Podcasts about metabolisierung

Ursula, Hans-Dieter und Bernd blicken zurück auf ihre letzte Sendung, um dann mit der Reise der Wirkstoffe fortzufahren.

Nachdem ich die letzten 3 Episoden über Technologie geredet, die Forschern einen Nobelpreis engebracht hat, wollte ich wieder über etwas alltäglicheres reden. Und was alltäglicheres gibt es als Brot zu essen? In dieser Episode besprechen wir, warum Brot nach einer Weile kauen anfängt süß zu schmecken. Ich hoffe euch gefällts :) Willst du einen Kommentar zu dieser Episode oder zu diesem Podcast abgeben oder hast du einen Vorschlag für ein Thema, dann gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder schreibe mir auf Twitter unter @alltagschemie oder schicke mir einfach altmodisch eine email auf chem.podcast@gmail.com. Quellen Evolutionärer Vorteil beim Identifizieren von süßer Nahrung https://en.wikipedia.org/wiki/Sweetness Die Zunge und Geschmack https://en.wikipedia.org/wiki/Tongue https://en.wikipedia.org/wiki/Tongue_map https://en.wikipedia.org/wiki/Taste https://en.wikipedia.org/wiki/Taste_bud https://en.wikipedia.org/wiki/Taste_receptor Zucker und Saccharide https://en.wikipedia.org/wiki/Sugar https://en.wikipedia.org/wiki/Carbohydrate https://en.wikipedia.org/wiki/Monosaccharide https://en.wikipedia.org/wiki/Disaccharide https://en.wikipedia.org/wiki/Trisaccharide https://en.wikipedia.org/wiki/Oligosaccharide https://en.wikipedia.org/wiki/Polysaccharide Beispiele von Disacchariden https://en.wikipedia.org/wiki/Sucrose https://en.wikipedia.org/wiki/Maltose Beispiele von Monosacchariden https://en.wikipedia.org/wiki/Glucose https://en.wikipedia.org/wiki/Fructose Beispiele von Polysacchariden https://en.wikipedia.org/wiki/Starch https://en.wikipedia.org/wiki/Chitin https://en.wikipedia.org/wiki/Cellulose Glykolyse, die Metabolisierung von Glukose https://en.wikipedia.org/wiki/Glycolysis Brot und seine Zutaten https://en.wikipedia.org/wiki/Flour https://en.wikipedia.org/wiki/Bread Speichel,Alpha-amylase and seine Wirkungsweise https://en.wikipedia.org/wiki/Saliva https://en.wikipedia.org/wiki/Amylase https://en.wikipedia.org/wiki/Hydrolysis

Die ISH (International Society of Hypertension) thematisiert in ihrer neuen Leitlinie “Global Hypertension Practice Guidelines” nicht nur die globale Herausforderung von Bluthochdruckerkrankungen, sondern gibt auch individuelle Therapieempfehlungen nach Ethnizität (“ethnicity”). Der Grund: Schwarze Patient*innen (“black patients”) haben ein 3-fach erhöhtes Risiko, unter ACE-Hemmern Angioödeme zu entwickeln. In dieser Podcastfolge zum Studientelegramm beschäftigen wir uns daher mit den komplexen Zusammenhängen zwischen Genetik, individueller Physiologie und Herkunft. Anhand weiterer Studien untersuchen wir die Limitationen dieser Zusammenhänge und des Begriffs “Ethnizität” in der Medizin.

Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich, dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert. Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert. Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60% unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt. Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen, neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem Nutzen ist.

Phytosterole, die Sterole von Pflanzen, unterscheiden sich von Cholesterol nur durch eine Alkylsubstitution an C24 und eventuell eine Doppelbindung in der Sterol-seitenkette. Trotz vergleichbarer Zufuhr von 200 - 600 mg/d und der großen strukturellen Ähnlichkeit werden von Phytosterolen nur 0,6 - 7%, von Cholesterol jedoch etwa 60% systemisch absorbiert. Phytosterole senken in hohen Dosen (> 2g/d) die Cholesterolabsorption um etwa 30% und die LDL-Cholesterol-Spiegel um bis zu 15% und werden deshalb zunehmend in „funktionellen Lebensmitteln“ vermarktet. Als Mechanismus wurde lange eine rein luminale, physico-chemische Interferenz mit der mizellären Emulgierung von Cholesterol postuliert. Spätestens seit der molekularen Aufklärung der Phytosterolspeicherkrankheit Sitosterolämie als dysfunktionelle Mutationen der apikalen Steroltansportproteine ABCG5/G8 stand fest, dass Phytosterole sehr wohl in Enterozyten aufgenommen, aber durch ABCG5/G8 effektiv ins Darmlumen resezerniert werden. Da ABCG5/8 auch Cholesterol transportieren kann, blieb die intestinale Sterol-Selektivität und -Interaktion weiterhin unklar. In allen Zellen wird ein Cholesterolüberschuss über bestimmte Oxycholesterole signalisiert, die den nukleären Transkriptionsfaktor LXRα aktivieren und so u.a. die Expression des zellulären Cholesterolexporters ABCA1 stimulieren. Dies ließ eine Rolle von Oxycholesterolen oder analogen regulatorischen Oxyphytosterolen bei der enterozytären Sterol-Interaktion und -Selektivität vermuten. Deshalb wurde am humanen Enterozytenmodell Caco-2 das Handling und die Metabolisierung von Phytosterolen und Cholesterol allein und in Kombination verglichen. Sitosterol wurde eindeutig, wenn auch langsamer als Cholesterol, von Enteroyzten akkumuliert, reduzierte aber bei Kombination die Cholesterolabsorption. Dies war teilweise durch Hemmung der apikalen Aufnahme, aber überwiegend der basolateralen Cholesterolsekretion bedingt, unabhängig von der Mizellenbildung, und nicht durch Sättigung einer limitierten Transportkapazität erklärbar. Im humanen Enterozyten und vergleichend in Hepatozyten und Makrophagen wurde deshalb nach potentiell regulatorischen Oxysterolen gesucht. Aus allen Sterolen wurden in diesen Zellen nur die 27-Hydroxy- und 27-Carboxy-Metaboliten gebildet, andere LXR-agonistische Oxysterole waren nicht nachweisbar. Der Umsatz war für Sitosterol und Campesterol abhängig von der Länge der C24-Alkylsubstitution deutlich geringer als für Cholesterol. In Ko-Inkubationen hemmten Phytosterole konzentrations- und C24-alkyl-abhängig die Bildung von 27-OH-Cholesterol. Diese kompetitive Hemmung und die geringe 27-Hydroxylierung von Phytosterolen selbst wurde auch in Präparationen des katalysierenden Enzyms, der an der inneren Mitochondrienwand lokalisierten Cytochrom P450 Oxidase CYP27, direkt gezeigt. Die Bioaktivität der 27-OH-Sterole als LXRα-Agonisten wurde direkt im LXRE-Transaktivierungs-Assay nachgewiesen und die stimulierte Expression von CYP27 und des in Enterozyten nur basolateral lokalisierten Cholesteroltransporters ABCA1 gezeigt. Dementsprechend steigerte 27-OH-Cholesterol auch selektiv die basolaterale, systemische Cholesterolsekretion, während der apikal exprimierte Sterolexporter ABCG8 und die apikale Sterolresekretion unverändert blieben. Umgekehrt hob in Ko- Inkubationen mit Phytosterolen die exogene Substitution eines synthetischen LXRα- Agonisten als Ersatz für das reduzierte endogene 27-OH-Cholesterol die Hemmung der Cholesterolabsorption durch Phytosterole komplett auf und überfuhr die Sterolselektivität. Auch in Tracer-Experimenten mit nanomolaren Phytosterol- und Cholesterolkonzentrationen, die die Aktivierung von LXRα nicht beeinflussen können, konnte keine direkte Sterolselektivität der ABCG5/8 und ABCA1-Transporter nachgewiesen werden. Neben physico-chemischen mizellären Effekten und der allenfalls limitierten direkten Cholesterolpräferenz der Steroltransporter NPC1L1, ABCG5/G8 und ABCA1 wurde für ACAT2, die apikal einströmendes Cholesterol zu >35% verestert und in die ApoBabhängige basolaterale Chylomikronensekretion einschleust, bereits eine relative Sterolselektivität beschrieben. Bei den eigenen Untersuchungen wurde ein neuer Mechanismus auf der regulatorischen Ebene der LXRα-Aktivierung im Enterozyten gefunden: Im Zentrum steht die kompetitive Hemmung des „Cholesterol-Sensors“ CYP27 durch Phytosterole und die nur geringe 27-Hydroxylierung der Phytosterole selbst. Dadurch wird bei gleichzeitigem Einstrom von Phytosterolen und Cholesterol in Enterozyten die Bildung des dominierenden LXRα-Agonisten 27-OH-Cholesterol verhindert. Normaler-weise vermittelt dies über LXR-Aktivierung und Induktion von CYP27, LXRα und ABCA1 eine selbstinduzierbare Komponente der Cholesterolabsorption auf dem ApoA-abhängigen Weg. Der lokale LXRα-Antagonismus von Phytosterolen blockt diese Selbstbahnung, lenkt Cholesterol vermehrt um zur luminalen Resekretion durch die konstitutiv apikal exprimierten ABCG5/8 und trägt auch zur Sterolselektivität bei. In peripheren Makrophagen könnten Phytosterole über Hemmung von CYP27, LXRα und ABCA1 durch Sterol-„Trapping“ die frühe Atherosklerose trotz eher niedriger Cholesterolspiegel bei Sitosterolämie erklären. Ob auch bei ABCG5/G8-Gesunden die unter pharmakologischen Phytosteroldosen erhöhten Plasmaspiegel langfristig zur Phytosterol- und paradoxen Cholesterol-Akkumulation in peripheren Zellen führen können, ist gegenwärtig unklar.

Das Ziel dieser Arbeit war es, die konzentrationsabhängige Metabolisierung des tabakspezifischen Nitrosamins 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) in den Mikrosomen von Lunge und Leber des Menschen zu charakterisieren. Es wurden kommerziell erhältliche gepoolte Mikrosomen verwendet um vergleichbare Ergebnisse in den verschiedenen Ansätzen zu erzielen. Die Mikrosomen wurden bei einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/mL 20 min mit [5-3H]-NNK inkubiert. Zur Bestimmung der Kinetik kamen je 16 Konzentrationen von 0,006 bis 499 µM zum Einsatz. Die Charakterisierung des NNK-Metabolismus mit spezifischen Hemmstoffen für Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme, α-Naphthoflavon (NF; CYP 1A1/2), 8-Methoxypsoralen (MOP; CYP 2A6/13), Chlorzoxazon (CZ; CYP 2E1) und Troleandomycin (TAO; CYP 3A4/5) alleine und in Kombination aller 4 Stoffe, erfolgte bei 46 nM und 49 µM NNK und Hemmstoffkonzentrationen von 1, 5, 10, 25 und 50 µM. Der Einfluss von Nicotin und seines Hauptmetaboliten Cotinin wurde bei den gleichen NNK-Konzentrationen mit einem 300- bzw. 3000-fachen Überschuss der Alkaloide geprüft. Art und Menge der entstandenen Metaboliten wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit on-line Radioaktivitätsdetektion ermittelt. Durch Einsatz eines neuen Detektors mit vier hintereinander liegenden Messzellen und integrierten Additionsverfahren gelang es die Nachweisgrenze gegenüber handelsüblichen Detektoren um den Faktor 10 zu senken. Die Zuordnung der Metaboliten erfolgte durch Co-Chromatographie von Referenzsubstanzen, die durch UV-Detektion bei 245 nm bestimmt wurden. In Humanlebermikrosomen wurden 5 NNK-Metaboliten nachgewiesen, das Reduktionsprodukt 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), die Produkte der α-Methylenhydroxylierung von NNK und NNAL, 4-Oxo-4-(3-pyridyl)-butansäure (Ketosäure) und 4-Hydroxy-4-(3-pyridyl)-butansäure (Hydroxysäure), das Produkt der α-Methylhydroxylierung von NNK, 4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) und das N-Oxidationsprodukt von NNK, das NNK-N-Oxid. Humane Lungenmikrosomen bildeten die gleichen Metaboliten außer HPB. Die Umsätze konnten für alle Metaboliten über den gesamten Konzentrationsbereich von 6 nM bis 500 µM einer Reaktionskinetik nach Michaelis-Menten angepasst werden. Bei Anpassung nur im niedrigen, nanomolaren Bereich ergaben sich für alle Metaboliten außer Ketosäure und HPB km- und Vmax-Werte, die um 2 bis 3 Größenordnungen niedriger lagen als die Werte, die für den gesamten Konzentrationsbereich erhalten wurden. Dabei änderte sich die katalytische Effizienz, der Quotient aus Vmax/km-Werten nur geringfügig. Die Hemmstoffe wirkten in Lebermikrosomen stärker als in Lungenmikrosomen. Bei keinem der Hemmversuche konnte jedoch selbst unter Verwendung der höchsten Konzentration eine vollständige Hemmung der NNK-Verstoffwechslung durch α-Hydroxylierung und N-Oxidation erzielt werden. Die CYP-Inhibitoren hatten erwartungsgemäß nur einen geringen Einfluss auf die NNK-Reduktion zu NNAL. In der Leber wurde die HPB-Bildung am stärksten gehemmt, gefolgt von der NNK-N-Oxidation, der Bildung von Ketosäure und der Bildung von Hydroxysäure. In Lungenmikrosomen war die Hemmung der NNK-N-Oxidation am stärksten ausgeprägt. Die größten Unterschiede zwischen der nano- und der mikromolaren NNK-Konzentration zeigte sich in Lebermikrosomen bei Einsatz von NF mit mäßiger bis starker Hemmung aller Stoffwechselwege bei 46 nM NNK und keiner Hemmung bis z.T. leichter Steigerung des Metabolismus bei 49 µM NNK. Auffällige Unterschiede auch bei TAO in Leber und Lunge und bei CZ in der Leber zeigen, dass sich Versuche mit bisher verwendeten hohen NNK-Konzentrationen nur bedingt auf niedrigere Konzentrationen übertragen lassen. Die in früheren Untersuchungen gezeigte Hemmung des NNK-Stoffwechsels konnte bei der mikromolaren NNK-Konzentration für die α-Hydroxylierung von NNK in Lungen- und Lebermikrosomen bestätigt werden. In der Leber wurde auch die NNK-N-Oxidation deutlich gehemmt. Überraschend war die Hemmung der Reduktion von NNK zu NNAL in Lungen- und Lebermikrosomen. All diese Effekte gingen bei Einsatz der nanomolaren NNK-Konzentration verloren. Es ist deshalb fraglich, ob unter realen Bedingungen bei Rauchern der NNK-Stoffwechsel durch die Tabakalkaloide beeinflusst wird. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass die bei Verwendung unrealistisch hoher Konzentrationen von Fremdstoffen in vitro erzielten Ergebnisse nicht ohne weiteres auf die tatsächliche Belastungssituation des Menschen durch Umwelt, Nahrung und Genuss von Tabakwaren zu übertragen sind.

Die vorliegende Arbeit sollte klären, ob bei neugeborenen Kälbern mit Durchfallerkrankung eine Thiaminunterversorgung besteht und ob dieser Umstand den Laktatmetabolismus beeinflusst. In die Untersuchung wurden 150 Kälber im Alter bis zum 21. Lebenstag einbezogen, die bei Einlieferung in die Klinik an Durchfall erkrankt waren. Die Tiere durften vorberichtlich nicht mit B-Vitaminen vorbehandelt sein. 37 Kälber wiesen TPP-Effektwerte (Mittelwerte) >40 % auf und zeigten damit Hinweise auf einen Thiaminmangel. Diese Tiere hatten durchschnittlich höhere D-Laktatwerte. Ebenso war die Blutazidose bei den schlecht mit Thiamin versorgten Tieren stärker ausgeprägt als bei den Kälbern mit ausgeglichenem Thiaminhaushalt. Die Differenzen bezüglich der D-Laktatwerte und der Blutazidose waren zwischen den Gruppen mit und ohne Thiaminunterversorgung jeweils signifikant. Bei der Kontrolle der Laborwerte nach vier Stunden näherten sich die Werte beider Gruppen einander an, während bei der Überprüfung nach 24 Stunden die Kälber mit Thiaminmangel wieder niedrigere Basenexcesswerte sowie einen deutlich höheren D-Laktatspiegel im Blut aufwiesen als die Tiere mit TPP-Effektwerten < 40 %. Die Werte unterschieden sich erneut signifikant. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei Kälbern mit einer Thiaminunterversorgung die Metabolisierung von D-Laktat noch langsamer als üblich vonstatten geht.

In Deutschland wird Methadon sowohl als Racemat (Dextro-Levomethadon) als auch in der allein wirksamen Form (Levomethadon) als Substitutionsmittel angewandt. Die Wirkung und der Metabolismus von Methadon sind stereoselektiv. Wenn man sich daher insbesondere aus forensischer Sicht der Frage einer Dosis-Wirkungs-Beziehung von Methadon nähern will, ist eine stereoselektive Analytik Voraussetzung. Eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Methode wurde hierfür ins-besondere zur routinemäßigen Anwendung an Leichenblutproben optimiert: nach flüssig-flüssig Extraktion mit 1-Chlorbutan wurde der Extrakt auf einer Säulenkombination aus 4 cm Cyano- und 10 cm chiraler Alpha-1-Glykoprotein-Phase mit Acetonitril, 0,01 molarem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,0 Dimethyloctylamin (15/85/0,05) aufgetrennt. Die Methadon-Enantiomeren eluieren Basislinien-getrennt bei 15 min (Levo-Form) beziehungsweise 18 min (Dextro-Form). Die beiden Metaboliten Levo- und Dextro-EDDP und typische Beigebrauchsstoffe wie beispielsweise Heroin, Kokain, Benzodiazepine, trizyklische Antidepressiva, Antiepileptika stören nicht. Mit dieser Methode wurde das Verhältnis von Levo- und Dextromethadon in 93 Serumproben von lebenden Probanden und 106 Leichenblutproben bestimmt und aus der mit anderen Methoden wie Gaschromatographie/ Massenspektrometrie beziehungsweise Reverse Phase Hochdruck-flüssigkeitschromatographie ermittelten Gesamtmethadonkonzentration die Levomethadonkonzentration berechnet. In etwa der Hälfte der Todesfälle lag die Levomethadonkonzentration über 0,3 mg/l, ein Wert, der bei den Lebenden nur in einem Fall überschritten wurde. Bei Racemataufnahme lag das Verhältnis von Levo- und Dextromethadon im Blut bei Lebenden ebenso bei Leichen etwa zwischen 25/75 und 75/25, im Mittel bei 50/50. In Proben aus 1999 wurden in circa 20% der Fälle sowohl bei lebenden als auch bei verstorbenen Drogenabhängigen ausschließlich Levomethadon gefunden. In einigen Fällen war auffallend, dass offensichtlich eine gemischte Versorgung mit Levomethadon plus Racemat erfolgt ist. Anlass zu Bedenken geben Todesfälle mit hohen Levomethadonkonzentrationen (> 1 mg/l), bei denen das Levo-/Dextro-Racematverhältnis ausnahmslos deutlich über 50/50 lag. Dies könnte als Hinweis darauf gewertet werden, dass in diesen Fällen eine besonders langsame Metabolisierung von Levomethadon zu einer tödlichen Kumulation des wirksamen Levomethadonanteils geführt hat. Unsere Fälle zeigen die Notwendigkeit einer stereoselektiven Quantifizierung von Levomethadon sowohl zum therapeutischen drug monitoring als auch zur forensischen Diagnostik.