktion konnte bei den Aalen nicht beobachtet werden. Die PCR-Methode wurde für den Nachweis von Aphanomyces invadans aus den Fischen der Infektionsversuche angewandt. Der Erregernachweis gelang bei allen Fischen, die makroskopisch sichtbare Hautläsionen zeigten. Bei den Fadenfischen und den Welsen gelang der Erregernachweis bei allen Versuchsgruppen ab dem ersten Entnahmezeitpunkt an Tag 1 p. i. Die Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Methode sich für den Nachweis von Aphanomyces invadans bei erkrankten Fischen eignet. Zur Empfänglichkeit von Europäischen Welsen und Aalen lagen bisher keine Daten vor. Die Ergebnisse der Infektionsversuche liefern klare Hinweise dafür, dass Europäische Welse gegenüber dem EUS empfänglich sind, während Aale nicht und Regenbogenforellen nur geringgradig empfänglich zu sein scheinen.

Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Todesursache durch maligne Tumoren in den Industrienationen, verantwortlich für mehr als 10 % aller Krebstoten, mit zunehmender Inzidenz. Eine Heilung verspricht nur die chirurgische Intervention im Frühstadium, die Prognose in fortgeschrittenen Krankheitsstadien ist meist schlecht. Die Entdeckung der genetischen Veränderungen während der Tumorgenese kolorektaler Tumoren lässt hoffen, dass eine Früherkennung dieser ernsten Erkrankung über den Nachweis bestimmter Genmutationen im Stuhl oder der Kolonlavageflüssigkeit möglich ist. Die dabei am häufigsten auftretenden Mutationen betreffen das p53-Tumorsuppressorgen. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben. Mit Hilfe einer „Single Strand Conformation Polymorphism“ – Analyse war ein einfaches Screening der Exons 5-8 des p53-Gens möglich. Für die Etablierung dieser SSCP-Analyse und als positiv Kontrolle dienten die Zelllinien SW480, HaCat, Kle-1B, Hec-1B, Hut 78 und BT-20. Alle Mutationen der Zelllinien ließen sich in der optimierten SSCP-Analyse zweifelsfrei nachweisen. Dabei konnte bezüglich der Sensitivität dieser Methode gezeigt werden, dass ein Anteil von ≥ 20 % mutierter DNA in der Wildtyp-DNA nötig ist, um die Mutation nachzuweisen. Bei 37 Patienten mit kolorektalem Karzinom und einem Patienten mit einem 3 cm großen kolorektalen Adenom wurde eine Koloskopie durchgeführt. Die Tumoren wurden histopathologisch klassifiziert und die Lavageflüssigkeit zur weiteren Analyse gesammelt. Nach der Extraktion der DNA aus den Lavageproben folgten PCR und Reinigung der Amplifikate. Sowohl die Extraktion der DNA als auch die Amplifikation konnte in allen Fällen problemlos durchgeführt werden. P53 Mutationen konnten mit Hilfe der SSCP-Analyse bei 8 (22 %) der Karzinompatienten und bei dem Adenompatienten (100 %) detektiert werden. Es zeigte sich keine Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Mutationsnachweis. Weiter zeigte sich keine Korrelation zwischen zusätzlich zu den Karzinomen vorhandenen Adenomen und dem Mutationsnachweis. Mit der hier verwendeten Methode ist ein Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben möglich. Es konnten Mutationen sowohl in einem prämalignen Stadium als auch bei kleinen, auf Mukosa und Submukosa beschränkten, Karzinomen nachgewiesen werden. Der Mutationsnachweis gelang bei Tumoren aus allen Kolonabschnitten. Dennoch ist die Sensitivität der hier vorgestellten Methode zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht ausreichend. Weitere Studien werden benötigt, um die Sensitivität beispielsweise durch DNA-Anreicherungsmethoden zu erhöhen.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung eines Enzymimmuntests (EIA) zum Nachweis von zellulärem PrP (PrPC), sowie dessen Anwendung zur Untersuchung diverser Gewebe von Rindern, Kälbern und Lämmern. Mit dem Testverfahren wurde auch Milch von Rindern, Ziegen und Schafen auf das Vorkommen von PrPC und dessen Verteilung auf die einzelnen Milchfraktionen untersucht. Bei der Untersuchung der Gewebsproben zeigte sich, dass Prion Proteine in nahezu jedem Gewebe nachweisbar sind. Neben dem Stammhirn sind auch andere Organe bzw. Gewebe, wie beispielsweise die Nickhaut der Lämmer oder die Lunge von Kälbern und Lämmern sowie die Nierenrinde von Rindern und Kälbern reich an PrPC. Vergleichsweise geringe Konzentrationen an Prion Proteinen konnten in der Muskulatur sowie den lymphatischen Organen der Tiere nachgewiesen werden. Auffällig war, dass bei einigen Organen, wie z.B. der Rinderleber, eine hohe Schwankungsbreite bei den untersuchten Einzeltieren festzustellen war. Auch in der Milch bzw. deren Fraktionen (Magermilch, Molke und Caseinfraktion), die ohne weitere Probenaufarbeitung in den EIA eingesetzt werden konnten, war PrPC detektierbar. PrPC konnte dabei in Schaf- Ziegen- und Kuhmilch nachgewiesen werden. Die Untersuchung von fraktionierter Schafmilch ergab zum einen, dass die Entfettung der Proben keinen Einfluss auf den nachweisbaren PrPC-Gehalt der Milch hat, und zum anderen, dass sich der überwiegende PrPC-Anteil in der Molkefraktion befindet.

Für die stabile, regulierte Expression eines therapeutischen Gens in Zielzellen stellen künstliche menschliche Chromosomen (HACs) derzeit das einzige Konzept dar, das hohe Sicherheit und technische Realisierbarkeit bietet. Künstliche Chromosomen (HACs) mit dem CFTR-Gen sollen sich durch den Transfer definierter HAC-Konstrukte effizient formieren, ohne dabei die Zielzellen zu stören. Im Augenblick werden künstliche Chromosomen zur Klärung vieler grundlegender Fragen auf dem Gebiet der Chromosomenstruktur und -funktion sowie der Genregulation konstruiert. In der vorliegenden Arbeit sollte die zugrundeliegende de novo HAC-Technologie der Arbeitsgruppe, die sich auf die Konstruktion und den intakten Transfer von PACs mit den funktionellen Komponenten menschlicher Chromosomen (zentromerische, telomerische und genomische Sequenzen mit oris und Gene) konzentriert, weiterentwickelt werden. Die Verwendung von PACs als Kloniervektoren erlaubt die stabile Klonierung langer, genomischer DNA, die biochemische Verknüpfung über lox/Cre vermittelte Rekombination, sowie die Darstellung grosser Mengen intakter, supercoiled PAC DNA durch Anwendung einer in der Arbeitsgruppe entwickelten Technik (Reinigung der supercoiled DNA Fraktion in Agaroseplugs von gebrochener und genickter DNA im elektrischen Feld). Eine Verbesserung der Vektoren ist nötig, da die Effizienz der HAC Formierung bisheriger Vektoren für eine klinische Anwendung nicht ausreicht. Dafür wurden zunächst Marker benötigt, die Anzeigen können wieviele Zellen mit wievielen Vektormolekülen transfiziert wurden und wieviele der physikalisch erfolgreich transfizierten Zellen stabile HACs bilden (genetische Funktion). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Expressionsmarker entwickelt, die eine Formierung stabiler HAC-Linien durch grüne Fluoreszenz anzeigen können. So wurde ein tetratelomerischer PAC-Vektor „pTT“ konstruiert, der stabil eine EGFP-Kassette exprimiert, ein funktionelles Zentromer trägt (TTE1), und für die Klonierung weiterer genomischer Komponenten eine weiss/blau selektionierbare Sal I Stelle enthält. Ausserdem wurde ein CFTR-Gen-basierender „genomischer“ Marker (159 kb) vorgestellt, der den intakten Transfer langer, genomischer DNA und die Expression vom CFTR Promoter anzeigen kann. Besonders hervorzuhebende Ergebnisse aus der Arbeit sind: 1) Kopiezahlabhängigkeit bei der transienten Expression. Einzelne Markergen-Kopien genügen nicht, um Anwesenheit der transfizierten DNA mittels transienter Expression nachzuweisen. 2) Sichtbar transient exprimierende HAC Konstrukte (große Zahl) führen nicht zu stabilen Linien, was nahelegt, dass ein „low copy“ HAC Transfer benötigt wird. Für eine Optimierung und besseres „low copy“ HAC-Monitoring wurden multimere Marker (EGFP Array) und DNA-tags (Gal4-BD, Lac-Operator) entwickelt und stehen nun für einen Einsatz bereit. 3) Für den „low copy“ Transfer wurden neben Lipofektionsassays und der Mikroinjektion insbesondere eine neue Methode, die Baktofektion, eingesetzt, bei der die DNA nicht aus Bakterien isoliert werden muss: Modifizierte Transferbakterien dringen in die Zelle ein und geben die DNA-Konstrukte nach Autolyse frei („suicidal transfer“). Dabei wurde ein funktioneller Transfer genomischer DNA nachgewiesen. Es konnte zum einen gezeigt werden, dass Zentromer tragende Konstrukte effizient de novo HACs bildeten, und zum anderen, dass das lange genomische CFTR Expressionskonstrukt CGT21 stabil vom CFTR Promoter exprimiert wird. Damit steht nun die Baktofektion als effizienteste Methode zur HAC Optimierung zur Verfügung. 4) Durch Auszählung der stabilen Klone, Isolierung von Stichproben klonaler Linien und einem HAC-Formierungsassay mittels FISH Analyse, wurden folgende grundlegende Beobachtungen gemacht: Die Rate der Formierung stabiler Klone mit HAC Konstrukten hängt nicht von a) der Zahl der im einzelnen Konstrukt vorhandenen, oder cotransfizierten Zahl der BS Marker, b) nicht von der Orientierung der alpha-sat DNA relativ zum BS-Gen oder dem entgegengesetzt gerichteten EGFP-Gen, und c) nicht absolut von der Verwendung unterschiedlicher alpha-sat Sequenzen der zwei homogenen Array Typen auf Chr.5 ab, wobei der Vektor pTT mit dem Zentromer E1 die besten Ergebnisse der HAC Bildung erzielte und die höchsten Klonzahlen in Cotransfektionen mit einem telomerisierten Genkonstrukt erhalten wurden, nicht aber in Cotransfektionen mit dem Telomervektor ohne einklonierte genomische DNA. Diese Erkenntnisse haben direkte Relevanz für die Weiterentwicklung CFTR exprimierender HAC Vektoren. Mit den Konstrukten pTTE1 und CGT21, und den zukünftig erweiterten Konstrukten mit multimeren Markern bzw. Tags und einem kompletten CFTR Gen, kann nun auch der physikalische Transfer der HAC Konstrukte in Zielzellen, sowie deren Funktion effizient untersucht werden. Damit konnten wichtige Voraussetzungen für die Weiterentwicklung einer stabilen CFTR Gentherapie geschaffen werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Deletionsscreening mittels qunatitativer Multiplex-PCR am Beispiel des APC-Gens etabliert, mit dem Deletionen ganzer Exons detektiert werden können. Die Gendosis einzelner Exons wird dabei durch Vergleich der Produktmengen der Exons untereinander und mit einem Kontrollexon eines anderen Gens ermittelt. Bei sechs der zwölf untersuchten DNA-Proben (Blut und Gewebe) konnten Deletionen eines oder mehrerer Exons nachgewiesen werden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Vorkommen der Erreger FSMEV und Borrelia sp. in Zecken und Wildmäusen in ausgewählten Gebieten Bayerns zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden insgesamt 836 Wildmäuse in den Gebieten Erlangen, Grafrath und Traunstein sowie 1552 Zecken in Münchens Parkanlagen und in Schöngeising gefangen. Für die Untersuchung der Proben erfolgte die Etablierung neuer, hochsensitiver nested PCRs. Für das FSME-Virus wurde das Hüllgen-(E-) Protein als Zielgen verwendet und eine Nachweisgrenze von 0,4 TCID50 ermittelt. Zum Nachweis von Borrelien DNS diente das OspA-Gen, die Nachweisgrenze betrug 64 DNS Moleküle pro PCR Ansatz. Die Spezifität konnte anhand von 11 Stämmen gezeigt werden. Eine Inhibition der PCRs durch Probenmaterial wurden in Vorversuchen ausgeschlossen. Um die Qualität der extrahierten RNS bestätigen zu können, wurden interne Kontrollen durchgeführt, die sogenannte house-keeping Gene (Zecke: 16sRNS; Maus: Cytochrom b) als Zielsequenz hatten. Positive Proben wurden sequenziert und die ermittelten Daten für phylogenetische Analysen verwendet. In keiner der untersuchten 359 Wildmausproben und 1552 Zeckenproben konnte FSMEV nachgewiesen werden, was auf ein niedriges Infektionsrisiko mit FSMEV in den Landkreisen Erlangen, Fürstenfeldbruck, Traunstein und München hinweisen könnte. In 836 Wildmausproben konnte in 91 Proben Borrelien DNS nachgewiesen werden, womit sich eine Gesamtprävalenz von 11 % ergab. Für das Gebiet Traunstein wurde mit 34 % die höchste Borrelien-Prävalenz ermittelt. In Erlangen lag die Prävalenz in den untersuchten Proben bei 26 % und in Grafrath ergab sich eine Borrelien Prävalenz von 6 %. Dabei war B. afzelii in allen Fanggebieten die am häufigsten isolierte Spezies (81 %). B. burgdorferi wurde in 6 %, B. garinii in 2 % der untersuchten Proben isoliert. Parasitenbefall, Gewicht und Gonadengröße konnten als Einflussfaktoren für die Befallshäufigkeit mit Borrelien ermittelt werden. Ebenso konnte eine jahreszeitliche Häufung der Borrelien-Infektionen beobachtet werden, die sich jedoch in den untersuchten Regionen unterschied. Da diese Untersuchung nur eine Momentaufnahme des Erregergeschehens in den ausgewählten Gebieten wiederspiegelt, werden in Zukunft weitere Studien erforderlich sein, auch um Veränderungen in der Erregerdynamik und der Erreger-Wirts-Beziehung erfassen zu können.

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.

Das Krankheitsbild der chronisch rezidivierenden vulvovaginalen Candidose stellt sowohl diagnostisch als auch therapeutisch nach wie vor eine Herausforderung für den behandelnden Arzt dar. Wir untersuchten 104 Patientinnen, die klinisch Symptome wie Erythem, Pruritus, Brennen und weißlichen Fluor aufwiesen und mbei mindestens vier Episoden pro Jahr die Diagnose einer CRVVC gestellt wurde. Als Kontrollgruppe dienten 44 asymptomatische Patientinnen ohne anamnestische Pilzinfektion. Zum Nachweis von Candida und der Spezifizierung des Pilzes aus gewonnenem Vaginalsekret verwendeten wir sowohl die Methode der kulturellen Anzüchtung als die der PCR. Des Weiteren bestimmten wir mittels Elisa die Zytokine Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-13 wie auch ProstaglandinE2, candidaspezifisches IgE und Gesamt-IgE aus dem Vaginalsekret. In der Gruppe der symptomatischen Patientinnen konnte bei nur 42,3% eine Pilzinfektion mittels PCR nachgewiesen werden, kulturell sogar nur bei 29,8% der Frauen, so dass bei 57,7% keine Pilzinfektion zum Zeitpunkt der Probenentnahme nachzuweisen war. Innerhalb der asymptomatischen und klinisch befundfreien Kontrollgruppe wurden 3 Patientinnen mit Hilfe der PCR positiv auf Candida getestet. Die Auswertung der Messergebnisse von IL-5, IL-13 und Gesamt-IgE zeigte im Vergleich der symptomatischen Patientinnen mit der Kontrollgruppe keine Zusammenhänge. Signifikante Unterschiede hingegen bestanden in der Konzentration von IL-4 (p

Caliciviren sind kleine, unbehüllte Viren mit einem RNA-Genom positiver Polarität. Die Vertreter der Familie Caliciviridae sind Erreger wichtiger, zum Teil sehr unterschiedlicher Erkrankungen bei Mensch und Tier. Das Feline Calicivirus (FCV) gilt als einer der Haupterreger des Katzenschnupfenkomplexes. Das FCV ist für Replikationsstudien an Caliciviren besonders gut geeignet, da es sich effizient in Zellkultursystemen vermehrt. Da der Replikationszyklus nur zum Teil aufgeklärt ist, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Nichtstrukturproteine des FCV, das Vpg und die RNA-abhängige RNA-Polymerase (3D-Polymerase), näher charakterisiert. Die 3D-Polymerase ist für die Replikation der viralen RNA zuständig. Das Vpg ist ein viruskodiertes Protein, welches kovalent an den 5'-Terminus der genomischen und subgenomischen RNA gebunden ist. Gegen beide Proteine wurden zunächst erfolgreich polyklonale Antikörper generiert. Untersuchungen zur Expressionskinetik ergaben, dass die 3D-Polymerase in einer frühen Phase des Replikationszyklus exprimiert wird. Sie tritt auch beim FCV-Isolat KS20 nur in Verbindung mit der 3C-Protease als sogenanntes 3CD-Vorläuferprotein auf, freie Polymerase ist nicht nachweisbar. Im Gegensatz zur 3D-Polymerase liegt das Vpg-Protein in einer späteren Phase des Replikationszyklus des FCV in freier Form vor. Es wurden für das FCV-Isolat KS20 zwei mögliche Vorläuferproteine von etwa 43 bis 45 kDa und von 25 kDa detektiert, deren Funktion unklar ist. Die 3D-Polymerase und das Vpg wurden nur im Zytopasma der Wirtszelle lokalisiert. Beide induzieren keine neutralisierenden Antikörper. Ferner beschäftigte sich diese Arbei mit der Hypothese, dass das Vpg bei der Transkription der viralen RNA eine Rolle spielt und möglicherweise als Primer für die 3D-Polymerase dient. Zum anderen wurde untersucht, ob das Vpg an der Enkapsidierung der genomischen und subgenomischen RNA in die viralen Partikel beteiligt ist. Zum Nachweis potentieller Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Proteinen wurde eine Co-Immunopräzipitation durchgeführt. Bei keinem der untersuchten Proteinpaare konnte eine Interaktion festgestellt werden.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war den Krebspesterreger Aphanomyces astaci, in den drei nordamerikanischen Flusskrebsarten Signalkrebs (Pacifastacus leniusculus), Kamberkrebs (Orconectes limosus) und Roter Amerikanischer Sumpfkrebs (Procambarus clarkii) nachzuweisen. Diese Flusskrebsarten sind zwar gegen die Krebspest resistent, können aber als latent infizierte Tiere Ausscheider des Erregers sein und somit die für die Krebspest empfänglichen Edelkrebse (Astacus astacus) infizieren. Bei dieser in Europa heimischen Art geht die Erkrankung mit 100 % iger Mortalität einher. Daher ist die Bestimmung des Träger-Status der nordamerikanischen Krebse von großer Bedeutung um eine weitere Verbreitung dieser hochinfektiösen Erkrankung in europäischen Gewässern zu verhindern. Im Vergleich zu den Edelkrebsen konnten bereits bei der makroskopischen und post sectionem bei der mikroskopischen Betrachtung der nordamerikanischen Flusskrebse Unterschiede festgestellt werden. Die letztgenannten weisen im Bereich der weichen Abdominalkutikula sowie an den dünnen Gelenkhäuten der Schreitbeine häufig Melanisierungen auf. Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung kann eine Wachstumshemmung der Pilzhyphen durch Melanineinlagerungen beobachtet werden. Unmittelbar nach der Invasion des Pilzes wird das Immunsystem aktiviert und verhindert normalerweise einen Krankheitsausbruch. Lediglich bei Einfluss von Stressoren kommt es zur Immunsuppression nordamerikanischer Krebse und daraufhin nach dem Auftreten der für die Krebspest typischen Symptome häufig zum Tod. Um mittels PCR Aphanomyces astaci in den nordamerikanischen Krebsen nachzuweisen musste zunächst die Pilz-DNA extrahiert werden. Dazu wurde das DNeasy® Tissue-Kit (Qiagen) verwendet. Es wurden unterschiedliche Flusskrebsgewebe zur DNA-Extraktion eingesetzt um die am besten geeignete Stelle zu finden. Die bereits bei Edelkrebsen verwendete weiche Abdominalkutikula erwies sich auch bei den nordamerikanischen Krebsen als äußerst zweckmäßig. Des weiteren konnte bei DNA-Extraktionen aus den Beinansätzen, dem dorsalen Abdomen und dem Telson der Erreger in der nachfolgenden PCR nachgewiesen werden. Da die nordamerikanischen Flusskrebse aufgrund ihres angepassten Immunsystems häufig nur sehr geringe Mengen an Pilz-DNA aufweisen, stellt der Nachweis hier ein Problem dar. Bei nur 50 mg eingesetzter Kutikula, laut Insekten-Protokoll des Tissue Kits, ist unsicher ob gerade in diesem kleinen Gewebestück Pilz-DNA vorhanden ist. Daher wurden auch Zusammenfassung ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 132 Extraktionsversuche vorgenommen bei denen ein kompletter Krebspanzer eines Kamberkrebses (3000 mg) zur DNA-Isolierung eingesetzt wurde. Die benötigte Lysis-Puffermenge wurde dementsprechend erhöht und die Inkubationszeit wurde verlängert. Das Ergebnis der PCR war bei diesem Krebs positiv. Trotzdem wurde beim Großteil der Kamberkrebse nur die weiche Kutikula in die DNA-Extraktion eingesetzt. Hierfür wurden Kutikula-Segmente ausgewählt, die bereits im Lichtmikroskop Melanisierungen oder sogar Pilzhyphen aufwiesen. Bei zahlreichen Krebsen war das Ergebnis der nachfolgenden PCR ebenfalls positiv. Zusammenfassend wird somit deutlich, dass der molekularbiologische Nachweis des Krebspesterreger Aphanomyces astaci auch bei nordamerikanischen Flusskrebsen möglich ist. Sowohl die DNA-Extraktion als auch die PCR, mit teilweise neu entwickelten Primern, können zur Feststellung des „Carrier-Status“ eines nordamerikanischen Krebses dienen.

This paper describes the development and application of enzyme immunoassays for the detection of antimicrobials in milk, aiming at the establishment of a biosensor system for the on-line analysis of drug residues in milk. For the development of group-specific antibodies against penicillins rabbits were immunized with an ampicillin-BSA-conjugate. The resulting antiserum was employed for the development of a direct competitive enzyme immunoassay (EIA), giving a detection limit of 1 ng/ml for penicillin G in milk. Due to broad cross-reactivities the sensitive detection of those penicillins regulated by MRLs within the European Union (ampicillin, amoxicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin and nafcillin) was enabled. The practical use of the enzyme immunoassay was demonstrated by analyzing artificially contaminated and violative incurred milk samples (n = 321). For the development of indirect competitive enzyme immunoassays for the detection of streptomycin, sulfonamides and penicillins, previously established direct assays, based on monoclonal antibodies, were adapted to indirect formats. For this purpose a wide range of coating-antigens was prepared by linking haptens to carrier-proteins. After optimizing test sensitivity and characterizing the test specificity indirect EIAs could be developed for each antimicrobial compound, fulfilling the MRL requirements due to EU regulation 2377/90. Only for ampicillin and penicillin G colorimetric measurements resulted in detection limits of 7 and 6 ng/ml, respectively, which were slightly above the MRL of 4 ng/ml. By using a luminescent substrate, however, the MRL could be reached for these antibiotics as well. Based on the results of the individual EIAs rapid multianalyte tests both on microtitre plates and planar microarray chips were developed. Due to altered assay conditions again the systems were optimized and characterized regarding sensitivity and specificity. The sensitivities achieved on the biochip were well comparable with those obtained in the microtitre plate, whereas total assay time could be reduced to 15 min (microtitre plate) and 5 min (biochip), respectively.

Im Literaturüberblick der vorliegenden Arbeit wird besonders auf die ökonomische und ökologische Bedeutung der Flusskrebse, den derzeitigen Stand der Forschung die Krebspest betreffend und die aktuelle taxonomische Klassifikation des Krebspesterregers, Aphanomyces astaci, eingegangen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine zuverlässige und schnelle Methode zum spezifischen und sensitiven Nachweis von Aphanomyces astaci direkt aus Krebsgewebe zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein kommerzielles Fertigkit (DNeasy® Tissue Kit, Qiagen) als geeignete DNA-Extraktionsmethode ausgewählt. Als Untersuchungsmaterial wurde die Abdominalkutikula von Edelkrebsen (Astacus astacus) eingesetzt. Anhand von Genomanalysen der ITS-Regionen (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen) verschiedener Oomycota wurden Oligonukleotid-Primer konstruiert, optimiert und auf ihre Eignung überprüft. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurden zwei PCR-Protokolle etabliert: eine Semi-Nested und eine Nested PCR. Die Semi-Nested PCR, die sich für die Routinediagnostik von Aphanomyces astaci als wenig geeignet erwiesen hat, bietet das Potential, als Grundlage für weiterführende Studien an anderen Arten der Gattung Aphanomyces zu dienen. Die Nested PCR mit den äußeren Primern NS 166/NS 681 und den inneren Primern BO 525/BO 640 ergab mit allen 20 untersuchten Aphanomyces astaci-Stämmen ein PCR-Produkt von etwa 115 bp, das mit einer anschließenden Restriktionsenzym-Analyse mit der Endonuklease Hph I verifiziert werden konnte. Die Nested PCR zeigte sich hochspezifisch gegenüber Aphanomyces astaci, während die DNA von anderen bei Krebsen und im Wasser vorkommenden Krankheitserregern und die DNA von Wirtsgewebe nicht amplifiziert wurde, was Grundvoraussetzung für den Einsatz dieser PCR als Standardmethode ist. Die Nachweisgrenze der Nested PCR lag bei Verwendung von Plasmid-DNA bei 1,9 genomischen Einheiten und bei Einsatz von genomischer DNA aus Pilzmyzel bei 1 ag. Als Zusammenfassung 172 Aphanomyces astaci-Sporen in die DNA-Extraktion eingesetzt wurden, lag die Nachweisgrenze bei 1 Spore. Zusätzlich wurden Infektionsversuche durchgeführt, bei denen Edelkrebse mit 10, 100 und 1000 Aphanomyces astaci-Zoosporen/ml infiziert wurden. Ein positives PCR-Ergebnis konnte ab Tag 2 post expositionem (entspricht dem Tag der ersten Probenentnahme) mit der beschriebenen Methode bei allen untersuchten Tieren beobachtet werden. Schließlich wurde eine Validierung der entwickelten Nested PCR unter Einsatz von Wirtskutikula anhand 19 diagnostischer Proben unterschiedlicher Herkunft innerhalb Europas (aus Deutschland, der Schweiz, Österreich, Schweden und England) durchgeführt und die Ergebnisse mittels RFLP verifiziert. Mit der in der vorliegenden Arbeit entwickelten molekularbiologischen Nachweismethode steht ein Verfahren zur Verfügung, das eine zuverlässige Diagnose von Aphanomyces astaci bereits im Anfangsstadium der Infektion direkt aus Krebsgewebe ermöglicht und innerhalb von 12 bis 15 Stunden (Sektion, DNA-Extraktion, Nested PCR, Agarosegel-Elektrophorese und bestätigende Restriktionsenzym-Analyse) durchführbar ist. Diese Methode ist somit ein geeignetes und zuverlässiges Mittel, um in Programmen zur Seuchenbekämpfung der Krebspest (Aphanomyces astaci) eingesetzt zu werden.

Die Belastung des Menschen mit verschiedenen alkylierenden Agenzien ist auf unterschiedliche Quellen zurückzuführen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten durch ein Biomonitoring insbesondere die Beiträge von Nahrung, Rauchen und Passivrauchen möglichst umfassend geklärt werden. Als Biomarker wurden neben Hämoglobinaddukten methylierender, ethylierender, hydroxyethylierender und cyanoethylierender Precursoren mit dem N–terminalen Valin die korrespondierenden alkylierten Mercaptursäuren gewählt, erweitert um eine hydroxypropyl-alkylierte Mercaptursäure. Zur Erfassung der Gesamtbelastung sollte neben den Mercaptursäuren auch die Thioether-Gesamtausscheidung bestimmt werden. Um das Gesamtbild abzurunden, ist allerdings auch die Erfassung von Addukten auf dem Level der DNA nötig. Diese Marker sollten möglichst mit genetischen Prädispositionen in Verbindung gebracht werden, wobei ein Hauptaugenmerk auf den fremdstoffmetabolisierenden Phase-II-Enzymen der Glutathion-S-Transferasen GSTM1, GSTT1 und GSTP1 lag. Die Hauptaufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, geeignete Methoden zum Nachweis der genannten Verbindungen zu entwickeln oder in geeigneter Weise weiterzuentwickeln, so dass unter den Gesichtspunkten der Anwendbarkeit im Humanbiomonitoring im Rahmen einer Studie bei relativ geringem Aufwand, niedrigen Kosten pro Analyse, hoher Selektivität und Sensitivität bei paralleler Gruppenbestimmung ein möglichst effektives Biomonitoring möglich ist. Dazu wurde eine publizierte Methode der DFG zur Bestimmung der Hämoglobinaddukte so weiterentwickelt, dass sie die Simultanbestimmung des Ethylvalinadduktes mittels GC-MS-EI gestattet. Zum Nachweis der Mercaptursäuren alkylierender Verbindungen aus Humanurin wurde eine neue Methode entwickelt, die sich auf eine einfache Probenvorbereitung durch Festphasenextraktion und anschließende Detektion mittels HPLC-APCI-MS/MS stützt. Die Ionisierung der Analyten durch die APCI-Quelle hat gegenüber einer Ionisierung durch Elektrospray-Verfahren wesentliche Vorteile vor allem im Routinebetrieb. Durch den Einsatz des Tandem-Massenspektrometers und Messung selektiver Ionenübergänge ist eine zuverlässige Identifizierung der gesuchten Komponenten gewährleistet. Obwohl Bestimmungen der Gesamt-Thioetherausscheidung schon lange bekannt sind, war die Anwendbarkeit der Methodik insofern begrenzt, als die Probenvorbereitung und die Messungen einen für größere Studien nicht vertretbaren Zeitaufwand bedeuteten. Durch die im Rahmen dieser Arbeit eingeführten Modifikationen ist es möglich, den Arbeitsablauf in den meisten Schritten zu beschleunigen und den Probendurchsatz damit zu erhöhen. Die Kenndaten der Methode werden durch die erhöhte Anzahl an Messungen pro Probe verbessert. Durch den Einsatz eines Multikanalreaders kann die Messung und Auswertung gleichzeitig rechnergestützt erfolgen. Die Bestimmung von 3-Methyl- und 3-Ethyladenin in Urin als Marker für die Alkylierung der DNA setzte bislang im Bereich einer Hintergrundbelastung den Einsatz immunochemischer Methoden voraus. Durch die neuentwickelte Methode reduzieren sich die Probenvorbereitung und –Anreicherung auf eine Festphasenextraktion. Vorteil davon ist ein erhöhter Probendurchsatz bei reproduzierbaren Bedingungen. Die Messung mit HPLC-APCI-MS/MS gestattet die sichere Quantifizierung selbst unbelasteter Nichtraucherproben mit hoher Genauigkeit. Auch in diesem Falle zeigt die Ionisierung mit APCI bedeutende Vorteile gegenüber der Elektrospray-Ionisation, vor allem bei den bedingt durch die hohe Konzentrierung stark matrixbelasteten Proben. Im Rahmen einer longitudinalen Feldstudie mit 69 Probanden wurden die Thioether, Mercaptursäuren, sowie die Hämoglobin- und DNA-Addukte alkylierender Verbindungen untersucht. Die Ergebnisse bestätigen andere Studien, wonach Aktivraucher bezüglich der MeVal-, HyEtVal- und CyEtVal-Addukte erhöhte Level aufweisen. Gleiche Resultate sind für die Mercaptursäuren MMA und HPMA, die Thioether-Gesamtausscheidung sowie für die untersuchten DNA-Addukte gefunden worden. Die vom Probanden selbst berichtete Passivrauchbelastung hatte keinen messbaren Einfluss auf die Biomarker der Exposition gegenüber alkylierenden Agenzien. Es wurde auch kein Zusammenhang zwischen der durch Biomonitoring ermittelten Belastung und der durch Cotinin im Urin und Plasma bzw. der objektiv gemessenen Passivrauchbelastung (Nikotin auf Passiv-Diffusionssammlern) gefunden. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Exposition gegenüber alkylierenden Verbindungen aus weiteren exogenen und endogenen Quellen einen wesentlichen Beitrag zur Gesamtexposition leistet. Im Falle der Nahrung sind die Precursoren allerdings in der Regel zu unspezifisch, als dass sie bestimmten biochemischen Effektmarkern zugeordnet werden könnten, so dass keine Effekte beobachtet werden können und eine eventuelle zusätzliche Belastung beispielsweise durch Passivrauchen im Hintergrundrauschen untergeht. Allerdings lässt sich ein Einfluss der genetisch bedingten Enzymausstattung auf die Level bestimmter Marker feststellen. Vor allem die Träger des GSTT1*0-Gens zeigen eine verringerte Mercaptursäurebildung und ähnlich wie bei doppelten Nullgenotypen GSTM1 T1 vermehrte Bildung von Hämoglobinaddukten, zumindest für methylierende Spezies. Bei hydroxy- und cyanoethylierenden Verbindungen lässt sich allenfalls ein Trend erkennen, der jedoch nicht signifikant ist. Dies ist vermutlich auf die zu geringe Anzahl an Probanden und den Einfluss weiterer im Rahmen einer Feldstudie nicht kontrollierbarer Parameter zurückzuführen.

Sat, 1 Jan 1983 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/6296/1/6296.pdf Eisenmenger, Wolfgang; Tröger, H. D.; Baur, C. ddc:610, Medizin

Mon, 1 Jan 1979 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/6268/1/6268.pdf Eisenmenger, Wolfgang; Tröger, H. D. ddc:610

Sat, 1 Jan 1977 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/6221/1/6221.pdf Eisenmenger, Wolfgang; Tröger, H. D. ddc:610, Medizin