Podcasts about genabschnitte

Ein DNA-Profil führt die australischen Ermittler zu dem 19-jährigen Farah Jama, der zwei Frauen binnen weniger Stunden vergewaltigt haben soll. Er streitet den Vorwurf vehement ab, doch die Beweise sind erdrückend. Was ist in den Nächten des 14. und 15. Juli 2006, in zwei unterschiedlichen Vororten von Melbourne wirklich passiert? Die ganze Geschichte hört ihr in dieser Folge. Trigger-Warnung: Sexueller Missbrauch, Gewalt *Enthält Werbung* * Diese Folge wird unterstützt von CLARK. CLARK ist der digitale Versicherungsmanager, der dir dabei Hilft alle deine Versicherungen im Überlick zu behalten und dabei bares Geld zu sparen. Sichere dir einen 30-Euro BestChoice Gutschein von CLARK: Anmeldung mit dem Code „VERBRECHEN“ unter www.clark.de (Deutschland), www.goclark.at (Österreich) oder direkt in der App. Neukunden bekommen 15€ pro jede in die App hochgeladene bestehende Versicherung (ausgeschlossen Gesetzliche Krankenkasse, Altersvorsorge, ADAC-Mitgliedschaften). Maximal 30€. Der Gutschein wird von Clark per E-Mail versendet, wenn die Versicherungen als gültig bestätigt worden sind. Die Bestätigung kann mehrere Wochen in Anspruch nehmen. Teilnahmebedingungen auf https://www.clark.de/de/teilnahmebedingungen/podcast15 und https://www.goclark.at/de/teilnahmebedingungen/podcast15 * Wenn euch mein Podcast gefällt, dann schreibt mir bitte eine Bewertung, abonniert den Podcast und besucht meine Instagram-Seite: wahre_ verbrechen_ podcast. Meinen neuen Podcast *Paranormale Verbrechen* hört ihr ab sofort, überall wo es Podcasts gibt. MERCH-Shop: Der offizielle Wahre Verbrechen Podcast by Alex Merch-Shop ist endlich online! Ab sofort gibt es coole T-Shirts, bequeme Sweatshirts, Kaffee-Tassen und Taschen mit dem offiziellen Wahre Verbrechen Logo und weiteren exklusiven Designs: Der Weg zum Shop: https://www.seedshirt.de/shop/wahre-verbrechen-podcast PayPal: paypal.me/aapeitos AllE Folgen Werbefrei bei Steady: https://steadyhq.com/de/wahreverbrechenpodcast/about Alle Folgen, Podcasts und Rabattcodes findet ihr in meinem LINKTREE: https://linktr.ee/wahre_verbrechen_pc Buch zum Fall: The Tainted Trial Of Farah Jama von Julie Szego (englisch) https://www.lehmanns.de/shop/literatur/28629326-9780987381149-the-tainted-trial-of-farah-jama Der CSI-Effekt in Deutschland: Die Macht des Crime-TV https://www.amazon.de/CSI-Effekt-Deutschland-Crime-TV-Medien-Kommunikation/dp/3658024143/ref=sr_1_2?__mk_de_DE=ÅMÅŽÕÑ&crid=EUWR21PQUPOI&keywords=csi+effekt&qid=1649277779&sprefix=csi+effekt%2Caps%2C96&sr=8-2 Quelle: CSI-Effekt https://www.aerzteblatt.de/archiv/45126/DNA-Analysen-in-der-Forensischen-Medizin-Nur-die-Laenge-funktionsloser-Genabschnitte-wird-bestimmt http://www.bohii.net/blog/2019/6/17/learning-from-farah-jama-a-case-of-wrongful-conviction-due-to-faulty-dna-evidence https://www.smh.com.au/national/wrongfully-accused-20140324-35cga.html https://www.parliament.vic.gov.au/papers/govpub/VPARL2006-10No301.pdf

Die angesehene Zeitschrift "Science" hat ein biochemisches Verfahren zum Durchbruch des Jahres 2015 gewählt: CRISPR/Cas9. Es ermöglicht eine vergleichsweise einfache, schnelle und kostengünstige Veränderung von Genen. CRISPR/Cas9 verspricht, Medizin und Biotechnologie zu revolutionieren. Wie mit einer Schere lässt sich DNA gezielt an einer bestimmbaren Sequenz zerschneiden. Genabschnitte können entfernt, verändert, ausgeschaltet oder um neue Bausteine ergänzt werden. Es handelt sich um eine Art 'biologisches Textverarbeitungsprogramm', mit dem der Mensch künftig seine Existenz und die seiner Umwelt 'editieren' kann. Ein wahrhaft mächtiges Werkzeug. Sozusagen eine Fortsetzung der Evolution mit anderen Mitteln. Dass der Mensch an der Schwelle steht, die Evolution selbst in die Hand zu nehmen, anstatt ihr Spielball zu sein, schürt Hoffnung und gar Allmachtsphantasien bei den einen und Ängste bei vielen anderen. Immerhin hat das Verfahren nicht nur Auswirkungen auf die Lebewesen, sondern auf komplette Ökosysteme. Und im Falle des Menschen auf dessen Selbstverständnis, seine Werte und die sozialen Strukturen, in denen er lebt. Die Veränderung der menschlichen Keimbahn wird mit hoher Wahrscheinlichkeit auch in Zukunft sehr restriktiv gehandhabt werden, unter anderem deshalb, weil Veränderungen weitervererbt werden. Aber ein Tabu ist sie nicht mehr. In Großbritannien dürfen Wissenschaftler künftig das Erbgut menschlicher Embryonen gezielt verändern – wenn auch zunächst nur zu Forschungszwecken. Und chinesische Wissenschaftler haben bereits Genmanipulationen an Embryonen vorgenommen, um zu testen, ob sich eine genetisch bedingte Krankheit ausmerzen lässt, bei der zu wenig Hämoglobin, also der Farbstoff der roten Blutkörperchen, gebildet wird, ß-Thalassämie heißt sie. Von einer klinischen Anwendung ist das alles aber noch weit entfernt. Ängste gibt es viele: Sie reichen von der Gefahr des Missbrauchs durch eine sich selbst optimierende und ermächtigende Superelite bis hin zur Auslöschung der gesamten Menschheit durch 'Mutanten', die sich genetisch durchsetzen. Es ist durchaus sinnvoll, solche extremen Szenarien zu denken. Sie wirken aber auch unverhältnismäßig in einer Welt, in der jedes Jahr Millionen von Menschen an den Folgen des Alkohol- und Tabakkonsums oder durch Autounfälle sterben, weil sie eigenverantwortlich und relativ sorglos Risiken eingehen und eingehen dürfen. Verantwortung heißt genau das: Risiken bewusst und vernünftig einzugehen. Aber auch: Chancen zu nutzen. Und die sind immens und zahlreich. Stellen Sie sich die Zukunft vor, wenn CRISPR/Cas9 ausgereift ist: Zahlreiche genetische Erbkrankheiten sind ausgerottet Krebs und Aids sind heilbar, sogar verhinderbar Für den Menschen verträgliche Ersatzorgane können in Tieren gezüchtet werden Ertragreichere und robustere Pflanzen haben das Ernährungsproblem einer weiter gewachsenen Weltbevölkerung gelöst Der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft konnte dramatisch gesenkt oder gar gänzlich überflüssig werden Neue Enzyme haben die Biotreibstoff-Produktion revolutioniert Moskitos können Malaria und andere gefährliche Erreger nicht mehr übertragen Seit jeher ist es das Ziel des Menschen, sich und seine Lebensbedingungen zu verbessern. Dafür nutzen wir Wissenschaft und Technik und überschreiten dabei immer wieder Grenzen. Das ist in gewisser Weise auch eine Emanzipation von einer oft bedrohlichen Natur. Das kann man als menschlichen Übermut und einen nie enden wollenden Optimierungswahn bemängeln. Aber übersehen Sie bitte nicht, dass wir heute in einer weitaus besseren Welt leben als noch vor 100 Jahren. Eben dem Fortschritt sei Dank. Es ist nur schwer vorstellbar, wie beschwerlich und kurz unser Leben noch wäre, hätten wir frühere Chancen nicht genutzt. Mit CRISPR/Cas9 steht uns eine weitere Technologie zur Verfügung, die uns buchstäblich zu Entscheidungen zwingt. Sie zwingt uns dazu, souveräner Gestalter unserer Zukunft zu sein - und sei es durch die Entscheidung, diese Technologie explizit nur begrenzt oder gar nicht zu nutzen. Vielleicht entscheidet sich der Mensch aber auch, sie nicht nur im Kampf gegen Krankheiten, sondern auch als Enhancement-Technologie einzusetzen, um seine physischen und kognitiven Fähigkeiten zu verbessern und ein gesünderes und längeres Leben zu führen. Das sind unbändig starke Bedürfnisse, die zu befriedigen sich manche Leute heute schon viel Geld kosten lassen. Die, die es haben. Wäre es nicht besser, wenn diese Möglichkeiten praktisch jedem zur Verfügung stünden? Mit CRISPR/Cas9 und ähnlichen Verfahren können wir schicksalhaften Krankheiten ein Ende bereiten, unsere Felder pestizidfrei machen und vieles mehr. Allein schon diese Aussichten sind es wert, die Diskussion um Gentechnologien nicht hysterisch und dogmatisch, sondern besonnen und nutzenorientiert zu führen. Die besondere Herausforderung besteht darin, dass wir komplexe Systeme nie vollständig beherrschen können. Wenn wir es uns aber gänzlich verbieten, müssten wir nach dem gleichen Prinzip auch die meisten Medikamente verbieten. Und jetzt? Schauen Sie genau hin. Vielleicht arbeiten Sie in einer Branche, die noch nicht erkannt hat, dass und wie sie mit weißer, grüner oder roter Gentechnologie die Probleme ihrer Kunden besser lösen und ihre Wünsche besser erfüllen kann. Zu Wohle Ihrer Kunden und damit Ihres Unternehmens. Am Ende dürften – wie so oft – die Vorteile sehr willkommen und die Gefahren weitestmöglich beherrschbar sein.

Eine einfache, schnelle und kostengünstige Veränderung von Genen verspricht das biochemische Verfahren CRISPR/Cas9. Es soll die Medizin und Biotechnologie revolutionieren. Wie mit einer Schere lässt sich damit DNA gezielt an einer bestimmbaren Sequenz zerschneiden. Genabschnitte können entfernt, verändert, ausgeschaltet oder um neue Bausteine ergänzt werden.

Asthma bronchiale und assoziierte atopische Erkrankungen sind in ihrer Entstehung sehr komplex. Sie werden sowohl durch Umwelteinflüsse als auch durch verschiedene Mutationen in zahlreichen Genen ausgelöst. So werden annäherungsweise etwa 30 bis 40 Gene dafür verantwortlich gemacht, an der Entstehung atopischer Erkrankungen mit beteiligt zu sein. Ein Kandidatengen, das im Verdacht steht, in diesem Zusammenhang eine bedeutende Rolle zu spielen, stellt das SOCS3-Gen dar. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit auf das Vorhandensein potentieller Polymorphismen hin untersucht. Dabei wurden vier Polymorphismen identifiziert, von denen drei bereits beschrieben waren und einer neu entdeckt wurde. Anschließend wurden die Polymorphismen innerhalb einer großen Studienpopulation bestehend aus Münchner und Dresdner Schulkindern auf Assoziati-onen zu verschiedenen atopischen Phänotypen hin untersucht. Hierbei ergaben sich vor allem signifikante Zusammenhänge zur erhöhten Prävalenz von Asthma bronchiale. Um die funktionelle Relevanz der identifizierten Polymorphismen zu analysieren, wurde ihr Vorkommen bei verschiedenen, vom Menschen unterschiedlich weit entfernt verwandten Primatenarten überprüft. Es zeigte sich, dass jene Bereiche des SOCS3-Gens, in dem sich die Polymorphismen befinden, im evolutionären Verlauf stark konserviert wurden, was auf eine funktionelle Bedeutung dieser Genabschnitte rückschließen lässt. Diese Vermutung wurde durch die Resultate einer in silico Transkriptionsfaktorenanalyse bekräftigt. Sie zeigte, dass das Vorkommen der Polymorphismen zur Veränderung des Bindungsverhaltens von Transkriptionsfaktoren, die im Zusammenhang mit der Entstehung atopischer Erkrankungen stehen, führen könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Polymorphismen im SOCS3-Gen eine signifikante Rolle bei der Entstehung von Asthma bronchiale spielen. Präliminare Analysen, die untersuchten, wie SOCS3-Polymorphismen Einfluss auf die Entwicklung der Erkrankung ausüben könnten, wurden durchgeführt und lieferten Hinweise auf mögliche kausale Zusammenhänge zwischen Genveränderungen, Gen-Funktion und Krankheitsentstehung. Daraus könnten sich in weiteren Studien interessante Ansatzpunkte für neue Möglichkeiten in der Prävention und der Therapie atopischer Erkrankungen ergeben.

Basierend auf der Genomsequenz von H. sal. R1 wurde ein genspezifischer Gesamt-Genom-DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurden für jeden ORF des Genoms ORF-spezifische Oligonukleotide abgeleitet und zur spezifischen Amplifizierung der Genabschnitte mittels PCR eingesetzt. Nach Amplifizierung und Reinigung der Genabschnitte deckten die Produkte über 97% des halobakteriellen Genoms ab. Zur Konstruktion des Gesamt-Genom-DNA-Mikroarrays wurde jede spezifische Gensonde in fünffacher Wiederholung auf den DNA-Array aufgebracht. Auf diese Weise wurde ein DNA-Mikroarray erstellt, der mit einer Gesamtzahl von 13545 genspezifischen Sonden, das bisher dichteste Raster eines archaealen DNA-Mikroarrays aufweist. Durch parallele genomweite Genexpressionsanalyse in H. sal. R1, wurde der Vergleich zwischen aerobem und phototrophem Wachstum in drei umfassenden DNA-Mikroarrayexperimenten gezogen. Die Mikroarrayexperimente wurden mit dem so genannten „common reference“ Experimentdesign durchgeführt, bei dem eine Mischung aller RNA-Proben eines Experiments als Referenz bei den Hybridisierungen dient. Als weitere Vorraussetzung zur späteren statistischen Datenanalyse wurden die Transkriptomexperimente alle vier- bis fünfmal in unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Wahl der Referenz und die Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate haben die Basis geschaffen, die erhobenen Expressionsdaten mit Hilfe des R/MAANOVA Paktes der flexiblen und leistungsstarken statistischen Programmoberfläche R auszuwerten. Eine leistungsstarke und flexible Programmoberfläche zur Datenanalyse war unerlässlich, denn mit steigender Komplexität eines Transkriptomexperiments, steigt auch die Anzahl der notwendigen Wiederholungen und damit einhergehend die Gesamtzahl der auszuwertenden Datenpunkte. Für ein durchgeführtes Zeitreihenexperiment vom Wechsel aerobes zu phototrophem Wachstum mit sechs Zeitpunkten, fallen ca. 384.000 Datenpunkte an, für deren Vorder- und Hintergrundwerte die statistischen Kennwerte berechnet werden mussten. Ein solcher statistischer Kennwert ist der so genannte p-Wert, der die Signifikanz eines Ergebnisses widerspiegelt. Auf der Basis dieser signifikanten p-Werte ist eine Liste von 242 Kandidatengenen erstellt worden, die als differentiell exprimiert angesehen werden. Ein Anteil von 54.5% dieser differentiell exprimierten Gene weist kein homologes Protein oder Funktion auf. Diese Tatsache, birgt die Chance sowohl die Existenz dieser ORFs, als auch ihre Funktion aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden für die hypothetischen ORFs OE3107F und OE3136F Deletionsmutanten hergestellt und näher charakterisiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Deletionsmutanten R1D3107 und R1D3136 im Vergleich zum WT-Stamm H. sal. R1 deutliche Unterschiede in ihrer Pigmentzusammensetzung aufweisen. Beide Deletionsstämme weisen z.B. einen geringeren Gehalt an Bakteriorhodopsin auf. Somit hat die neu etablierte Methode der DNA-Mikroarray basierten Genexpressionsanalyse dazu beigetragen, zwei bisher unbekannte Kandidaten der Regulation der Expression des Bakteriorhodopsins in H. sal. R1 zu identifizieren. Durch zellfreie in vitro Expression des Gens OE3136F wurde ein möglicher Ansatz zur näheren Charakterisierung und Funktionsaufklärung aufgezeigt. Neben der Herstellung von Deletionsmutanten und deren Charakterisierung, wurde durch die Anwendung einer weiteren Datenanalyse mittels PCA (Hauptkomponentenanalyse) und dem Ansatz die erhobenen Transkriptomdaten auf Stoffwechselwegen abzubilden, zwei weitere denkbare Wege aufgezeigt, aus den ermittelten Expressionsdaten mehr Informationen zu erhalten. Die Ergebnisse aller Transkriptomexperimente für H. sal. R1 stimmen mit den Ergebnissen früherer Arbeiten überein und durch unabhängige Methoden wie RT-PCR, Nothern-Blot-Analysen und Proteomvergleich konnten die Resultate der Expressionsanalysen eindeutig verifiziert werden. Die Konstruktion und Herstellung der H. sal. R1 Gesamtgenom-Mikroarrays und Ausarbeitung eines Standardprotokolls zur Versuchsdurchführung, bilden die Grundlage aller Transkriptomexperimente der Arbeitsgruppe. Daneben ermöglicht die Schaffung einer bioinformatischen Infrastruktur zur statistisch signifikanten Auswertung der DNA-Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse die Erstellung einer Transkriptomdatenbank, die durch Anknüpfung an die bereits vorhandene HaloLex-Datenbank jedem Nutzer für weitere Mikroarray-Experimente mit anderer Fragestellung in leichter Form zur Verfügung steht. Abschließend kann gesagt werden, dass die DNA-Mikroarray basierende Transkriptomanalyse von H. sal. R1 dazu beigetragen hat das Wissen über den Prozess der Anpassung an das phototrophe Wachstum zu erweitern. Die in der Arbeit erhobenen Daten bilden die Grundlage einer Datensammlung, die es zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen wird, über viele verschiedene Experimente hinweg neue Co-Regulationen von Genen zu erfassen und damit neue Gene und Verknüpfungen zwischen Stoffwechselwegen schnell und einfach zu detektieren. Die vorliegende Arbeit kann als Ausgangspunkt für genomweite funktionelle Charakterisierung haloarchaealer Genexpression und ihrer Regulation angesehen werden. Dieser Punkt ist im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der Systembiologie von entscheidender Wichtigkeit, denn nur auf der Basis von soliden experimentellen Ergebnissen können Modelle aufgestellt und verbessert werden.

In der Literaturübersicht wird der derzeitige Kenntnisstand zum epizootischen ulzerativen Syndrom (EUS), einer Erkrankung bei zahlreichen Süß- und Brackwasserfischen, die sich innerhalb kurzer Zeit in vielen Teilen der Welt ausgebreitet hat und eine potentielle Bedrohung für europäische Süß- und Brackwasserfische darstellt, zusammengefasst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zuallererst, eine PCR-Methode geeignet zum Nachweis von Aphanomyces invadans direkt aus erkrankten Fischen zu entwickeln, und weiterhin, die Empfänglichkeit ausgewählter Süßwasser-fischarten, die von Bedeutung für die europäische Aquakultur sind, gegenüber diesem Erreger zu untersuchen. Hierzu wurde eine Semi-Nested PCR-Methode angewandt, die Teile der ITS-Region amplifiziert (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen). Die PCR-Methode erwies sich sowohl als hochspezifisch gegenüber allen untersuchten Aphanomyces invadans-Stämmen als auch hochsensitiv. Die Spezifität wurde unter Einsatz von DNA verschiedener Oomyceten, anderer relevanter Pathogene und Kommensalen sowie Wirts-DNA in die PCR untersucht. Die untere Nachweisgrenze der Semi-Nested PCR lag bei Einsatz von genomischer DNA aus Mycel bei 25 fg und bei Einsatz von Aphanomyces invadans-Zoosporen in die DNA-Extraktion bei 0,025 Zoosporen. Um die PCR-Methode an diagnostischen Proben zu testen, wurden Infektionsversuche durchgeführt. Hierzu wurden Blaue Fadenfische (Trichogaster trichopterus) und drei in Deutschland wirtschaftlich bedeutsame Fischarten ausgewählt: Regenbogenforellen (Oncorynchus mykiss), Europäische Welse (Silurus glanis) und Europäische Aale (Anguilla anguilla). 36 Fischen von jeder der vier Spezies wurde intramuskulär eine Aphanomyces invadans-Sporensuspension injiziert. Während eines Versuchszeitraumes von 35 Tagen wurden laufend Fische zu vorher festgelegten Entnahmezeitpunkten euthanasiert, auf Hautveränderungen untersucht und Probenmaterial aus dem Injektionsbereich für die PCR-Untersuchung und eine histopathologische Untersuchung entnommen. Die Fadenfische und die Welse zeigten im Versuchsverlauf deutlich sichtbare, teilweise ulzerative Hautläsionen. Während bei der histopathologischen Untersuchung der Fadenfische die EUS-typischen mykotischen Granulome, die die Hyphen umschlossen, auftraten, konnten bei den Welsen zwar zahlreiche Hyphen nachgewiesen werden, die Entzündungreaktion bestand hier jedoch aus einer losen Anordnung von Makrophagen, wenigen Lymphozyten und Riesenzellen. Bei den Regenbogenforellen traten nur geringgradige, bei keinem Tier ulzerative Hautveränderungen auf. Nur bei vier Regenbogenforellen konnten die EUS-typischen mykotischen Granulome nachgewiesen werden. Keiner der Aale wies makroskopisch sichtbare Hautveränderungen auf mit Ausnahme eines Aals mit einer geröteten Injektionsstelle, der an Tag 2 post infectionem entnommen wurde. Bei diesem Tier konnten mit Hilfe der Grocott-Reaktion lokalisiert einzelne Hyphen sichtbar gemacht werden. Das Auftreten mykotischer Granulome oder einer zellulären Wirtsreaktion konnte bei den Aalen nicht beobachtet werden. Die PCR-Methode wurde für den Nachweis von Aphanomyces invadans aus den Fischen der Infektionsversuche angewandt. Der Erregernachweis gelang bei allen Fischen, die makroskopisch sichtbare Hautläsionen zeigten. Bei den Fadenfischen und den Welsen gelang der Erregernachweis bei allen Versuchsgruppen ab dem ersten Entnahmezeitpunkt an Tag 1 p. i. Die Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Methode sich für den Nachweis von Aphanomyces invadans bei erkrankten Fischen eignet. Zur Empfänglichkeit von Europäischen Welsen und Aalen lagen bisher keine Daten vor. Die Ergebnisse der Infektionsversuche liefern klare Hinweise dafür, dass Europäische Welse gegenüber dem EUS empfänglich sind, während Aale nicht und Regenbogenforellen nur geringgradig empfänglich zu sein scheinen.

Der labordiagnostische Nachweis von Mikrosporidieninfektionen bereitet noch immer Probleme. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer unspezifischen Färbeeigenschaften ist der lichtmikroskopische Direktnachweis schwierig. Der elektronenmikroskopische Nachweis ist aufwendig und insbesondere aus Stuhl wenig sensitiv. Nicht alle Mikrosporidien können in Zellkulturen vermehrt werden. Die beim Menschen häufigste Spezies, Enterocytozoon bieneusi, ist nicht kultivierbar. Molekularbiologische Nachweisverfahren wie die PCR sind ebenfalls aufwendig, noch nicht standardisiert und derzeit noch Speziallaboratorien vorbehalten. Zuverlässige immundiagnostische Tests mit ausreichender Sensitivität und Spezifität fehlen insbesondere für E. bieneusi, da aufgrund der fehlenden Kultivierbarkeit die für eine Testentwicklung nötige Menge und Reinheit des Antigens kaum zu erzielen ist. Gene, durch deren rekombinante Expression dieses Problem gelöst werden könnte, sind bisher noch nicht bekannt. Dabei wäre zum Beispiel die Entwicklung eines Koproantigen-ELISA zum Nachweis von E. bieneusi aus Stuhl von großem praktischem Nutzen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war es, die Voraussetzungen hierfür zu verbessern. Als aussichtsreichstes Antigen wurde das so genannte „Sporenwandprotein“ (SWP) gewählt, der Hauptbestandteil der Sporenwand von Mikrosporidien. In eigenen Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass es allerdings wenig aussichtsreich ist, alleine anhand der bis dahin ausschließlich für Encephalitozoon cuniculi und E. intestinalis bekannten SWP-Gensequenzen PCR-Primer zur Amplifikation des homologen Gens aus E. bieneusi zu konstruieren. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst der bis dahin unbekannte, vollständige kodierende Bereich des SWP-Gens einer weiteren Encephalitozoon-Spezies, E. hellem, einschließlich benachbarter Genabschnitte auf Nukleinsäureebene charakterisiert. Durch die Vergleichsmöglichkeit mit dem SWP-Gen einer dritten Mikrosporidienart wurden die Voraussetzungen zur Konstruktion „universeller“ Primer, die homologe Abschnitte des wahrscheinlich auch in E. bieneusi vorhandenen SWP-Gens amplifizieren können, verbessert. Ein weiteres Ziel, das in dieser Arbeit erreicht wurde, war bei dieser Charakterisierung ganz auf das Anlegen von Banken zu verzichten. Im Hinblick auf die fehlende Kultivierbarkeit von E. bieneusi und die damit verbundene Schwierigkeit, das Ausgangsmaterial für genomische oder cDNA-Banken (genomische DNA bzw. mRNA) in ausreichender Menge und Reinheit zu gewinnen, sollte nämlich bewiesen werden, dass es möglich ist, das SWP-Gen einer Mikrosporidienart alleine durch die Anwendung von PCR-Techniken bestimmen zu können. Als Ausgangspunkt für die Charakterisierung des SWP-Gens aus E. hellem war die Amplifizierung eines ersten Genfragments. Dies konnte durch die Konstruktion so genannter „degenerierter“ Primer (Primermischungen) erreicht werden. Nach Kenntnis dieser ersten E. hellem-spezifischen DNA-Sequenz konnten anschließend Primer konstruiert werden, die vollständig zum SWP-Gen von E. hellem passten. In einer „klassischen“ PCR können jedoch nur DNA-Abschnitte zwischen bekannten Bereichen amplifiziert werden, da diese zur Konstruktion der beiden PCR-Primer bekannt sein müssen. Um dennoch die DNA-Sequenz aus dem ersten Genfragment nach beiden Seiten („upstream“ und „downstream“) verlängern zu können, wurden „inverse“ und „verankerte“ PCR-Reaktion als Spezialtechniken eingesetzt und durch Kombination mit bekannten Techniken („geschachtelte“, „halb-geschachtelte“ und „Touch Down“-PCR) optimiert. Schließlich wurden in der vorliegenden Arbeit aus der Primärstruktur (Nukleotidabfolge) ableitbare Eigenschaften des SWP-Gens von E. hellem diskutiert. Durch Sequenzvergleich mit den bereits bekannten SWP-Genen aus E. cuniculi und E. intestinalis wurden zwei konservierte Loci identifiziert, die zur Konstruktion „universeller“ SWP-Primer vorgeschlagen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde somit (a) das bis dahin unbekannte Gen des Sporenwandproteins aus E. hellem erstmals auf Nukleotidebene charakterisiert, (b) bewiesen, dass die Charakterisierung eines unbekannten SWP-Gens durch ausschließliche Anwendung von PCR-Spezialtechniken und ohne die Herstellung von genomischen oder cDNA-Banken möglich ist und (c) Methoden der „inversen“ und der „verankerten“ PCR in der Arbeitsgruppe etabliert und optimiert.

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.

Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit über die Organisation und Regulation der Faktor HGenfamilie wurden folgende drei Themenkomplexe bearbeitet: Zur Aufklärung der genomischen Organisation der HF-Genfamilie wurden humane Mega YACund BAC-Klone mittels Restriktionsanalyse, Southernblothybridisierung, PCR und Sequenzierung analysiert. Alle Gene der Faktor H-Familie HF1- 5 konnten auf diesen Klonen lokalisiert werden, d.h. diese Genfamilie liegt zusammen auf einem DNS-Abschnitt von ca. 400 kb auf Chromosom 1q32. Weitere HF1-verwandte Genabschnitte wurde identifiziert, die in die Nähe von HF3, HF5 und F13B lokalisiert wurden. Flankierend zur Faktor H-Genfamilie wurden die Gene für F13B und PCP-2 kartiert. Die Gene können wie folgt von telomer nach zentromer angeordnet werden: PCP-2, HF1, HF4, HF2, HF5 gefolgt von HF3/HF6/F13B, deren Orientierung nicht eindeutig festgelegt werden konnte. Die Häufung der HF-Gene auf einem DNS-Abschnitt und deren Anordnung in Tandem- Orientierung läßt vermuten, daß diese Genfamilie ihren Ursprung in Genduplikation hat. In dieser chromosomalen Region werden Rekombinations-Hotspots vermutet, die eine erhöhte Rekombinationsfrequenz verursachen infolge derer Duplikationen entstehen können. Durch Fehler bei der Rekombination kann es jedoch auch zum Verlust von genetischem Material kommen. Vermutlich kann man die Deletion im Bereich des HF2- und HF4-Gens, die bei 4-5% der untersuchten Probanden gefunden werden kann, durch einen solchen Mechanismus erklären. Diese Deletion, ein genetischer Marker in dieser Region, kann nun mit einem einfachen PCR-basierenden Test, festgestellt werden. Die Isolierung und Kartierung des Faktor H-Genkomplexes erleichtert die Suche nach Kandidatengenen für das hämolytisch urämische Syndrom (HUS), da die Region als Kandidatenregion für dieses Syndrom identifiziert wurde. Es ist möglich, daß Faktor H oder die Faktor H-verwandten Proteine eine Rolle bei der Entstehung dieser Krankheit spielen. Ob die oben erwähnten HF2-Deletion eine Rolle bei der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen insbesondere rheumatischer Arthritis, spielt, wurde an einem großen Patientenkollektiv untersucht. Es wurde jedoch keine Korrelation zwischen Deletion und Erkrankung gefunden. Zur weiteren Untersuchung der Funktion der Faktor H-verwandten Proteine, wurde deren Expression auf Protein und mRNS-Ebene untersucht. Faktor H und die Faktor H verwandten Proteine 1 und 2 wurden im Liquor cerebralis entdeckt. Der Hauptsyntheseort im Gehirn für Faktor H scheint des Endothel des Plexus chorioideus und die Gliazellen zu sein. Die HFverwandten Transkripte sind nur auf geringem Niveau nachweisbar. Die Transkription von HF1 ist in den allen getesteten Gliomazellinien mit IFNg stimulierbar. Faktor H verhält sich also im Gehirn, ebenso wie in der Leber, als Akute-Phase-Protein und verhindert eine ungewünschte Komplementaktivierung im Zuge von Infektionen, Verletzungen und Erkrankungen des Gehirns. Durch die inflammatorischen Cytokine IL4 und IL6 wird die Transkription von HF1 nicht beeinflußt. Die HF1-verwandten Gene HF1- 5 sind in den Gliomazellinien nicht mit IFNg stimulierbar und auch IL4 und IL6 zeigen keinen Einfluß auf die Expression dieser Gene. Im Gegensatz zu Faktor H sind diese Proteine wahrscheinlich nicht an der Akute-Phase-Antwort des Gehirns beteiligt. Welche Aufgabe ihnen zufällt ist offen.