Podcasts about serumresistenz

Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Nach wie vor spielen die von enteropathogene Yersinien hervorgerufenen Erkrankungen eine wichtige Rolle im Bereich der gesamten klinischen Medizin. Neben akuten Erkrankungen (Yersiniosen), die vor allem bei Kleinkindern, alten und abwehrgeschwächten Patienten vorkommen, sind es auch die verschiedenen immunologischen Folgeerkrankungen, wie Arthritiden oder das Reitersyndrom, die im besonderen Yersinia enterocolitica in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses rücken und eine molekularbiologische Analyse der Infektionsmechanismen nötig machen. Eine besondere Bedeutung kommt dem hochkonservierte Virulenzplasmid pYV zu, das für ein TypIII- Proteinsekretionssystem und für das Yersinien Adhäsin YadA (Autotransporter, TypV-Sekretionssystem) kodiert. YadA ist der Prototyp einer Gruppe von Autotransportern, deren struktureller Aufbau sich von allen anderen bisher bekannten Autotransporterklassen unterscheidet, vor allem im Bereich des Membranankers, des Teils also, der für den Einbau des Proteins in die Membran, den Transport der funktionellen Domäne durch die Membran, die Oligomerisierung und die Stabilität des Gesamtproteins verantwortlich ist. Auf Grund dieser aus molekularbiologischer Sicht zentralen Rolle, die der Membrananker für das Funktionieren des Adhäsins und Autotransports von YadA spielt, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit mehr über die Topologie und strukturellen Eigenschaften sowie des Oligomerisierungs- und Transportmechanismus dieser C-terminalen Domäne von YadA in Erfahrung zu bringen. Der Membrananker selbst besteht aus vier C-terminalem ß-Faltblättern (Anker-Bereich) sowie dem N-terminalem linker-Bereich, der Verbindung zur funktionellen Passagierdomäne herstellt. In den linker-Bereich von N-terminal verkürzten YadA-Mutanten wurden FLAG-Sondensequenzen einkloniert, die mit speziell an diese FLAG-markierten Bereiche bindenden monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden können und so eine Aussage über extrazelluläre oder intrazelluläre lokalisierte Domänen möglich machen. Die Ergebnisse dieser Versuche legen nahe, dass nahezu der gesamte linker-Bereich innerhalb der Membran, also der vom Ankerbereich gebildeten transmembranösen Pore, befindet. Weiterhin wurde versucht, mittels Cystein-Scanning-Mutagenese die FLAG-Experimente zu bestätigen, was nicht gelang, weil die eingefügten Cysteinreste in YadA nicht spezifisch mit Biotinmalleimid reagierten. In einem weiteren Versuch wurde der gesamte YadAMembrananker gegen Membrananker anderer Mitglieder der Oca-Familie (UspA1 von Moraxella catarrhalis, EibA von Escherichia coli, Hia von Haemophilus influenza)ausgetauscht. Es stellte sich heraus, dass alle so hergestellten YadA-Hybridproteine exprimiert und an der Bakterienoberfläche exponiert werden. Jedoch zeigten sich Unterschiede bei der Funktionalität der Hybridadhäsine, vor allem in der Serumresistenz, der Autoagglutination und der Oligomerenstabilität. Die durchgeführten Untersuchungen bestätigen das bestehende Modell des YadAMembranankers als Autotransporter und unterstützen die Einteilung von YadA, EibA, UspA1 und Hia in eine einheitliche Klasse von Autotransportern, die als Oca-Familie bezeichnet wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die N-terminale YadAPassagierdomäne von unterschiedlichen Autotransporterdomänen über die äußere Bakterienmembran transloziert wird.

Die humanpathogenen Bakterien Yersinia enterocolitica und Yersinia pseudotuberculosis sind die Verursacher von Darminfekten wie Enteritis und Enterokolitis. Das äußere Membranprotein YadA stellt bei Y. enterocolitica einen essentiellen Pathogenitätsfaktor dar. Seine virulenzassoziierten Eigenschaften sind die Fähigkeit zur Autoagglutination, die Bindung an Moleküle der extrazellulären Matrix, an Epithelzellen und Granulozyten, und die Vermittlung von Serumresistenz. Welchen Teil die verschiedenen Domänen des Proteins zur Struktur und Funktion beitragen, war bisher kaum bekannt. Auch der Versuch, dem Adhäsin durch einen Domänenaustausch völlig neue Bindungs- oder Reaktionseigenschaften zu vermitteln, war bislang nicht unternommen worden. Darum wurden In-Frame-Deletionsmutanten, mit FLAG-Epitopen oder FaktorXa-Proteaseschnittstellen versehene YadA-Mutanten erstellt und FimH-YadA-Hybridproteine konstruiert. Die verschiedenen YadA-Mutanten wurden strukturell auf ihre Außenmembranlokation, Oberflächenexposition und Oligomerisierung untersucht, funktionell auf ihre Adhäsionseigenschaften und Serumresistenz. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: Kopf- und Stieldomäne bilden zusammen mit der interponierten, stark konservierten Neck-Region die translozierte, oberflächenexponierte Passenger-Domäne. Die C-terminale Membranankerregion (as 353-422) ist ausreichend für Insertion in die Außenmembran und Bildung eines trimeren YadA. Die Linker-Region vermittelt die Translokation der Passenger-Domäne durch die Außenmembran. Somit zeigte sich, dass YadA alle Kriterien für einen Autotransporter erfüllt. Der Versuch, ein Hybridadhäsin mit Mannosebindungsfähigkeit durch Austausch der Kopfdomäne mit der Lektin-Domäne von FimH zu erzeugen, schlug fehl. Dies zeigt, wie empfindlich Passenger-Domäne und Membrananker von YadA aufeinander abgestimmt sind. Die funktionelle Untersuchung der Mutanten ergab, dass die hochkonservierte Neck-Domäne zusammen mit der Kopfregion ein Bindungsmodul für Kollagen und Epithelzellen darstellt. Im Serumresistenztest erwiesen sich Kopf-, Neck- und auch Teile der Stiel-Region für ein Überleben entbehrlich. Es zeigte sich, dass keine Domäne für die Serumresistenz von YadA entscheidend ist.