Podcasts about ribosomenbiogenese

Fri, 15 Jun 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15185/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15185/1/Muehl_Bastian.pdf Muehl, Bastian Jan Josef ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biologie

Die Biogenese eukaryotischer Ribosomen ist ein streng kontrollierter, dynamischer Prozess, der ein komplexes räumliches und zeitliches Zusammenspiel vieler verschiedener Proteine erfordert. Dabei wird zunächst ribosomale DNA mit Hilfe der RNA-Polymerase I im Nukleolus transkribiert. Das daraus resultierende rRNA-Vorläufer-Molekül wird anschließend umfassend prozessiert und modifiziert. Gleichzeitig assemblieren ribosomale Proteine mit der reifenden rRNA, um präribosomale Partikel zu bilden, die für weitere Reifungsschritte ins Nukleoplasma und Cytoplasma transportiert werden. Zum Verständnis des ribosomalen Reifungsprozesses haben bislang vor allem genetische und biochemische Studien in der Bäckerhefe beigetragen. In Säugerzellen sind dagegen die Komponenten der Ribosomenbiogenese wenig charakterisiert, und insbesondere unser Wissen über die Regulationsmechanismen ist lückenhaft. Die posttranslationale Modifikation mit dem ubiquitinähnlichen SUMO-Protein reguliert eine Vielzahl wichtiger zellulärer Prozesse. SUMO-spezifische Isopeptidasen der SENP-Familie katalysieren die Abspaltung von SUMO von Zielproteinen und kontrollieren damit das Gleichgewicht zwischen Modifikation und Demodifikation. Vorarbeiten zu dieser Arbeit haben eine entscheidende Rolle für die SUMO-Isopeptidase SENP3 während der nukleolären Schritte der Ribosomenbiogenese gezeigt. Allerdings waren die Substrate von SENP3 bei diesem Prozess weitgehend unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein SENP3-assoziierter Proteinkomplex bestehend aus den Komponenten PELP1, TEX10 und WDR18 aufgereinigt. Als weitere Bindungspartner von PELP1 wurden außerdem MDN1 und LAS1L identifiziert. Durch RNAi-vermittelte Depletionsexperimente in Zellkultur konnte gezeigt werden, dass PELP1, TEX10 und WDR18, sowie die assoziierten Proteine MDN1 und LAS1L, ebenso wie SENP3 für die Reifung der 28S rRNA und den nukleolären Export der großen ribosomalen Untereinheit erforderlich sind. PELP1 und LAS1L wurden als SENP3-sensitive SUMOSubstrate charakterisiert. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass das Gleichgewicht zwischen Sumoylierung und Desumoylierung die subnukleäre Lokalisierung des Komplexes kontrolliert. Sumoylierung führt zum Ausschluss aus dem Nukleolus, während Desumoylierung die nukleoläre Kompartimentierung fördert. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass der Komplex aus den Proteinen PELP1, TEX10 und WDR18 die Ribosomenbiogenese reguliert. Außerdem deuten sie darauf hin, dass dessen SUMO-abhängige subzelluläre Verteilung Ablauf und Koordination der Ribosomenreifung kontrolliert.

Haematopoiese, die Bildung der Blutzellen aus haematopoietischen Stammzellen, ist ein Prozess, der im Knochenmark von Vertebraten stattfindet. Zur Steuerung von Erhalt, Differenzierung und Selbst-Erneuerung haematopoietischer Stammzellen ist das Einwirken diverser Faktoren aus verschiedenen zellulären Milieus von essentieller Bedeutung. Die Proteinfamilie der EBF (early B-cell factor) Transkriptionsfaktoren besteht aus 4 Mitgliedern, welche sowohl untereinander als auch evolutionär stark konserviert sind. Eine essentielle Rolle von EBF1 in der Haematopoiese, genauer in der Entstehung früher B-Zellen konnte bereits nachgewiesen werden. Die Expression von EBF2, einem weiteren Mitglied dieser Familie, konnte in haematopoietischen Organen wie dem Knochenmark, genauer in Osteoblasten, gezeigt werden. Ebf2-exprimierende osteoblastäre Zellen sind dem Endosteum angelagert und stellen eine molekulare Nische dar, die zum Erhalt haematopoietischer Zellen beiträgt. Wie gezeigt werden konnte ist die Anzahl von Osteoblasten proportional zur Anzahl haematopoietischer Stammzellen. Die gezielte Zerstörung von Ebf2 in mutanten Mauslinien führt dazu, dass es zu einer verminderten Anzahl haematopoietischer Stammzellen im Knochenmark kommt. Dieser Phänotyp beruht auf einer direkten Störung der stammzellunterstützenden Funktion von unreifen Osteoblasten in EBF2-defizienten Mäusen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Analyse EBF2-defizienter Zellen einen Beitrag zur besseren Charakterisierung der Stammzellnische leisten kann. Durch den Vergleich der Expressionsmuster von Ebf2+/- und Ebf2-/- osteoblastären Zellen der Maus konnte Ang1, ein Mitglied der RNAse5-Familie in EBF2-defizienten Zellen als vermindert exprimiert gefunden werden. Dieses sezernierte Protein spielt eine Hauptrolle bei der Bildung von Blutgefäßen. Auch ist bekannt, dass Ang1 an Zellen bindet, in diese eingebracht wird und dort durch die Stimulation der rRNA-Transkription die Ribosomenbiogenese und somit die Zellproliferation beeinflussen kann. Das verringerte Ang1-Level in der haematopoietischen Stammzellnische könnte so einen Einfluss auf die Proliferation der Stammzellen haben. Analysen dieser Arbeit identifizieren Ang1 als direktes Zielgen von EBF2. In vitro konnte durch eine gleichzeitige Verminderung der Expression von Ebf1, 2 und 3 in osteoblastären Zellen mittels RNAi eine weitere Verringerung der stammzellunterstützenden Funktion der Osteoblasten gezeigt werden. Um diesen Effekt in vivo untersuchen zu können, wurde ein Mausmodell zur gleichzeitigen Expressionsverminderung von Ebf1, 2 und 3 generiert.

Die Biogenese von Ribosomen ist Voraussetzung für die Neusynthese von Proteinen und somit auch für Zellwachstum unabdingbar. In den Nukleoli der Zellen muss eine Vielzahl von Ribosomenbiogenese-Faktoren funktionell reguliert und koordiniert werden, damit reife 40S- und 60S- ribosomale Untereinheiten entstehen. Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, wie das nucleostemin (nst) Gen an dem zellulären Prozess der Ribosomenbiogenese partizipiert. Zur Beantwortung dieser Frage wurden mehrere Punkt- und Deletionsmutanten von nst kloniert, exprimiert und zuerst auf ihren intrazellulären Lokalisationsphänotyp hin überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend nukleoläre Lokalisation von NST durch den N-Terminus des Proteins, bestehend aus der basischen- und Coiled-Coil Domäne, vermittelt und durch zirkulär permutierte GTP-Bindemotive reguliert wird. Die Überexpression der nst Mutanten verursachte des Weiteren keine nukleoplasmatische Translokation des nukleolären Stressdetektorproteins Nucleophosmin (B23). Ein weiterer Überexpressionsphänotyp des nst Wildtyp-Gens ist eine signifikante Proliferationserhöhung in p53-positiven Zellen. Ein knock-down von nst resultiert in einer deutlichen Proliferationsinhibition von p53 positiven- als auch p53 negativen Zellen und einem p53 vermittelten G1/S-Phase Zellzyklusarrest. Auf Ebene der ribosomalen RNA induziert die temporäre Herabregulation von nst einen 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt, welcher in verringerten de novo prozessierten 28S rRNA Mengen resultiert. In einem miRNA/siRNA basierten knock-down knock-in Experiment wurde der N-Terminus des Proteins zudem als minimale Funktionseinheit identifiziert: die Expression einer Mutante, bestehend aus der basischen und Coiled Coil Domäne, konnte den durch RNAi induzierten 32S-rRNA-Prozessierungsdefekt kompensieren. Der N-Terminus von NST sedimentiert zudem in einem Sucrose-Gradienten in Wildtyp-ähnlicher Manier, im Gegensatz zu einer NST Proteinvariante, welcher dieser Teil des Proteins fehlt. Eine Interaktion des NST-Proteins mit dem PeBoW-Komplex oder dem p53 Regulator Hdm-2 konnte nicht gezeigt werden. Diese Arbeit beschreibt somit NST als 32S rRNA-Prozessierungsfaktor und definiert den N-Terminus des Proteins als minimale Funktionseinheit während der Ribosomenbiogenese.

Während der Zellproliferation müssen Zellwachstum und Zellteilung koordiniert werden. Die Kopplung erfolgt in der Hefe durch einen Komplex aus Nop7p, Erb1p und Ytm1p, der sowohl an der Ribosomenbiogenese als auch an der Kontrolle der DNA-Replikation beteiligt ist. Die homologen Proteine Pes1, Bop1 und WDR12 werden in Säugern von Zielgenen des Transkriptionsfaktors c-Myc, einem zellulären Onkoprotein, kodiert. In dieser Arbeit wurde die Existenz eines evolutionär konservierten Komplexes aus Pes1, Bop1 und WDR12 (PeBoW-Komplex) in Säugern belegt. Dabei wurde gezeigt, dass Bop1 als zentrales Protein des Komplexes agiert und die Interaktion von Pes1 und WDR12 vermittelt. Die Integrität des Komplexes ist wesentlich für seine Funktion. Die Depletion einzelner Komponenten sowie die Überexpression des integrierenden Proteins Bop1 hemmen die Reifung der Vorläufer-rRNA der großen ribosomalen Untereinheit sowie die Proliferation der Zellen. Bop1-Überexpression führt zur Ausbildung von zwei Subkomplexen aus Bop1 und Pes1 bzw. Bop1 und WDR12. Während der Bop1/Pes1-Subkomplex als Teil der pre-Ribosomen im Nukleolus lokalisiert, wird WDR12 durch Bop1-Überexpression im Zytoplasma gehalten und fehlt im Nukleolus zur Ausbildung eines funktionellen PeBoW-Komplexes. Pes1 und WDR12 können unabhängig in den Nukleolus translozieren, während Bop1 dafür die Interaktion mit Pes1 benötigt. Untersuchungen zur Stabilität der einzelnen PeBoW-Komponenten zeigten, dass monomeres Bop1 extrem instabil ist, durch Inkorporation in den PeBoW-Komplex aber vor Abbau geschützt wird. Möglicherweise werden hierdurch interne PEST-Sequenzen in Bop1 maskiert. Die Menge an Bop1 ist somit abhängig von der Anwesenheit von Pes1 und WDR12. Die gegenseitige Abhängigkeit der Stabilität aller drei PeBoW-Komponenten konnte in weitergehenden Experimenten gezeigt werden. Schließlich wurde untersucht, ob der PeBoW-Komplex die Ribosomenbiogenese mit der DNA-Replikation über Interaktion mit dem ORC-Komplex, wie in der Hefe beschrieben, koordiniert. Mit Hilfe der BiFC-Methode konnte eine Interaktion von Pes1 mit Orc6, eines Faktors des ORC-Komplexes, gezeigt werden. Die koordinierende Funktion des PeBoW-Komplexes für Zellwachstum und Zellproliferation scheint von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert zu sein.

Zusammenfassung: Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der hochkonservierten, essentiellen ABC-ATPase Rli1p in Saccharomyces cerevisiae aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass beide Nukleotid-Bindungsdomänen und eine Scharnierregion, welche die beiden ABC-Domänen miteinander verbindet, wichtig für die Funktion von Rli1p sind. Des Weiteren konnte auch das N-terminale Eisen-Schwefel Cluster Bindemotiv als essentielle Domäne identifiziert werden. Durch Überexpression von inaktiven rli1p-Proteinvarianten wurde ein dominant-negativer Phänotyp erzeugt. Es konnte nachgewiesen werden, dass Rli1p im Zytoplasma lokalisiert ist und mit den Polyribosomen, den 80S Ribosomen und hauptsächlich mit der 40S Untereinheit co-fraktioniert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Rli1p mit einem Subkomplex des Translationsinitiationsfaktors eIF3 und ribosomalen Proteinen interagiert. Diese Interaktion ist abhängig von RNA und funktionalen ABC-Domänen, sowie von eIF3j/Hcr1p, einer Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF3. Um die zelluläre Funktion von Rli1p näher charakterisieren zu können, wurde versucht eine konditional temperatursensitive Mutante herzustellen und Rli1p durch Repression der Transkription in vivo zu depletieren. Beide Ansätze waren nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurden in vitro Depletionssysteme etabliert. Immundepletion oder Inaktivierung eines mit TEV-Protease spaltbarem Rli1p führte zu einer Reduktion der Translationsaktivität und demonstrierte damit einen direkten Einfluss von Rli1p auf die Translation. Eine vollständige Inhibition der Translation einer Reporter-mRNA konnte durch Zugabe eines a-RLI1-Antikörper erreicht werden, wobei die Translationsextrakte einen Zerfall von den Polyribosomen und der 80S Komplexe in 60S und 40S Untereinheiten aufwiesen. Die Immunoinhibition konnte durch die Zugabe von gereinigtem Rli1p rückgängig gemacht werden. Neben einer biochemischen konnte auch eine genetische Interaktion von RLI1 mit HCR1 nachgewiesen werden. Durch Kombination eines Dhcr1 Knockout mit einem C-terminal markierten Rli1p entstand ein synthetisch-temperatursensitiver Phänotyp. Nähere Untersuchungen dieses Stammes zeigten eine Reduktion von Polyribosomen und einen Defekt bei der 60S Bindung an den Prä-Initiationskomplex, während die Ribosomenbiogenese nicht beeinflusst wurde. Für die zelluläre Funktion von Rli1p konnte ein Modell erarbeitet werden, in dem Rli1p den Translationsinitiationsfaktor eIF3 auf dem 40S Ribosom assembliert oder richtig positioniert. Diese Funktion des Rli1p könnte auch in der Anti-Assoziation von 80S durch eIF1, eIF1A und eIF3 von Bedeutung sein. Dieses Modell soll in Folgeexperimenten geprüft werden und die Bindungsstelle von Rli1p im 43S Prä-Initiationskomplex durch Cryo-EM näher analysiert werden.

Proliferation erfordert die Koordination des Zellwachstums mit der Zellzyklusmaschinerie. Daten aus der Hefe belegen eine Funktion des Komplexes aus Nop7p, Ytm1p und Erb1p in der Ribosomenbiogenese, dem energieaufwendigsten Prozeß des Wachstums, und der Replikation. Die Beteiligung an diesen Schlüsselprozessen des Zellzyklus läßt die Vermutung zu, daß dieser Komplex eine Funktion bei der Koordination von Wachstum und Zellzyklusprogression innehat. In Säugern existiert ein trimerer Komplex, der sogenannte PeBoW-Komplex, der sich aus Pes1, WDR12 und Bop1 zusammensetzt, die einen hohen Grad an Homologie mit Nop7p, Ytm1p und Erb1p aufweisen. Der PeBoW-Komplex ist in Säugern an der Ribosomenbiogenese beteiligt, spielt eine Rolle in der Mitose, und dominant-negative Mutanten seiner Komponenten inhibieren die Zellzyklusprogression. Die Koordinatorfunktion des Komplexes scheint von der Hefe bis zum Menschen konserviert zu sein. In dieser Arbeit wurden Deletionsmutanten von Pes1 generiert und auf ihren Effekt auf die Zellzyklusprogression und die pre-rRNS Prozessierung hin untersucht. Die Expression zweier dieser Mutanten, Pes1 M1 mit einer N-terminalen und Pes1 M5 mit einer C-terminalen Deletion, induzierte einen reversiblen Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Beide Mutanten zeigten zudem einen dominant-negativen Effekt auf die Prozessierung der 36S und 32S pre-rRNS. Mutante M5 blockierte zusätzlich die Reifung des 12S Vorläufers. Sowohl Mutante M1 als auch Mutante M5 induzierten eine p53-Akkumulation in proliferierenden, nicht jedoch in serumgehungerten Zellen, was eine Abhängigkeit der p53-Antwort von einer aktiven Ribosomenbiogenese nahelegt. Die p53-Antwort zog eine Akkumulation des Cdk-Inhibitors p21 nach sich, und die Coexpression des E6-Proteins schwächte den von M1 und M5 hervorgerufenen Zellzyklusarrest merklich ab. Die p53 Antwort konnte damit als Ursache des Zellzyklusarrests ausgemacht werden. Über native Gelelektrophorese und Immunpräzipitationen der Pes1-Mutanten konnten die BRCT-Domäne und ein Teil der NPLP-Domäne als essentielle Domänen für die Inkorporation von Pes1 in den PeBoW-Komplex bestimmt definiert werden. Die erhobenen Daten legen Inkorporation in den PeBoW-Komplex als Voraussetzung für die nukleoläre Lokalisation, wie auch für die Ausbildung eines dominant-negativen Phänotyps der Pes1-Mutanten nahe.