Podcasts about pigmentierung

Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Ziel dieser Arbeit war es, mittels Licht- und Rasterelektronenmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden, die Morphologie der Hornhaut im tierartlichen Vergleich an Hand unserer Haussäugetiere detailliert zu beschreiben. Für die Untersuchungen wurden die Hornhäute von 28 Schweinen, 11 Rindern, 2 Ziegen, 6 Pferden, 4 Hunden und 5 Katzen verwendet. Speziesspezifische Besonderheiten wurden bildlich dokumentiert und zur Verdeutlichung tabellarisch dargestellt. Die Hornhaut unserer Haussäugetiere baut sich aus dem Hornhautepithel, dem Stroma, der Descemetschen Membran und dem Hornhautendothel auf. Eine Bowmansche Membran konnte nicht dargestellt werden. Die Fleischfresser besitzen verglichen mit den Huftieren eine deutlich dünnere Hornhaut. Insbesondere das dreischichtige Epithel (Stratum basale, Stratum intermedium und Stratum superficiale) besteht bei den Fleischfressern aus einer kleineren Anzahl an Zelllagen. Die Cytokeratine 1, 2 und 3, als Bestandteile des Zytoskeletts, konnten immunhistochemisch bei allen untersuchten Tierarten, insbesondere im Stratum superficiale des Hornhautepithels, nachgewiesen werden. Das vom Zentrum aus an Höhe abnehmende Hornhautepithel lässt unter dem Rasterelektronenmikroskop auf der Oberfläche der polygonalen Epithelzellen feine Membranausstülpungen erkennen, die sich beim Fleischfresser in Form von kurzen Microvilli darstellen. Das Pferd, Rind und Schwein weisen längere Microplicae auf, die bei der Ziege einzelne ringförmige Kringel bilden. Eine beim Pferd und bei den Wiederkäuern auch epithelial zu findende Pigmentierung, lässt sich im Stroma tierartenübergreifend im Bereich des Limbus erkennen. Mit Ausnahme des anterioren Bereichs weisen die im Stroma liegenden Keratozyten einen geordneten, parallelen Verlauf auf. Tierartliche Unterschiede liegen in der Ausbildung der Descemetschen Membran vor. Das Pferd besitzt die dickste Descemetsche Membran, wohingegen das Schwein die am schwächsten ausgebildete Membran vorweist. Endothelial produziertes Kollagen Typ VIII bildet einen Bestandteil der hexagonalen Gitterstruktur der Descemetschen Membran, wodurch die Elastizität der Hornhaut möglicherweise mitbestimmt wird. Der Nachweis von Elastin ist hingegen im Hornhautgewebe negativ verlaufen. Das einschichtige Hornhautendothel besteht aus Zellen von hexagonaler Form. Es konnte gezeigt werden, dass die Endothelzellen das Membranprotein AQP1 enthalten, das auch in den Keratozyten in tierartlicher Variation exprimiert wird. Hingegen kann das AQP5 ausschließlich im Hornhautepithel identifiziert werden. Durch APQ1 und APQ5 wird der für die Transparenz der Hornhaut wichtige relative Dehydratationszustand aufrecht erhalten. Mit Claudin-1 konnte im Hornhautepithel und -endothel ein tight junctions-bildendes Zellverbindungsprotein markiert werden. Mit Antikörpern gegen p63 sowie PCNA und PHH3 wurde untersucht, wie sich die Hornhaut erneuert. Die Ergebnisse machen deutlich, dass eine Zellerneuerung überwiegend epithelial stattfindet. Limbal befindet sich bei allen untersuchten Tierarten im Stratum basale ein Stammzellreservoir, das bei den Fleischfressern entlang des Hornhautepithels durch einzelne p63-positive Zellen ergänzt wird. Die mittels PCNA und PHH3 dargestellten mitotischen Zellen sind ebenfalls im Stratum basale lokalisiert.

Der Einfluss der Sohlendicke auf die Thermoisolation der Hornkapsel beim Equiden Einleitung Lahmheiten, die nach einem Heißbeschlag auffallen, werden häufig dem Hufschmied zur Last gelegt und mit forensischen Fragestellungen verbunden. Besonders, wenn nach einem Hufbeschlag festgestellt wird, dass das Pferd an Hufrehe erkrankt ist, die nicht unerhebliche Tierarztkosten verursacht und vielfach zu einer dauerhaften Unbrauchbarkeit führt, werden schnell Schadenersatzforderungen an den Hufschmied gestellt. In diesen Fällen ist es vorteilhaft, baldmöglichst nach dem Hufbeschlag und Auftreten der Lahmheit Röntgenbilder anzufertigen, um zeitnah zu prüfen, wie dick die Hufsohle nach dem Beschlag noch war. Ziel dieser Studie war es, die Sohlendicke zu bestimmen, bei der zwischen Lederhaut und Hornkapsel eine Temperaturveränderung messbar wird und ab der sich auch Gewebeschäden an der Sohlenlederhaut einstellen. Material und Methoden: Von 20 Pferden unterschiedlicher Rasse und Größe im Alter zwischen 2 und 17 Jahren wurden jeweils beide Vordergliedmaßen unverzüglich nach der Euthanasie im Karpalgelenk abgesetzt und an den Hufen wurden die beim Hufbeschlag üblichen Bedingungen des Aufbrennens des Eisens simuliert. Begleitend wurde die Temperaturveränderung im Inneren der Hornkapsel mittels eines zwischen dorsaler Hufwand und Lederhaut parallel zum Hufbein eingeführten Thermoelementes gemessen. Das Aufbrennen erfolgte mindestens bis zu dem Zeitpunkt, zu dem das Thermoelement einen signifikanten Anstieg der Temperatur anzeigte. Zwischendurch wurde das Aufbrennen immer wieder gestoppt und die jeweils vorliegende Sohlendicke röntgenologisch dokumentiert. Zusätzlich wurde geprüft, ob der Feuchtigkeitsgehalt des Horns oder die Pigmentierung einen Einfluss auf die Thermoisolierung der Hornkapsel haben und ob durch Kühlung nach dem Aufbrennen ein schnelleres Abkühlen begünstigt wird. 10 Präparate wurden zunächst eingefroren und später nach dem Auftauen für die Temperaturmessungen eingesetzt. Weitere 10 Präparate wurden unmittelbar nach der Euthanasie für den Versuch verwendet. Bei diesen Hufen wurden zusätzlich Proben für histologische Untersuchungen entnommen. Hieraus erfolgte die Erstellung histologischer Schnitte mit 2 verschiedenen Färbungen (Masson-Goldner und Hämatoxilin-Eosin). Des Weiteren wurden unterstützend zu den Temperaturmessungen anhand der Flash - Methode die physikalischen Eigenschaften (Dichte, Wärme- und Temperaturdurchlässigkeit) der Hufkapsel ermittelt. Ergebnisse: Bis zu einer röntgenologisch gemessenen Sohlendicke von über  > 5, 9 mm (s = ± 1,3 mm) war keine Temperaturveränderung im Inneren der Hufkapsel feststellbar. Bei einer Sohlendicke von  = 5,9 mm (s = ± 1,3 mm) stieg die Temperatur dann relativ schnell auf 48°C und auch auf deutlich höhere Temperaturen an. Die Temperatur von 51°C, bei der mit ersten Gewebeschäden zu rechnen ist, wurde erst bei einer Sohlendicke von  < 5,4 mm erreicht. Eine Schädigung des Gewebes (Extravasation, Veränderungen der Struktur bzw. Deformation der Zellen und deren Kerne) zeigte sich bei den histologischen Untersuchungen erst bei einer Sohlendicke von weniger als 4 mm. Der k - Wert von Horn gemessen mit der Flash – Methode betrug ca. 0,2 W / K*m. Das Hufhorn weist somit eine sehr schlechte Wärmeleitfähigkeit auf. Es waren keine signifikanten Unterschiede zwischen der Wärmeleitfähigkeit von pigmentiertem und unpigmentiertem oder feuchtem und trockenem Horn zu verzeichnen. Das Kühlen des Horns mit einem nassen Schwamm nach dem Aufbrennen des Hufeisens beschleunigte das Abkühlen der Temperatur in der Hornkapsel erheblich. Schlussfolgerung und klinische Relevanz: Die bekannten, höchstgradig effektiven thermoisolierenden Eigenschaften der Hornkapsel wurden bestätigt: Erst ab einer Sohlendicke von  < 5,4 mm kann bei übertrieben heißem und langem Aufbrennen überhaupt eine irreversible thermische Schädigung der Lederhaut entstehen. Zudem kann mit einer Wahrscheinlichkeit von 80% ein Temperaturanstieg in der Hornkapsel bei einer Sohlendicke von  ≥ 6,7 mm ausgeschlossen werden. Voraussetzung für die Beurteilung der Sohlendicke nach einem Hufbeschlag mit anschließend festgestellter Lahmheit ist, dass zeitnah nach dem Beschlag und dem Auftreten einer Lahmheit durch eine geeignete Röntgenuntersuchung (orthograder Strahlengang, Markierung der Sohle) die Sohlendicke dokumentiert wird. Dem Hufschmied können mit der Aufnahme eines Röntgenbildes anhand der ermittelten Sohlendicken außerdem Entscheidungen für oder gegen einen Heißbeschlag bei Pferden mit dünner Sohle erleichtert werden. Sollte beim Aufbrennen ein Wegziehen des Hufes den Verdacht auf eine thermische Reizung der Huflederhaut ergeben, ist ein sofortiges Kühlen des Hufes mit kaltem Wasser sinnvoll, um die Zeit der Temperaturerhöhung und damit mögliche Gewebeschäden an der Lederhaut zu minimieren.