Podcasts about amplifikate

Bacillus cereus ist als Sporenbildner mit ubiquitärem Vorkommen sowie ausgeprägten lipo- und proteolytischen Eigenschaften ein Problemkeim in der Lebensmitteltechnologie und -hygiene und verursacht Lebensmittelintoxikationen und -infektionen, die zu den wichtigsten lebensmittelassoziierten Krankheiten gezählt werden. Derzeit besteht in der Routinediagnostik ein Mangel an schnellen und zuverlässigen Methoden zur simultanen Detektion der für diese Erkrankungen kausalen B. cereus Toxine bzw. der zugrunde liegenden Toxin-Gene hbl, nhe, ces und cytK1. Im Rahmen dieser Studie wurden deshalb konventionelle und real-time multiplex PCRs zum simultanen Nachweis der B. cereus Toxin-Gene (hbl, nhe, ces und cytK1) entwickelt und an zuvor bereits immunologisch, zell- und molekularbiologisch charakterisierten B. cereus Stämmen (n = 146) der Stammsammlung des Instituts etabliert: Zur Anwendung in konventionellen Systemen konnten vier multiplex PCRs (PCR 1 – 4) realisiert werden, wobei PCR 1 und 2 dem gleichzeitigen Nachweis der Gene hblC, nheA, ces (PCR1) bzw. hblC, nheA, ces und cytK1 (PCR 2) dienen und mit PCR 3 und 4 die spezifische Detektion der Gene hblC, hblD und hblA bzw. nheA, nheB und nheC ermöglicht wird. Sowohl in den beiden Screening PCRs als auch in den PCRs zur Feindifferenzierung wurde eine Interne Amplifikationskontrolle (IAC) eingesetzt. Für die Applikation in real-time Systemen wurde eine auf SYBR Green I basierende multiplex PCR zur Detektion der B. cereus Toxin-Gene hblD, nheA, ces und cytK1 entwickelt und erfolgreich in den Cyclern LC 2.0 und LC 480 eingesetzt. Die Schwellenwert-Zyklen der multiplex Reaktionen stimmten gut mit denen der singleplex Assays überein und es konnte kein relevanter Sensitivitätsverlust festgestellt werden. In beiden Cyclern wurden für die vier Amplifikate signifikante Unterschiede der Schmelztemperaturen berechnet (p < 0,001). Anschließend wurden die multiplex PCRs zur Charakterisierung von Bacillus cereus Isolaten (n = 208) aus Lebensmittel- und Hygienestatuskontrollen der Bundeswehr eingesetzt. Anhand der detektierten Toxin-Gene konnten die B. cereus Isolate in drei Profile eingeteilt werden (nhe + hbl; nhe + ces; nhe) mit Prävalenzen von 99,5 % für nhe, 62,9 % für hbl sowie 4,3 % für ces. In einem zweiten Schritt wurden die B. cereus Isolate mit validierten, auf monoklonalen Antikörpern basierenden Enzymimmuntests und Zytotoxizitätstests untersucht, wobei eine hohe Übereinstimmung der mit den drei unabhängigen Methoden (PCR, EIA, Zelltest) erhaltenen Ergebnisse verzeichnet wurde. Im Vergleich zu früheren Studien konnte somit eine deutliche Verbesserung der Zuverlässigkeit der molekularbiologischen Ergebnisse erreicht werden.

Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Todesursache durch maligne Tumoren in den Industrienationen, verantwortlich für mehr als 10 % aller Krebstoten, mit zunehmender Inzidenz. Eine Heilung verspricht nur die chirurgische Intervention im Frühstadium, die Prognose in fortgeschrittenen Krankheitsstadien ist meist schlecht. Die Entdeckung der genetischen Veränderungen während der Tumorgenese kolorektaler Tumoren lässt hoffen, dass eine Früherkennung dieser ernsten Erkrankung über den Nachweis bestimmter Genmutationen im Stuhl oder der Kolonlavageflüssigkeit möglich ist. Die dabei am häufigsten auftretenden Mutationen betreffen das p53-Tumorsuppressorgen. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben. Mit Hilfe einer „Single Strand Conformation Polymorphism“ – Analyse war ein einfaches Screening der Exons 5-8 des p53-Gens möglich. Für die Etablierung dieser SSCP-Analyse und als positiv Kontrolle dienten die Zelllinien SW480, HaCat, Kle-1B, Hec-1B, Hut 78 und BT-20. Alle Mutationen der Zelllinien ließen sich in der optimierten SSCP-Analyse zweifelsfrei nachweisen. Dabei konnte bezüglich der Sensitivität dieser Methode gezeigt werden, dass ein Anteil von ≥ 20 % mutierter DNA in der Wildtyp-DNA nötig ist, um die Mutation nachzuweisen. Bei 37 Patienten mit kolorektalem Karzinom und einem Patienten mit einem 3 cm großen kolorektalen Adenom wurde eine Koloskopie durchgeführt. Die Tumoren wurden histopathologisch klassifiziert und die Lavageflüssigkeit zur weiteren Analyse gesammelt. Nach der Extraktion der DNA aus den Lavageproben folgten PCR und Reinigung der Amplifikate. Sowohl die Extraktion der DNA als auch die Amplifikation konnte in allen Fällen problemlos durchgeführt werden. P53 Mutationen konnten mit Hilfe der SSCP-Analyse bei 8 (22 %) der Karzinompatienten und bei dem Adenompatienten (100 %) detektiert werden. Es zeigte sich keine Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Mutationsnachweis. Weiter zeigte sich keine Korrelation zwischen zusätzlich zu den Karzinomen vorhandenen Adenomen und dem Mutationsnachweis. Mit der hier verwendeten Methode ist ein Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben möglich. Es konnten Mutationen sowohl in einem prämalignen Stadium als auch bei kleinen, auf Mukosa und Submukosa beschränkten, Karzinomen nachgewiesen werden. Der Mutationsnachweis gelang bei Tumoren aus allen Kolonabschnitten. Dennoch ist die Sensitivität der hier vorgestellten Methode zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht ausreichend. Weitere Studien werden benötigt, um die Sensitivität beispielsweise durch DNA-Anreicherungsmethoden zu erhöhen.

In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Publikationen zur Identifikation und Geschlechtsbestimmung von menschlichen Leichen und Knochenfunden an Hand von DNA-Analysen veröffentlicht. Entsprechende Ansätze zur Liegezeitbestimmung existieren hingegen nur sehr wenige. Dies mag seine Ursachen darin haben, dass über den Zerfall der DNA nach dem Tode (Degradation) nur sehr wenig bekannt ist. In der vorliegenden Arbeit wurden 14 Proben aus menschlichen Oberschenkelknochen mit bekannter Liegedauer zwischen 1 und 200-600 Jahren untersucht. Diese stammen mit Ausnahme der ältesten Knochen allesamt aus Umbettungen bzw. Exhumierungen von lokalen Münchner Friedhöfen, sodass die dort vorherrschenden Liegebedingungen bezüglich Witterungseinflüsse und Bodenart auf Grund ihrer engen geographischen Beziehung als vergleichbar betrachtet werden können. Aus jedem der langen Röhrenknochen wurde exakt aus der Mitte der Diaphyse ein ca. 2 cm breites Stück herausgesägt. Die dadurch entstandenen Knochenquerschnitte wurden wiederum in drei etwa gleich breite Bereiche zersägt: einen inneren, dem Knochenmark zugewandten Bereich, eine mittlere Zone sowie ein äußeres Areal mit Kontakt zur Knochen-Umgebung (Weichteile, Sarg, Erde etc.). Aus jeder dieser Zonen wurde die DNA extrahiert; anfangs mit der Methode nach Boom et al. (1990) und Haas et al. (2000b), später mit Hilfe des First-DNA Kits von GEN-IAL. Im direkten Vergleich der beiden Extraktionsmethoden erwies sich die letztgenannte als wesentlich effektiver, sowohl im Hinblick auf die Quantität als auch auf die Qualität der DNA. Die Quantität der extrahierten DNA wurde mit einem RNA/DNA-Calculator photometrisch bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die äußeren Knochenabschnitte tendenziell die höchsten (Mittelwert 180,4 ng/µl), die mittleren Abschnitte die niedrigsten (Mittelwert 121,6 ng/µl) Konzentrationen an DNA aufwiesen. Ein Zusammenhang zwischen dem Liegealter der Knochen und der gemessenen DNA-Menge konnte nicht verifiziert werden. Um den Erhaltungszustand der extrahierten DNA beurteilen zu können, wurden verschiedene Polymerase-Ketten-Reaktionen (Produktlängen: 150, 200, 507, 763 bp) durchgeführt. Hierfür wurden Primer aus dem humanspezifischen ß-Actin-Gen verwendet, wodurch eine Verfälschung der Ergebnisse durch bakterielle DNA bereits ausgeschlossen werden konnte. Bevor mit der extrahierten aDNA gearbeitet werden konnte, mussten zunächst die PCR-Bedingungen, d.h. die Hybridisierungstemperatur, die MgCl2-Konzentration und die einzusetzende DNA-Menge (Template) optimiert werden. Mit Hilfe des optimierten Protokolls wurden dann die eigentlichen Untersuchungen vorgenommen. Im Gegensatz zur quantitativen DNA-Bestimmung ließ sich feststellen, dass im mittleren Knochenabschnitt wesentlich häufiger spezifische Amplikons nachweisbar sind als im inneren und äußeren Drittel. Dies spricht dafür, dass die DNA im mittleren Bereich des Knochens zwar in geringerer Menge vorliegt, aber von besserem Erhaltungszustand ist. Dies weist zudem darauf hin, dass aus dem äußeren Knochendrittel zwar die größte Menge an DNA extrahiert werden kann, doch ist diese entweder besonders stark degradiert oder sie ist mit einer großen Menge an Fremd-DNA (v.a. bakterieller DNA) vermischt. Somit scheint die DNA-Degradationsrate in den zentralen Knochenanteilen am geringsten zu sein, bedingt durch den besten Schutz vor Umwelteinflüssen und bakterieller Besiedelung. Die Untersuchungen zur Fragmentlänge der aDNA ergaben einen Zusammenhang zwischen Fragmentgröße und Liegealter. So konnte festgestellt werden, dass „große“ Fragmente der aDNA (763 bp) lediglich innerhalb der ersten 8 Jahre post mortem nachweisbar sind, während etwas kleinere Fragmente mit einer Größe bis 507 bp überwiegend bis rund 15 Jahren nachweisbar sind. Kleine Fragmente von 150 bp Größe (ebenso wie in die in den zusätzlichen „Kontrolluntersuchungen“ erfassten Amplifikate von 200 bp Größe) sind auch in erheblich älterem Material nachweisbar. So fanden sich diese kleine Fragmente in dem bis 34 Jahre post mortem reichenden Material, wie auch in historischem Material eines Gebeinhauses, das – trotz anderen Lagerungs-bedingungen als bei dem rein bodengelagerten Material – mindestens 200 Jahre (bis 600 Jahre) alt war. Darüber hinaus ließ sich in einem Fall mit Liegealter von 34 Jahren ein spezifisches Amplifikationsprodukt von 507 bp Größe feststellen. Somit können auch „größere“ aDNA-Fragmente über einen längeren Zeitraum erhalten bleiben. Diese Tatsache schränkt den prinzipiellen Wert der Analyse für die forensische Diagnostik ein, da der Nachweis von größeren aDNA-Fragmenten demnach keine sichere Zuordnung zu bestimmten Bereichen des Liegealters erlaubt. In der forensischen Praxis kann jedoch eine Untersuchung, wie hier vorgestellt, im Einzelfall durchaus relevante Informationen liefern und zu einer möglicherweise genaueren Aussage führen. Zweifellos sind weitere Untersuchungen unter Einbeziehung zusätzlicher technischer Entwicklungen notwendig, um die Aussagefähigkeit noch zu verbessern.

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose (Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv, auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B. Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend. Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2 zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188 Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern 121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines 289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2 (F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das 121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4 PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse. Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba, Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen. Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das 121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden. Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll) ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden. Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T. brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten nDNA-Protokolle.

Das natürliche Vitamin Nikotinsäure wird seit 1955 in pharmakologischer Dosierung als Medikament zur Behandlung von Dyslipidämien und bei arteriosklerotischen Gefäßveränderungen verwendet. Von Nikotinsäure konnte als erstem Medikament bereits 1975 im Coronary Drug Project nachgewiesen werden, dass es die Mortalität nach Myokardinfarkt signifikant und anhaltend reduziert. Nikotinsäure senkt den LDL-Plasmaspiegel und erhöht den HDL-Spiegel. Während der Nikotinsäureeffekt auf LDL vielfach untersucht wurde, ist über den Mechanismus der HDL-Erhöhung bisher wenig bekannt. Nikotinsäure stimuliert massiv die PGD2-Synthese in vivo. Der Hauptmetabolit von PGD2, das 15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2, wurde kürzlich als wichtigster endogener Aktivator des nukleären Transkriptionsfaktors PPAR erkannt. PPAR ist entscheidend an der Regulation des Scavenger Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1 beteiligt. Diese Rezeptoren dominieren die zelluläre Aufnahme modifizierter LDL-Partikel und die Ausschleusung zellulären Cholesterins auf HDL-Partikel und damit die Cholesterinhomöostase in Monozyten/Makrophagen in der Gefäßwand. Deshalb war es Ziel der Arbeit an einem Makrophagenmodell zu untersuchen, ob Nikotinsäure Scavenger-Rezeptoren und zelluläre Cholesterin-Transporter tatsächlich beeinflusst und so über einen gesteigerten reversen Cholesterintransport aus der Peripherie zur Leber seinen klinischen Nutzen vermitteln könnte. Als Modelle wurden die differenzierte humane Monozytenlinie MM6, die humane hepatische Linie HepG2 und frisch präparierte humane Monozyten verwendet. Die Expression der Scavenger Rezeptoren CD36, SR-BI, LOX-1, des LDL-R, des Cholesterinexporters ABCA-1, des Transkriptionsfaktors PPAR und von -Aktin wurden durch reverse Transkription der spezifischen mRNAs, nachfolgende PCR und Quantifizierung der Amplifikate über HPLC bestimmt. Die Proteinexpression von CD36 und PPAR wurden mittels spezifischer Antikörper nach Fluoreszenzmarkierung im FACS gemessen. Die Änderung des zellulären Cholesteringehalts durch Inkubationen mit Nikotinsäure, oxLDL und delipidiertem HDL wurde nach zellulärer Lipidextraktion in einem adaptierten enzymatischen Assay gemessen. Im Makrophagenmodell stimulierte die Inkubation der Zellen mit Nikotinsäure schon nach 3 h und mindestens bis 48 h anhaltend die Transkription von PPAR, des PPAR abhängigen Scavenger-Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1. Dagegen blieb die Transkription des ApoB-spezifischen LDL-R und des Scavenger-Rezeptors LOX-1 unverändert. Vergleichbare Effekte waren auch am Hepatozytenmodell nachweisbar. Die Effekte auf die PPAR und CD36 Expression waren tendenziell auch auf Proteinebene nachweisbar. Die Stimulation von CD36 und ABCA-1 durch Nikotinsäure konnte auf RNA-Ebene auch an frisch präparierten peripheren Monozyten von Normalpersonen nachgewiesen werden. Die funktionelle Bedeutung der Nikotinsäureeffekte wurde in einem Cholesterin-Aufnahme und Efflux-Assay überprüft. Dabei reduzierte die Inkubation mit Nikotinsäure den zellulären Cholesteringehalt basal und unter oxLDL-Exposition und steigerte den zellulären Cholesterin-Efflux auf delipidiertes HDL. Diese neuen Effekte der Nikotinsäure auf mehrere Lipid-Rezeptoren und -Transporter können Lipidablagerungen in der Gefäßintima reduzieren, der Schaumzellbildung entgegenwirken und durch vermehrte Einschleusung von zellulärem Cholesterin in den reversen Cholesterintransport zurück zur Leber die HDL-Spiegel erhöhen. Diese peripheren Effekte der Nikotinsäure ergänzen die Effekte von Statinen und liefern ein Rational für einen potentiell überadditiven klinischen Nutzen durch die Kombinationstherapie, die gegenwärtig klinisch geprüft wird.