Podcasts about epithelzellen

Diagnose Hufkrebs - für viele Besitzer ein Schock. Aber es handelt sich bei der Erkrankung nicht um Krebs im allgemeinen Sinn, sondern um eine Fehlleitung der Epithelzellen im Huf. Was sind die Auslöser für diese Erkrankung, wie unterscheidet sich Hufkrebs von Strahlfäule, wie können Besitzerinnen und Besitzer vorbeugen und wie genau ist die Behandlung von Hufkrebs? Darüber sprechen Prof. Karsten Feige und Prof. Florian Geburek in dieser Folge.

Im Laufe der Evolution und der eigenen körperlichen Entwicklung hat das Immunsystem immer wieder neue Varianten zur Bekämpfung von Krankheitserregern hervorgebracht. Immer, wenn ein mikrobieller Feind unseren Körper bedroht, weiß jedes System in unserem Körper, was es zu tun hat, um die Erreger zu bekämpfen. Da sind zuerst die Bakterien in der Haut oder an den Schleimhäuten die erste Barriere, die ein Eindringling überwinden muss. Wenn es den Eindringlingen jedoch gelingt, weiter einzudringen, z.B. an die Schleimhaut des Verdauungstrakts, z.B. im Mund, Darm oder Magen, sorgen Enzyme des gesunden Systems und Flimmerhärchen und Epithelzellen für einen Abtransport des Feindes. Dieses Zusammenspiel sorgt in unserem Körper für eine erfolgreiche Immunabwehr.

Zur morphologischen und ultrastrukturellen Untersuchung der Leber des Straußes wurden in der vorliegenden Doktorarbeit lichtmikroskopische Färbungen sowie die Elektronenmikroskopie verwendet. Zur genaueren Charakterisierung des Zytoskeletts der einzelnen Leberzellen wurden immunhistochemische Methoden herangezogen. Die Glykohistochemie half bei der Untersuchung der Kohlenhydratstrukturen der verschiedenen Zellen der Leber. Die untersuchten Organe stammten von dreizehn Afrikanischen Straußen (Struthio camelus) im Alter von 15 - 17 Monaten aus kommerzieller Haltung von der Straußenfarm Donaumoos. In meinen Untersuchungen konnte ich keine geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Leber des Straußes feststellen. Überwiegend stimmen meine Befunde über die Straußenleber mit bisher bekannten Berichten über die Lebern bei anderen Vogelarten überein. Die rotbraune Leber liegt im kaudoventralen Teil des Thorax und wird kranial vom Herz sowie kaudal vom Magen begrenzt. Zwei tiefe Einziehungen teilen die Leber in zwei große Lappen. Der rechte, ungeteilte Leberlappen ist mit durchschnittlich 24,8 x 15,6 cm etwas größer als der 23,5 x 12,8 cm große linke Leberlappen. Letzterer wird durch eine kleine Einziehung in einen kranialen und einen kaudalen Abschnitt unterteilt. Auf seiner viszeralen Seite befindet sich ein kleiner zungenförmiger Lappen. Die Leber des Straußes ist mit einem Anteil von 1,8% an der Gesamtkörpermasse im Vergleich zu vielen anderen Vogelarten verhältnismäßig klein. Ich konnte in meinen Untersuchungen keine Unterschiede in der Struktur der einzelnen Leberlappen erkennen. An ihrer Oberfläche ist die Leber von einer bindegewebigen Kapsel bedeckt. Histomorphologisch ist bei der Leber des Straußes weder eine Unterteilung des Parenchyms in Läppchen, noch eine zirkuläre Anordnung der zweischichtigen Leberzellbalken zu erkennen. Die Areae interlobulares mit Venae interlobulares, Arteriae interlobulares sowie Ductus interlobulareis zeigen sich unregelmäßig verteilt im Parenchym liegend. Das Grundgerüst desselben besteht aus parallel zueinander verlaufenden Leberzellbalken 6. Zusammenfassung 166 und Sinusoiden. Die polygonalen Hepatozyten ordnen sich zu einem Kreis aus vier bis acht von ihnen um einen Canaliculus biliferus herum, der keine eigene Zellmembran besitzt. Dadurch lässt sich ihre Oberfläche in drei Abschnitte unterteilen. Einen schmalen biliären, den gegenüberliegenden, breiteren sinusoidalen Abschnitt und die Kontaktfläche zwischen zwei Hepatozyten. Die Hepatozyten des Straußes besitzen einen 5 μm großen Zellkern. Außerdem beinhalten sie diffus verteilt Glykogendepots, die sowohl mittels der PAS-Färbung nachgewiesen, als auch in den elektronenmikroskopischen Bildern als Glykogengranula gefunden werden konnten. Die Verteilung und Ausprägung dieser Depots unterschied sich deutlich zwischen den einzelnen Tieren. Die Wandauskleidung der Sinusoide wurde von Zellfortsätzen der Endothelzellen und den Pseudopodien der von-Kupffer-Zellen gebildet. Im schmalen Dissé Raum fanden sich Ito-Zellen mit bis zu 2 μm großen Lipidtropfen. Mit Hilfe der Immunhistochemie wurden verschiedene Komponenten des Zytoskeletts der Leberzellen untersucht. Dabei konnten in meiner Arbeit Intermediärfilamente (Zytokeratine, Vimentin und Desmin) sowie das Protein α-SMA nachgewiesen werden. Die Zytokeratine waren vor allem in den Gallengangszellen zu finden. Durch die unterschiedliche Verteilung der untersuchten Zytokeratine auf die einzelnen Abschnitte des Gallengangsystems lassen sich diese voneinander abgrenzen. Zytokeratin 8 konnte nur in den biliären Abschnitten der Hepatozyten gefunden werden. Vimentin und Desmin konnten in den Sinusoiden und den Gefäßwänden der Leber nachgewiesen werden. Außerdem zeigten die Epithelzellen der Gallengänge eine positive Reaktion mit dem Desmin-Antikörper. Bei den Untersuchungen in meiner Arbeit mit Methoden der Glykohistochemie konnten Bindungsstellen für ConA, LCA, PSA, PNA, RCA, WGA, WGAs, GSL-1, SBA, PHA-E und PHA-L nachgewiesen werden. Anhand dieser Befunde konnten in den Hepatozyten Zuckerketten mit Glucose-, Mannose-, N-Acetyl-D-Galaktosamin- und Galaktose- Resten differenziert werden. Bei den galleführenden Strukturen konnten Zuckerketten mit N-Acetyl-D-Glukosamin-, N-Acetyl-D-Neuraminsäure- und Oligosaccharid-Resten nachgewiesen werden. Die Zellmembran und das Zytoplasma der Endothelzellen der Arterien zeigen eine geringere Reaktion auf den Nachweis von N-Acetyl-D-Glukosaminund N-Acetyl-D-Neuraminsäure-Glykokonjugaten als die der Venen.

Ziel dieser Arbeit war es, mittels Licht- und Rasterelektronenmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden, die Morphologie der Hornhaut im tierartlichen Vergleich an Hand unserer Haussäugetiere detailliert zu beschreiben. Für die Untersuchungen wurden die Hornhäute von 28 Schweinen, 11 Rindern, 2 Ziegen, 6 Pferden, 4 Hunden und 5 Katzen verwendet. Speziesspezifische Besonderheiten wurden bildlich dokumentiert und zur Verdeutlichung tabellarisch dargestellt. Die Hornhaut unserer Haussäugetiere baut sich aus dem Hornhautepithel, dem Stroma, der Descemetschen Membran und dem Hornhautendothel auf. Eine Bowmansche Membran konnte nicht dargestellt werden. Die Fleischfresser besitzen verglichen mit den Huftieren eine deutlich dünnere Hornhaut. Insbesondere das dreischichtige Epithel (Stratum basale, Stratum intermedium und Stratum superficiale) besteht bei den Fleischfressern aus einer kleineren Anzahl an Zelllagen. Die Cytokeratine 1, 2 und 3, als Bestandteile des Zytoskeletts, konnten immunhistochemisch bei allen untersuchten Tierarten, insbesondere im Stratum superficiale des Hornhautepithels, nachgewiesen werden. Das vom Zentrum aus an Höhe abnehmende Hornhautepithel lässt unter dem Rasterelektronenmikroskop auf der Oberfläche der polygonalen Epithelzellen feine Membranausstülpungen erkennen, die sich beim Fleischfresser in Form von kurzen Microvilli darstellen. Das Pferd, Rind und Schwein weisen längere Microplicae auf, die bei der Ziege einzelne ringförmige Kringel bilden. Eine beim Pferd und bei den Wiederkäuern auch epithelial zu findende Pigmentierung, lässt sich im Stroma tierartenübergreifend im Bereich des Limbus erkennen. Mit Ausnahme des anterioren Bereichs weisen die im Stroma liegenden Keratozyten einen geordneten, parallelen Verlauf auf. Tierartliche Unterschiede liegen in der Ausbildung der Descemetschen Membran vor. Das Pferd besitzt die dickste Descemetsche Membran, wohingegen das Schwein die am schwächsten ausgebildete Membran vorweist. Endothelial produziertes Kollagen Typ VIII bildet einen Bestandteil der hexagonalen Gitterstruktur der Descemetschen Membran, wodurch die Elastizität der Hornhaut möglicherweise mitbestimmt wird. Der Nachweis von Elastin ist hingegen im Hornhautgewebe negativ verlaufen. Das einschichtige Hornhautendothel besteht aus Zellen von hexagonaler Form. Es konnte gezeigt werden, dass die Endothelzellen das Membranprotein AQP1 enthalten, das auch in den Keratozyten in tierartlicher Variation exprimiert wird. Hingegen kann das AQP5 ausschließlich im Hornhautepithel identifiziert werden. Durch APQ1 und APQ5 wird der für die Transparenz der Hornhaut wichtige relative Dehydratationszustand aufrecht erhalten. Mit Claudin-1 konnte im Hornhautepithel und -endothel ein tight junctions-bildendes Zellverbindungsprotein markiert werden. Mit Antikörpern gegen p63 sowie PCNA und PHH3 wurde untersucht, wie sich die Hornhaut erneuert. Die Ergebnisse machen deutlich, dass eine Zellerneuerung überwiegend epithelial stattfindet. Limbal befindet sich bei allen untersuchten Tierarten im Stratum basale ein Stammzellreservoir, das bei den Fleischfressern entlang des Hornhautepithels durch einzelne p63-positive Zellen ergänzt wird. Die mittels PCNA und PHH3 dargestellten mitotischen Zellen sind ebenfalls im Stratum basale lokalisiert.

Die diabetische Nephropathie ist derzeit weltweit der häufigste Grund für die terminale Niereninsuffizienz mit einem Anteil von einem Drittel aller Fälle. Im Verlauf der diabetischen Nephropathie kommt es zu einer zunehmenden Glomerulosklerose. Die Fähigkeit der parietalen Epithelzelle zur Ausbildung von extrazellulärer Matrix und ein möglicher Beitrag zur Glomerulosklerose ist bislang unklar. Daher sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle bei der diabetischen Nephropathie vermehrt extrazelluläre Matrix bildet und dadurch die Bowman’sche Kapsel verdickt. Diese Frage wurde unter Verwendung einer immortalisierten murinen parietalen Epithelzelllinie und einer primären humanen parietalen Epithelzelllinie im Zellversuch und Stimulation dieser Zellen mit hoher Glukosekonzentration (30mM), TGF-β1 und „advanced glycation endproducts“ nachgegangen. Außerdem wurde retrospektiv die Bowman’sche Kapsel von sechs humanen Nierenbiopsien mit diabetischer Nephropathie per Licht- und Transmissionselektronen-mikroskopie untersucht. Im ersten Schritt war die Aktivierung der parietalen Epithelzelle unter diabetischer Kondition Fokus der experimentellen Untersuchung. Hier lag ein zellspezifischer Effekt vor. Während für die humanen parietalen Epithelzellen keine funktionellen oder morphologischen Zeichen der Aktivierung gefunden werden konnte, zeigten murine parietale Epithelzellen eine Aktivierung nach Stimulation mit TGF-β1. Der zweite Schritt bestand in der Untersuchung der Bildung von TGF-β1 in parietalen Epithelzellen. Auch hier konnten unterschiedliche Stimulationseffekte bei den murinen und humanen parietalen Epithelzellen beobachtet werden. Während die humanen parietalen Epithelzellen weder auf Transkriptions-, noch auf Translationsebene eine geänderte Expression zeigten, exprimierten die murinen parietalen Epithelzellen in einem positiven Feedback-Mechanismus auf Transkriptionsebene verstärkt TGF-β1 nach Stimulation mit TGF-β1. Auf Translationsebene konnte eine verstärkte Bildung von TGF-β1 nach Stimulation mit „advanced glycation endproducts“ und eine verminderte Bildung nach Stimulation mit Glukose beobachtet werden. Der dritte Schritt beinhaltete die Untersuchung der Kollagenbildung in den parietalen Epithelzellen und die Vermessung der Bowman’schen Kapsel. Während Glukose in keiner der Zelltypen zu einer Änderung der Kollagengenexpression führte, induzierte TGF-β1 in den humanen und murinen parietalen Epithelzellen eine Hochregulation der Genexpression verschiedener Ketten von Kollagen IV und Kollagen I α 1. „Advanced glycation endproducts“ verstärkten die Transkription der Kollagene in den humanen parietalen Epithelzellen, wohingegen sie diese in murinen parietalen Epithelzellen herunterregulierten. In der retrospektiven histologischen Untersuchung von sechs Patienten mit diabetischer Nephropathie und sechs Vergleichspatienten wurde per Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie die Dicke der Bowman’schen Kapsel vermessen. In den lichtmikroskopischen Messungen zeigte sich für die Patienten mit diabetischer Nephropathie eine signifikant verdickte Bowman’schen Kapsel. Diese Verdickung konnte bei Patienten mit diabetischer Nephropathie in den transmissionselektronenmikroskopischen Messungen bestätigt werden. Letztlich ist die Lichtmikroskopie die geeignetere Messmethode, weil hier eine höhere Anzahl an Glomeruli gemessen werden kann und sie einen Selektionsbias ausschließt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle unter diabetischer Kondition verstärkt extrazelluläre Matrix bildet und diese basal ablagert. In den murinen parietalen Epithelzellen ergaben sich Hinweise auf den Mechanismus der Aktivierung und einen positiven Feedbackmechanismus von TGF-β1 bei der diabetischen Nephropathie. Die Verdickung der Bowman’schen Kapsel ist von klinischer und diagnostischer Bedeutung, da die Ausbildung der parietalen Fibrose viele Funktionen der parietalen Epithelzellen und Bowman’schen Kapsel einschränkt und der Glomerulus letztlich sklerosiert bzw. verödet. Diagnostisch werden künftige Studien den Wert der Dickenmessung der Bowman’schen Kapsel als zusätzliches pathologisches Kriterium der Stadieneinteilung der diabetischen Nephropathie zeigen.

ABCA3 ist als Phospholipidtransporter der ABC-Transporterfamilie wesentlich an der Synthese von Lungensurfactant beteiligt. Diese wichtige Rolle von ABCA3 in der Lunge ist mittlerweile bekannt und wird weiterhin näher erforscht. Des Weiteren wird ABCA3 auch in anderen Geweben exprimiert, darunter Leber, Niere, Gehirn [Stahlman et al. 2007]. ABCA3 wurde daneben auch in humanem Milchdrüsengewebe entdeckt und stellt in Mammakarzinomen einen Marker für eine gute Prognose dar [Schimanski 2010]. In der murinen Milchdrüse ist die Abca3-Expression molekularbiologisch auf Ebene der mRNA nachgewiesen worden [Hammel 2007]. Des Weiteren ist ABCA3 in immunhistochemischen Färbungen von humaner und muriner Milch darstellbar. Dort ist es auf der Außenseite der Milchfetttröpfchen-Membran lokalisiert [bislang nicht veröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe]. Milchfetttröpfchen werden in Milchdrüsen-Epithelzellen gebildet, indem Lipidtransporter (unter anderem ABC-Transporter der ABCA-Subklasse wie ABCA1 oder ABCA7) Lipide importieren. In der Milchdrüse ist über den Mechanismus, mit dem ABCA3 an der Milchsekretion beteiligt sein könnte, nicht viel bekannt. Es kann aber analog zu der Rolle in der Lunge davon ausgegangen werden, dass ABCA3 auch in der Milchdrüse Phospholipide transportiert. Phospholipide verfügen über wichtige Eigenschaften in der Milch als Emulgatoren und als protektive Faktoren für das Neugeborene. Es ist nachgewiesen, dass ein Einschnitt in der Phospholipid-Sekretion und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide in der Milch zu nachteiligen Auswirkungen auf das Neugeborene führen [Isaacs 2005]. Es stellt sich die Frage, ob und inwieweit ABCA3 in der Brustdrüse an der Milchbildung und – sekretion beteiligt ist. Dazu wurde ein Mausmodell mit spezifischer Deletion des ABCA3 Gens in der Milchdrüse generiert. Eine Mauslinie mit Cre-Expression unter dem während der Laktation spezifisch im Mammagewebe aktiven Lactoglobulin-Promotor wurde mit einer Mauslinie gekreuzt, welche im ABCA3-Gen LoxP Stellen enthielt. Es kommt zur Cre-getriggerten Deletion von ABCA3 im Mammagewebe. Das andere Allel wurde durch Einkreuzen einer klassischen Knockout-Linie gänzlich inaktiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Zur quantitativen Bestimmung der Expression von Abca3 im Mammagewebe wurde die Methode der quantitativen RT-PCR angewendet. Der Melkvorgang erfolgte mittels einer eigens konzipierten Melkvorrichtung. Diese beinhaltet eine Flüssigkeitsfalle, wodurch ein besseres Handling beim Melkvorgang erreicht wurde. So konnte unter anderem eine höhere Milchmenge pro Maus gewonnen werden mit weniger technisch bedingten Schwankungen. Die Milchproben an Tag 5, 10 und 15 der Laktation wurden massenspektrometrisch auf den Gehalt der einzelnen Phospholipide analysiert. Es ergab sich eine Reduktion des Abca3-Gens im Milchdrüsengewebe der gefloxten Mäuse von 95% im Vergleich zum Wildtyp. Die Analyse der Phospholipide zeigte eine Verminderung von Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin, während innerhalb der Phosphatidylcholin-Spezies kurzkettige Moleküle (PC30:0, PC32:0) signifikant vermindert waren. Die Milchmenge der ABCA3 defizienten Linie an Tag 15 der Laktation war signifikant vermindert im Vergleich zur Wildtyp Gruppe (p = 0,005). Der Nachweis von ABCA3 in Milchfetttröpfchen und die Verminderung der Milchmenge bei dessen Fehlen weist auf eine Rolle dieses Transporters für die Milchsekretion hin. Da Phospholipide nur einen geringen Anteil der Milchfette darstellen, aber vor allem in der Membran der Milchfetttröpfchen enthalten sind, könnte ABCA3 möglicherweise durch Bereitstellung von Phospholipiden für die Bildung der Membran von Milchfetttröpfchen an der Milchbildung beteiligt sein. Am Höhepunkt der Laktation kann das Phospholipid-Defizit in den Milchfetttröpfchen nicht meht kompensiert werden und die Milchmenge nimmt durch die verminderte Bildung von Milchfetttröpfchen signifikant ab. Dabei ändert sich die Gesamtzusammensetzung der Milch nur unbedeutend, da jeweils das gesamte Organell „Milchfetttröpfchen“ mitsamt Inhalt fehlt. Dies muss im Rahmen dieser Studie allerdings hypothetisch bleiben.

Epithelzellen, die Modell-Zelllinien dieser Dissertation, sind für die Aufteilung und Abtrennung verschiedener Kompartimente eines Organismus zuständig, indem sie sich zu Grenzflächen zusammenschliessen, welche häufig hohen physikalischen Spannungen und Kräften ausgesetzt sind. Um diese physikalischen Kräfte zu verarbeiten oder sie selbst zu produzieren, verwenden Epithelzellen, wie alle anderen Zelltypen auch, das Zytoskelett, das sich im Allgemeinen aus den Komponenten Mikrotubuli, Intermediär-Filamenten und Aktin sowie den damit korrespondierenden Motorproteinen Dynein, Kinesin sowie Myosin zusammensetzt. In dieser Dissertation wird das Zusammenspiel von Aktin und Myosin auf der apikalen Seite von Epithelzellen untersucht. Im Falle von konfluenten Zellen mit vollständig ausgebildeten Zell-Zell-Kontakten sind auf der apikalen Seite der Zellen Mikrovilli zu finden, kleine, mit Aktin-Bündeln gefüllte Ausstülpungen aus der Zelloberfläche, welche für die optimierte Nahrungsaufnahme sowie als Antennen für Signalverarbeitung zuständig sind. Im Zuge der Arbeit konnten wir feststellen, dass sich der Aktin-Myosin-Aufbau auf der apikalen Seite von Einzelzellen ohne Zell-Zell-Kontakte, sogenannten nicht-konfluenten Zellen, grundsätzlich ändert. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und anderen experimentellen Methoden zeigen wir, dass zwar ähnliche Ausstülpungen auf der apikalen Oberfläche von Einzelzellen zu finden, diese jedoch häufig verlängert, gebogen, hoch-dynamisch und oft parallel zur Zellmembran orientiert sind. Wir zeigen mittels molekularbiologischer Methoden, dass ein zusätzliches, innerhalb der apikalen Zellmembran liegendes isotropes Akto-Myosin-Netzwerk für die dynamische Reorganisation der Mikrovilli-Ausstülpungen verantwortlich ist. Der Identifzierung des isotropen Akto-Myosin-Netzwerkes, welches eine der Hauptaussagen dieser Dissertation ist, wird eine detaillierte Analyse der dynamischen Netzwerkreorganisation angefügt, die mittels temporaler und örtlicher Bild-Korrelationsanalysen charakteristische Zeiten und Längen der Dynamik definiert. Des Weiteren entwickeln wir mehrere Bild- Analyseverfahren, allen voran die Methode der iterativen temporalen Bildkorellation sowie des optischen Flusses, wodurch wir eine Oszillation der Netzwerk-Reorganisationsgeschwindigkeit identifizieren und parametrisieren können. Verschiedene, auf Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter optischer Fluss-Bildanalyse basierende Experimente geben Hinweise auf zwei mögliche Erklärungen für die identifizierten Oszillationen. Sowohl Myosin aktivitätsregulierende Proteine als auch spontan auftretende Spannungsfluktuationen im unter Zugspannung liegenden Netzwerk können mögliche Ursachen für die identifizierten Netzwerkoszillationen sein. Obwohl eine eindeutige zelluläre Funktion des apikalen Akto-Myosin-Netzwerkes im Rahmen dieser Doktorarbeit noch nicht identifiziert werden konnte, so können wir aufgrund von verschiedenen Resultaten dennoch postulieren, dass das hier identifizierte Netzwerk eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration und Signaltransduktion einnimmt. Unabhängig davon repräsentiert das hier gefundene Netzwerk die faszinierende Möglichkeit, ein aktives, zweidimensionales Akto-Myosin-Netzwerk nicht nur in vitro, sondern in seiner natürlichen Umgebung studieren und biophysikalische Eigenschaften analysieren zu können.

Obwohl die immunstimulatorischen Effekte viraler Nukleinsäursen, wie auch IFN -α und IFN-β, während Virusinfektionen eine wichtige Rolle spielen, ist wenig über ihre Funktion bei viraler Glomerulonephritis, wie beispielsweise HIV Nephropathie, bekannt. Virusinfektionen aktivieren, vor allem mittels IFN-α und IFN-β Produktion eine systemische antivirale Immunantwort. Es wurde gezeigt, dass diese inflammatorischen Zytokine einen pleiotropen immunmodulatorischen Effekt auf renale Mesangialzellen ausüben, was direkt zu glomerulären Krankheiten führt. Aber es ist bisher nicht bekannt, ob die viralen Nukleinsäuren und Typ I IFN einen Effekt auf die glomerulären Epithelzellen haben. (z.B. Podozyten und PECs). Um den Effekt von Nukleinsäuren auf Podozyten und PECs zu erforschen, stimulierten wir diese Zellen mit synthetischen dsDNA-(poly-dAdT) Komplexen mit lipofectamine, um eine virale Infektion zu imitieren. Wir haben herausgefunden, dass dsDNA stetig viele IFN-stimulierte Gene in Podozyten und PECs induziert. Desweitern haben wir herausgefunden, dass dsDNA die PECs Proliferation mindert und die CD24+/CD133+PECs Differenzierung zu ausgereiften Podozyten inhibiert. Um unsere Hypothese, dass deis aufgrund von der Sekretion von IFN-α und IFN-β passiert ist, zu bestätigen, haben wir den Effekt von diesen anitviralen Zytokinen auf PECs- und Podozyten-Homöostase etabliert. Wir haben herausgefunden, dass beide IFNs stetig Podozyten und PECs dazu anregen, stetig mehrere IFN-stimulierte Gene zu exprimieren. Trotzdem hat nur IFN-β das Podozytensterben induziert und die Permeabilität der Podozyten-Monolayer erhöht. In der Adriamycin-induzierter Nephropathie bei SCID Mäusen haben Injektionen mit IFN-α oder IFN-β die Proteinurie, den Makrophagen Influx und die Glomerulosklerose verstärkt. Trotzdem induziert nur IFN-β das mitotische Podozytensterben (katastrophale Mitose), welches zu einer reduzierten Podozytenanzahl führt. Wir haben führt, dass IFN-α einen Zellzyklusarrest in-vivo bei PECs induziert, der zur glomerulären Schädigung führt. Balb/c Mäuse, die Adriamycin gespritzt bekommen haben und täglich mit IFN-α und IFN-β behandelt wurden zeigten einen aggravierten Phänotyp mit vermehrter Proteinurie. Im Gegensatz zu dem, was an Studien in SCID Mausen gezeigt wurde, war der Effekt auf die Proteinurie nach IFN-α Behandlung prominenter bei Balb/c Mäusen, verglichen mit IFN-β. Deshalb haben Typ I IFNs einen deutlichen Effekt auf Podozyten und Parietalzellen. Zusammen fördern die Typ I IFNs die Glomerulosklerose durch verstärkten Untergang der Podozyten sowie durch Unterdrückung ihrer Regeneration aus Vorläuferzellen.

Meine Arbeit befasst sich mit der histologischen, histochemischen und elektronenmikroskopischen Analyse des Eileiters des Straußes (Struthio camelus). Als Untersuchungsmaterial dienten die Eileiter von acht geschlechtsreifen und zwei nicht geschlechtsreifen Blauhals-Schwarzhals-Hybriden aus der Straußenfarm Donaumoos in Leipheim. Die Histomorphologie wurde mittels konventioneller Färbungen (H.E.-Färbung, van Gieson-Resorcinfuchsin-Färbung, Trichromfärbung nach Masson und Goldner, Alcianblau 8GX-Färbung, Perjodsäure-Schiff-Reaktion) dargestellt. Glykohistochemisch wurden durch den Einsatz von Lektinen die Kohlenhydratstrukturen untersucht. Mittels immunhistochemischer Techniken wurde das Zytoskelett sowie die Verteilung von Östrogen- und Progesteronrezeptoren im Straußeneileiter studiert. Unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops konnte die Ultrastruktur ermittelt werden. Der Eileiter kann in die fünf Abschnitte Infundibulum, Magnum, Isthmus, Uterus und Vagina unterteilt werden. Das Epithel der untersuchten Tiere war im gesamten Eileiter ein mehrreihiges, hochprismatisches Epithel, welches sich aus Zilienzellen und sekretorischen Zellen zusammensetzt. In der Lamina propria mucosae finden sich charakteristische Drüsen im kaudalen Infundibulum, Magnum, Isthmus, Uterus und im uterovaginalen Übergangsbereich. Die Alcianblau-Färbung zeigt sich für pH 2,5 und pH 1,0 positiv im Oberflächenepithel des Infundibulums und Magnums der geschlechtsreifen Strauße und im Oberflächenepithel von Uterus und Vagina sowohl der adulten als auch der juvenilen Tiere. In der Vagina sind es vorrangig die Epithelzellen am Boden von Schleimhauteinstülpungen, die Alcianblau-positiv erscheinen. Die PAS-Reaktion fällt bei den adulten Straußen im Epithel des Infundibulums, und in Epithel und Drüsen sowohl des Magnums als auch des Isthmus positiv aus. Geschlechtsreife und nicht geschlechtsreife Laufvögel weisen eine positive PAS-Reaktion im Oberflächenepithel von Uterus und Vagina auf. Durch die Trichromfärbung konnten Mukosubstanzen zum einen im Epithel des tubulären Infundibulums und des Uterus, zum anderen in den Magnum- und Isthmusdrüsen der adulten Tiere festgestellt werden. Das Vaginalepithel zeigt sich bei geschlechtsreifen und nicht geschlechtsreifen Tieren positiv für Mukosubstanzen. Mittels glykohistochemischer Untersuchungen wurden die Zuckerstrukturen auf den Zellen des Eileiters nachgewiesen. Es wurden sowohl FITC-konjugierte als auch biotinylierte Lektine verwendet. Für die Durchführung der Analysen mit FITC-konjugierten Lektinen kamen Canavalia ensiformis Agglutinin (ConA), Pisum sativum Agglutinin (PSA), Lens culinaris Agglutinin (LCA), Ricinus communis Agglutinin (RCA), Peanut Agglutinin (PNA), Griffonia simplicifolia Lektin I (GSL-I), Dolichos biflorus Agglutinin (DBA), Soybean Agglutinin (SBA), Wheat germ Agglutinin (WGA), succinyliertes Wheat germ Agglutinin (WGAs), Ulex europaeus Agglutinin I (UEA-I), Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (PHA-E) und Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (PHA-L) zum Einsatz. Als biotinylierte Lektine wurden Viscum album Agglutinin (VAA), Sophora japonica Agglutinin (SJA), Sambucus nigra Agglutinin (SNA), und Maackia amurensis Agglutinin I (MAA-I) verwendet. Im Eileiter des Straußes konnte die Bindung von ConA, LCA, PSA, VAA, SJA, SNA, WGA, WGAs, MAA-I, PHA-E und PHA-L festgestellt werden. Lediglich schwach binden RCA und DBA. Keine Bindung konnte für die Lektine PNA, GSL-I, SBA und UEA-I ermittelt werden. Anhand immunhistochemischer Methoden wurden zytoskelettale Elemente sowie Hormonrezeptoren im Eileiter des Straußes untersucht. Hierbei wurde mittels spezifischer Antikörper die Lokalisation von Tubulin, Vimentin, Panzytokeratin, Zytokeratin (CK) 5, CK 14, CK 18, CK 19, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), non-muscle myosin (NMM), Östrogenrezeptor alpha (ER-α) und Progesteronrezeptor (PR) bestimmt. CK 19 konnte hierbei lediglich im Vaginalepithel festgestellt werden. ER-α zeigt sich ausschließlich in den Uterindrüsen der geschlechtsreifen Strauße immunpositiv. Für CK 7 und CK 8 konnten keine immunpositiven Strukturen im Eileiter ermittelt werden.

Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die histochemischen und ultrastrukturellen Eigenschaften der Leber des Rindes mit modernen morphologischen Methoden näher zu untersuchen. Dabei sollte zugleich festgestellt werden, ob und in wie weit sich diese zwischen den einzelnen Leberlappen (Lobi hepatici) unterscheiden. Das Untersuchungsmaterial stammte von, als frei von pathologischen Befunden beurteilten Lebern frisch geschlachteter Rinder. Daraus wurden Präparate für konventionell lichtmikroskopische, immun- und glykohistochemische sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen hergestellt. Als Grundlage für die konventionell lichtmikroskopischen Studien dienten Hämatoxylin-Eosin-, Masson-Goldner, Alcianblau 8GX- sowie PAS-gefärbte Schnitte. Bei den immunhistochemischen Analysen wurde der Nachweis von Zytokeratin 5, 8, 14, 18 und 19 sowie von Vimentin verfolgt. Bei den glykohistochemischen Untersuchungen kamen 14 verschiedene Lektine pflanzlicher Herkunft, deren Bindungsverhalten im Lebergewebe fluoreszenzmikroskopisch erfasst wurde zum Einsatz. Die ultrastrukturelle Analyse des Lebergewebes erfolgte transmissionselektronenmikroskopisch. Die Auswertung begann mit der konventionellen Lichtmikroskopie. Bereits die Analyse der HE-gefärbten Schnitte legte nahe, dass sich die Lobi hepatici mikroanatomisch nicht unterscheiden, was sich im Zuge der weiteren Analysen bestätigte. Die Färbung mit Alcianblau 8GX zeigte zudem zum einen das Vorkommen von Mastzellen im Bindegewebe der Rinderleber an und deutete zum anderen auf die Synthese und Sekretion von sauren Mucopolysacchariden, durch die insbesondere am Beginn des extralobulären Teils des Gallengangssystems gelegenen Epithelzellen hin. In der mit und ohne Amylasevorbehandlung durchgeführten PAS-Reaktion erwiesen sich darüber hinaus die Läppchenzentren als die Speicher des Leberglykogens, wobei deren Umfang in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation großen Schwankungen unterlag. Im Zuge der immunhistochemischen Studien konnte Zytokeratin 5 überhaupt nicht, und die Zytokeratine 8, 14, 18 und 19 nur in den Gallengangsepithelzellen nachgewiesen werden, wobei die einzelnen Zytokeratine nicht in allen Bereichen des Gallengangssystems, sondern nur in ganz bestimmten, für das jeweilige Zytokeratin individuell spezifischen Abschnitten deutlich in Erscheinung traten. Dieses Zytokeratin-Nachweismuster erlaubte unter Einbeziehung anatomischer, topographischer und morphologischer Gesichtspunkte eine Gliederung des Gallengangssystems in die überwiegend CK 8-positiven, zentralen Ductuli biliferi, die hauptsächlich CK 14-positiven, peripheren Ductuli biliferi sowie die, für die Verbindung zwischen dem intra- und extralobuären Teil des Gallengangssystems verantwortlichen, primär CK 18-positiven Ductus interlobulares biliferi kleinerer bis mittlerer Größe, und die von CK 19 dominierten Ductus interlobulares biliferi besonders großen Durchmessers. Diese sich unter Berücksichtigung des Zytokeratin-Nachweismusters ergebende Gliederung des intrahepatischen Gallengangssystems, spiegelte, mit Blick auf die Eigenschaften der einzelnen Zytokeratine, zugleich auch die embryologische Entwicklung des lichtmikroskopisch sichtbaren Teils des Gallenganssystems, beginnend mit den zentralen Ductuli biliferi bis hin zu den größten, am weitesten entwickelten Ductus interlobulares biliferi wieder. Das Auftreten der normalerweise außer für Basalzellen mehrschichtiger Epithelien nur noch für Zellarten mit mindestens bipotentem Potential typischen CK-14- Expression in den einschichtigen Gallengangsepithelien, ließ vermuten, dass auch die bovinen Gallengangsepithelzellen wenigstens zu einem gewissen Grad über bipotentes Potential verfügen. Vimentin war im gesamten Bindegewebe sowie im Endothel aller Blutgefäße nachweisbar. Im Rahmen der glykohistochemischen Untersuchungen zeigten das Endothel, insbesondere der Arterien und Sinusoide, im Vergleich zu den übrigen Strukturen des Lebergewebes den stärksten Besatz mit verschiedenartig gestalteten Glykanen. Dies war angesichts der zahlreichen Funktionen der Endothelzellen, wie etwa Aufrechterhaltung der Gewebestabilität, Mitwirkung an immunologischen Prozessen, Schaffung eines Gleichgewichtszustands zwischen Koagulation und Antikoagulation sowie Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe, deren Erfüllung nur aufgrund der umfangreichen Glykokalix möglich ist, nicht überraschend. Darüber hinaus wurde eindeutig ersichtlich, dass die Zuckerketten der arteriellen, venösen und sinusoidalen Endothelzellen jeweils ganz individuell spezifische, sich von denen der anderen Gefäßarten gänzlich unterscheidende Glykane tragen, was sich darauf zurückführen ließ, dass die verschiedenen Gefäßarten verschiedene Aufgaben bevorzugt wahrnehmen. Neben den Endothelzellen stellten sich auch die Hepatozyten als Träger von verhältnismäßig vielen, verschiedenartig gestalteten Glykane dar, wobei sich deren Präsenz nicht nur auf die Glykokalix beschränkte, sondern sie auch im Golgi-Apparat, sowie im Zytoplasma selbst nachgewiesen werden konnten. Im letzten Fall bestand der Verdacht, dass es sich aufgrund des, durch die rein auf Con A begrenzte Bindungsaffinität angezeigten, hohen Mannosereichtums der Kohlenhydratstrukturen um die Glykane von lysosomalen Enzymen und von, vom Hepatozyten synthetisierten und zur Sekretion vorgesehenen Glykoproteinen und -lipiden handelte. Bei den Gallengangsepithelzellen als weiterer Zellart, die über relativ zahlreiche, verschiedenartig strukturierte Glykane verfügt, traten diese ebenfalls nicht nur als Bestandteil der Glykokalix, sondern auch im Zytoplasma in Erscheinung. Die im Zytoplasma beobachteten, ebenfalls nur Con A-positiven und damit stark Mannose reichen Glykane ließen vermuten, dass auch die Gallengangsepithelzellen neben lysosomalen Enzymen zum Export vorgesehene Makromoleküle produzieren. Als derartige Makromoleküle kamen die bereits in der Färbung mit Alcianblau 8GX nachgewiesenen, sauren Mucopolysaccaride in Betracht. Sie könnten als Gallebeimengung ähnlich wie Phospholipide die Löslichkeit des zur Kristallisation neigenden Cholesterols erhöhen. Die, mit der Größenzunahme der Gallengänge korrelierende, zunehmende Reaktionsfreudigkeit der Epitheloberfläche implizierte eine, mit dem Übergang vom iso- zum hochprismatischen Epithel einhergehende, durch den Einbau weiterer Kohlenhydratmoleküle gekennzeichnete Weiterdifferenzierung der epithelialen Glykokalix. Sie dürfte durch Rezeptor-Liganden spezifische Erkennung zur Reabsorption vorgesehener Stoffe wesentlich an der, insbesondere im Anfangsteil des Gallengangssystems stattfindenden Modifikation der Primär- zur Sekundärgalle beteiligt sein. Bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen, deren Schwerpunkt auf die Parenchymzellen sowie den Disse Raum gelegt wurde, stand der Speziesvergleich im Vordergrund. Dabei zeichnete sich die Leber des Rindes durch Hepatozyten mit sehr spärlichem Mikrovillibesatz, Endothelzellen mit besonders kräftigen, trabekulären von einer kontinuierlichen Basalmembran unterlagerten Fortsätzen, Ito-Zellen mit ebenfalls sehr starken Ausläufern und wenigen, aber sehr großen Fettropfen sowie einem, von Kollagenfibrillen und Mikrofilamenten nahezu völlig freien, Disse Raum aus.

Neben den anerkannten Risikofaktoren Alkohol und Rauchen gewinnt die individuelle Suszeptibilität, als zusätzlicher Risikofaktor für die Entwicklung von Kopf-Hals-Tumoren zunehmend an Bedeutung. Eine genetische Disposition zur DNA-Instabilität oder präformierte Defizite im Bereiche der DNA-Reparaturmechanismen begünstigen das Auftreten und die Persistenz kritischer Mutationen. Durch diese „endogenen“ Risikofaktoren wird eine Tumorenstehung begünstigt, so dass manche Personen, bei gleicher Expositionsstärke und -dauer gegenüber exogenen kanzerogenen Einflüssen, leichter ein Karzinom entwickeln, als andere. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob Unterschiede in der Mutagensensitivität und/oder der DNA-Reparaturkapazität zwischen einer Versuchsgruppe aus Patienten mit einem Karzinom des oberen Aerodigestivtraktes und einer gesunden Probantengruppe feststellbar sind. Die beiden Gruppen wurden nach Geschlecht, Alter, Tabak- und Alkoholkonsum abgeglichen. Das Kollektiv der Karzinompatienten umfasste 20 Personen, die an einem oropharyngealen Karzinom erkrankt waren. Der Kontrollgruppe gehörten ebenfalls 20 Personen an, die jedoch alle frei von einem Tumorleiden waren. Perioperativ wurden zur Testung jeweils 20 Schleimhautproben gewonnen. an Lymphozyten standen aus beiden Gruppen jeweils 15 Proben zur Verfügung. Die anerkannt karzinogenen Inhaltsstoffe des Tabakrauchs Benzo[a]pyren, BPDE, NDEA, NNN, NNK, NDEA wurden als Testsubstanzen verwendet, um Schäden an der DNA zu induzieren. MNNG und die Lösungssubstanz DMSO dienten als Positiv- und Negativkontrolle. Schleimhautzellen und Lymphozyten wurden jeweils für 60 Minuten mit den genannten Fremdstoffen inkubiert. Der Reparaturversuch wurde ausschließlich mit NDEA durchgeführt. Nach Auswaschung des Fremdstoffes wurde den Schleimhautzellen 15 und 30 Minuten und den Lymphozyten 15, 30 und 60 Minuten Zeit zur Reparatur entstandener DNA-Schäden gewährt. Zur quantitativen Darstellung der fremdstoffinduzierten DNA-Schädigungen und Reparaturleistung wurde der Comet Assay benutzt. Alle getesteten Substanzen zeigten im Vergleich zur Kontrollsubstanz DMSO ein signifikantes Schädigungsniveau. Die Ergebnisse der Versuche zur Mutagensensitivität zeigten eine signifikant höhere Schädigung der Schleimhautzellen der Tumorgruppe durch NNN. In den weiteren Versuchen zur Mutagensensitivität konnte durch keine weitere Substanz, weder in Schleimhautzellen, noch in Lymphozyten, eine Schädigung ausgelöst werden, die einen signifikanten Unterschied zwischen Tumor- und Kontrollgruppe aufzeigt. Für Schleimhautzellen und Lymphozyten konnte ein Ansteigen der DRC im zeitlichen Verlauf von 0 bis 30, bzw. 0 bis 60 Minuten erfasst werden. Ein signifikanter Unterschied zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe bestand nicht. Alle benutzen Testsubstanzen verursachen nachweisbare DNA-Schäden in unterschiedlicher Stärke und Homogenität. Sowohl in Lymphozyten, als auch Epithelzellen fand unter den eingesetzten In-vitro-Bedingungen eine zeitabhängige zunehmende Reparatur der geschädigten DNA statt. In der statistischen Auswertung der Ergebnisse konnte ausschließlich für das Agens NNN (p = 0,04) eine erhöhte Sensitivität der Schleimhautzellen von Karzinompatienten nachgewiesen werden. Zur Bestätigung dieses Ergebnisses müssen weitere Versuche folgen. Insgesamt ließ sich die Hypothese einer unterschiedlichen Mutagensensitivität und DNA-Reparaturkapazität beim Vergleich von Patienten mit einem Karzinom des Kopf-Hals-Bereiches und in der Population der vorliegenden Arbeit nicht bestätigen.

Unter in vivo Bedingungen kann es in Zellen, die shear stress ausgesetzt sind (wie z.B. Endothel und Epithelzellen) ständig zu Rupturen der Plasmamembran kommen. Das sogenannte Membrane Resealing stellt die Fähigkeit von Zellen dar, auf eine solche Schädigung zu reagieren und die Membranintegrität durch schnelle Fusionsprozesse intrazellulärer Vesikel an Verletzungsstellen wiederherzustellen. Vielfach belegt ist hierbei die Beteiligung lysosomaler Vesikel sowie Enlargeosomen. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine Beteiligung ER-generierter Vesikel an diesen Reparaturprozessen der Zellmembran nachgewiesen werden. In verschiedenen experimentellen Ansätzen wurde eine Translokation von ER-Membranen an die geschädigten Areale der Zellmembran gezeigt. Eine Fusion der ER-Membranen mit der Zellmembran wurde durch den Nachweis luminaler Domänen transmembranöser ER-Proteine (CNX) sowie luminaler (löslicher) ER-Proteine (ERp57) an den Verletzungsstellen von Axonen des Rückenmarkes in vivo bestätigt. Durch die Blockade der am ERES freigesetzten COPII-Vesikel (Sar1) wurde der frühe sekretorische Transportweg vom ER zum Cis-Golgi-Netzwerk unterbunden. Damit einhergehend kam es zu einem verminderten Resealing der geschädigten Areale in der Zellmembran. Die Ergebnisse zeigen, dass die schnelle Freisetzung von ER-Vesikeln nach mechanischer Verletzung bzw. Schädigung der Plasmamembran durch bakterielle Toxine entscheidend an der Reparatur und Regenerierung geschädigter Zellen beteiligt ist. Nach mechanischer Schädigung kommt es auch zur Freisetzung von exozytotischen Vesikeln, sogenannten Mikropartikeln (MP), in den extrazellulären Raum. Bisher ist weitgehend unbekannt, wie die Homöostase der externalisierten MP koordiniert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde unter in vitro- und in vivo-Bedingungen gezeigt, dass die extrazelluläre Konzentration der MP über die Clearance mittels verschiedener Endozytose-/Phagozytoseprozesse reguliert wird. An der Internalisierung dieser Vesikel ist der Class B Scavenger-Rezeptor CD36 beteiligt. Eine Blockade dieses Rezeptors in vitro zeigte eine deutliche Reduktion der Aufnahme von MP in phagozytosefähige Zellen. In vivo konnte eine CD36-abhängige Reduktion der MP-Aufnahme in verschiedenen Organen (vor allem Niere, Milz) in CD36-defizienten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden unter in vitro-Bedingungen Unterschiede bei der Internalisierung normaler und karzinomatöser MP nachgewiesen. Im Gegensatz zur zellulären Aufnahme von MP aus nicht-transformierten Zellen, wurden MP aus karzinomatösen Zellen nicht über Endozytose/Phagozytose internalisiert. Hingegen kam es hierbei zu einer Fusion von karzinomatösen MP mit der Membran der Akzeptorzelle, einem Mechanismus, der an der Transformation normaler Zellen in karzinomatöse Zellen beteiligt sein könnte. Insgesamt gesehen wurde hierdurch gezeigt, dass MP über Endozytose/Phagozytose in Zellen internalisiert werden, und dass dies organspezifisch über den Scavenger Rezeptor CD36 vermittelt wird.

In der vorliegenden Arbeit wurden A549 Zellen, als Modell für Epithelzellen der Lunge, mittels nicht-viralen Gentransfers mit pDNA bzw. mRNA kodierend für das sekretorische Protein mSEAP transfiziert. Die höchste Transgen-Expression konnte durch den mRNA-vermittelten Gentransfer erreicht werden, unabhängig von dem verwendeten Genvektor. Die Messung der Aktivität von mSEAP im Medium nach mRNA Transfektion mit Liposomen ergab eine Konzentration von maximal 1 ng/50 µl nach 24h, 5 ng/50 µl nach 48h und 7,5 ng/50 µl nach 72h. Für die pDNA Transfektion ergaben sich Konzentrationen für mSEAP von 400 pg/50µl nach 24 h, 700 pg/50 µl nach 48 h und 800pg/50 µl nach 72 h. Es konnte gezeigt werden, dass es bei der Verwendung von mRNA - vor allem nach Transfektion mit dem kationischen Lipid DMRIE-C - zu einer 9-fachen Steigerung der Proteinsekretion in das Medium der kultivierten Zellen kommt. Weiterhin waren ca. 45% der Zellen bei Verwendung von Lipoplexen mit DMRIE-C/mRNA im Gegensatz zu 15% nach Transfektion von pDNA positiv für mSEAP. Nach Transfektion der mRNA mit dem kationische Polymer b-PEI konnten Konzentrationen von mSEAP im Medium von 10pg, 15pg und 50pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h gemessen werden. Für die Magnetofektion von mRNA ergeben sich Mengen von ca. 150pg, 250pg und 400pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h. Dies entspricht im Vergleich zur Verwendung von pDNA einer 3,3-fachen Steigerung nach Transfektion von mRNA/b-PEI Komplexen, mit der Methode der Magnetofektion einer 4-fachen Steigerung der Proteinexpression. Die erhöhte Proteinexpression kann auf die intrazelluläre Barriere des nukleären Imports von pDNA, welche bei der Verwendung von mRNA nicht notwendig ist, zurückgeführt werden. Die Unterschiede des endosomalen „Escape“ - und dem daraus resultierenden Verhältnis freier mRNA zu komplexierter mRNA im Zytoplasma - könnte eine Erklärung für die geringere Effizienz von Polyethyleniminen im Vergleich zu kationischen Lipiden bei dem Transfer von mRNA sein. Weiterhin konnte mit diesem Modell gezeigt werden, dass humane alveolare Epithelzellen des Adenokarzinoms (A549) - als Modell für humane Lungenepithelzellen - imstande sind, zellfremde Proteine nach Transfer genetischen Materials zu translatieren und zu sezernieren. Eine pulmonale Applikation von therapeutischen Genen kodierend für sekretorische Proteine mittels Vernebelung könnte als nicht-invasive Methode z.B. für die Therapie von Hämophilie A oder B eine Rolle spielen. Weiterführende in vivo Versuche könnten Aufschluss über Serumkonzentrationen des sekretorischen Proteins nach pulmonaler Applikation bringen. Die Verwendung von mRNA als therapeutischem genetischem Material zeigt hierbei Vorteile gegenüber von pDNA, aufgrund der gesteigerten Transgen -Expression, der verminderten Dosis an Transferreagenz, sowie dem fast gänzlich ausgeschlossenen Risiko der insertionellen Mutagenese.

Diese Studien zeigen, dass das Chitinase-ähnliche Protein BRP-39 eine entscheidende Rolle in der Pathogenese einer Th2 Entzündung in der Lunge spielt. Wir fanden, dass BRP-39 von Makrophagen und Epithelzellen in Lungen mit Th2 Inflammation und IL-13-induzierter Inflammation exprimiert wird. Unter Verwendung von genetischen BRP-39 knock-out Mäusen fanden wir, dass BRP-39 eine kritische Rolle in der Pathogenese der allergisch induzierten Th2 Inflammation und damit assoziierten pulmonalen Umbauprozessen spielt. BRP-39 vermittelt diesen Effekt über eine Hemmung der zellulären Apoptose, die Regulation von Fas/CD95 Oberflächenexpression, die Regulation der Rekrutierung und Aktivierung pulmonaler myeloider dendritischer Zellen und der Differenzierung lokaler Alveolarmakrophagen zu alternativ-aktivierten Makrophagen. Diese Studie unterstreicht die Rolle von BRP-39 als funktionelle Komponente und als therapeutisches Ziel bei Asthma bronchiale.

Thu, 13 Nov 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9811/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9811/2/Striegl_Elisabeth.pdf Striegl, Elisabeth

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8942/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8942/1/Lechner_Susanne.pdf Lechner, Susanne ddc:500, ddc:590

Thu, 20 Dec 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7867/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7867/1/Olszak_Torsten_M.pdf Olszak, Torsten Michael

Salmonellen verfügen über ein sogenanntes Typ III-Sekretionssystem (T3SS), mit dessen Hilfe Effektormoleküle mit zellmodulatorischer Funktion durch die Wirtszellmembran direkt in das Zytosol von Makrophagen, dendritischen Zellen oder Epithelzellen transloziert werden. Das Salmonella-T3SS kann verwendet werden, um heterologe Proteine in den endogenen MHC Klasse I-Antigenpräsentationsweg von eukaryontischen Zellen einzuschleusen. Als T3SS-Trägerprotein hat sich das „Yersinia outer protein E“ (YopE) bewährt. Als Modellantigene dienten die immundominanten Proteine Listeriolysin O (LLO) und p60 des intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes. Am Beispiel der murinen Listeriose konnte im Tiermodell demonstriert werden, dass die einmalige orale Immunisierung mit einem rekombinanten S. typhimurium-Impfstamm, der entweder chimäres YopE/LLO oder YopE/p60 exprimiert und transloziert, zu einer effektiven und protektiven CD8 T-Zellantwort führt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der Einfluss von Booster-Immunisierungen auf die Induktion antigenspezifischer CD8 T-Zellantworten im oralen Mausmodell untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass der rekombinante S. typhimurium-Impfstamm nach homologen Booster-Immunisierungen zeitlich in seiner Fähigkeit beeinträchtigt war, Darm, mesenteriale Lymphknoten und die Milz geimpfter Mäuse zu kolonisieren. Die schnelle Eliminierung der Salmonellen nach wiederholter oraler Gabe beruhte dabei nicht auf p60217-225-spezifischen zytotoxischen CD8 T-Zellen, die durch die primäre Immunisierung induziert worden waren, sondern auf einer gegen den Impfstamm gerichteten Immunantwort, der sogenannten anti-Vektor-Immunität. Die herabgesetzte Kolonisierungsdauer nach Boost-Immunisierungen verhinderte dabei auch eine verstärkte antigenspezifische CD8 T-Zellantwort. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu einer Langzeit-Kolonisierung über einen Zeitraum von 21 Tagen, eine Kurzzeit-Kolonisierung oral immunisierter Mäuse über 6 Tage nicht ausreicht, um eine schützende p60-spezifische CD8 T-Zellantwort gegen Listeriose zu induzieren. Durch die Verwendung von zwei verschiedenen Salmonella-Serovaren (S. dublin und S. typhimurium) im Rahmen einer heterologen „prime-boost“-Immunisierung konnte die Salmonella-spezifische anti-Vektor-Immunität umgangen werden. Diese Strategie führte zu einer verlängerten Kolonisierungsdauer von über 14 Tagen und zu einer verstärkten antigenspezifischen CD8 T-Zellantwort nach Booster-Immunisierungen.

Einleitung:In der Vergangenheit wurden Keratinozyten lediglich als Träger des epidermalen Rahmengerüsts angesehen. Heute weiß man, dass die Keratinozyten eine Vielzahl biologisch bedeutsamer Moleküle sezernieren, mit denen sie bedarfsweise aktiv und wesentlich an vielen, insbesondere entzündlichen und immunologischen Reaktionen mitwirken. Daher sind Proliferation und Immunaktivierung bei Keratinozyten nicht prinzipiell gekoppelt. Seit 1981 werden kultivierte epitheliale Transplantate (KETs) zur Behandlung von Brandverletzten eingesetzt. Neben autologem Material, das erst spät verfügbar ist, erlangen kryokonservierte allogene Keratinozytentransplantate, vor allem bei Schwerbrandverletzten, immer mehr an Bedeutung. Allogene KETs beschleunigen die Heilung thermischer Wunden. Allerdings verbleiben sie nicht dauerhaft auf der Wunde, sondern werden schrittweise durch autologe Zellen ersetzt. Ihr Effekt könnte deshalb auf der Exprimierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren beruhen. Material und Methode:Das Ziel vorliegender Studie war, vergleichend die zelluläre Zusammensetzung allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial mit autologen aus wundnah gewonnenem Material Schwerstverbrannter zu untersuchen. Ausserdem sollten funktionelle Veränderungen hinsichtlich des in vitro Sekretionsmusters ausgewählter Mediatoren nach 5-, 10- und 15-tägiger Kultur, sowie nach Kryokonservierung charakterisiert und mit dem klinischen Verlauf korreliert werden. Die Erhebung der immunhistologischen Befunde erfolgte an gefärbten Zytospins nach HE- bzw. ABC-Methode. Zytokine und Wachstumsfaktoren in den Überständen der Keratinozytenkulturen wurden mit Bioplex Immunoassays quantifiziert. Die beiden Untersuchungskollektive stellten 17 Verbrennungspatienten mit > 25% TBSA, Grad II und/oder III und 17 zufällig ausgewählten Patientinnen, die sich einer Brustverkleinerung unterzogen. Resultate: Eine exemplarisch durchgeführte Histologie allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial zeigte morphologisch heterogene Keratinozyten mit einem deutlich erhöhten Anteil terminal differenzierter suprabasaler Zellen, verglichen mit autologen aus Patientenmaterial (CK 10, 11 positiv). In den autologen Transplantaten waren gegenüber den allogenen vermehrt teilungsaktive Basalzellen nachweisbar (CK 5, Vimentin positiv). Leukozyten, Makrophagen, Dendritische Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten konnten in autologen und allogenen KETs nicht nachgewiesen werden. IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-g und TNF-a waren in den allogenen und autologen KET-Überständen nicht oder lediglich in Spuren nachweisbar. IL-1RA konnte in den Kulturen beider Gruppen in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden. Die Sekretionsleistung von IL-6 und GM-CSF (Proliferationsschub der Keratinozyten, Chemotaxin) nach Verbrennungstrauma war während der ersten 15 Kultivierungstage gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht. Insbesondere die Gruppe der verstorbenen Patienten zeigte deutlich höhere Konzentrationen dieser Mediatoren in den Kulturüberständen während der ersten 15 Kulturtage im Vergleich zur Gruppe der überlebenden Patienten. VEGF, FGF-basic, TGF-ß und G-CSF zeigten in ihrem Sekretionsverhalten nur vergleichsweise minimale Unterschiede zwischen den beiden Kollektiven. Die Kryokonservierung führte zu einer verminderten Mediatorensynthese, mit Ausnahme signifikant erhöhter Konzentrationen der intrazellulär gespeicherten Mediatoren IL-1a und IL-1ß in der 24-stündigen Kultur nach dem Auftauen. Sie sind offensichtlich das Ergebnis physikalischer Freisetzung durch Zelldestruktion. Diskussion: Schweres Verbrennungstrauma führt zu einer erhöhten Teilungsaktivität von wundnahen epidermalen Basalzellen mit konsekutiv gesteigerter Mediatorenfreisetzung. Insbesondere die signifikant erhöhte in vitro Freisetzung des potenten Mitogens und proinflammatorischen Zytokins Interleukin-6 aus Keratinozyten nach schwerer Verbrennungsverletzung, verglichen mit solchen aus Mammareduktionsmaterial, ist ein deutlicher Hinweis, sowohl auf das entzündliche Geschehen, als auch auf die erhöhte Aktivität der thermisch beeinträchtigten Epithelzellen mit auto- und parakrinen Wirkungen.

Die Regulation der endometrialen Zytokinexpression steht im Zentrum der aktellen Forschungen zum Phänomen rezidivierender Frühaborte. Ziel der Arbeit war es die Auswirkungen der endometrialen Regulationsmechanismen Hormonstimulation, Hormonentzug, Zytokinstimulation und Hypoxie auf die mRNA Expression dreier verschiedender, für die Implantation der Blastozyste bedeutsamer Zytokine, am Kulturmodell endometrialer Zellen zu untersuchen, wobei eine getrennte Kultivierung von epithelialen und stromalen Zellen erfolgte. VEGF hat eine wichtige Funktion bei der Regulation der Angiogenese und wird im humanen Endometrium v.a. von Epithelzellen exprimiert. IL-1ß beeinflußt maßgeblich die Rezeptivität des Endometriums und spielt eine wichtige Rolle beim embryo-maternalen Dialog. G-CSF ist wichtig für die utero-plazentare Kommunikation und die Dezidualisierung der Stromazellen. Die ungestörte endometriale Differenzierung ist Basis einer normalen Rezeptivität. Diese wird durch Steroidhormone gesteuert, weshalb wir in dieser Arbeit die Auswirkungen der Steroidhormone 17-ß-Östradiol und Progesteron auf die Expression der genannten Zytokine untersuchten. Entgegen der Ergebnisse vorausgehender Studien konnte hierbei kein Effekt der Steroide auf die Zytokinexpression festgestellt werden. Des Weiteren stellte sich uns die Frage einer unmittelbaren Beeinflussung durch andere autokrine oder parakrine Faktoren wie z.B. Zytokine. Die Stimulation der Zellen mit IL-1ß und IL-6 führte bei den Stromazellen zu einem signifikanten Anstieg der mRNA-Expression von IL-1ß und G-CSF. Schließlich untersuchten wir den Einfluß von Hypoxie, welche bereits in vielen vorausgehenden Studien als entscheidender Regulationsfaktor für eine gesteigerte endometriale VEGF Expression beschrieben wurde. Dies konnte durch unsere Untersuchungen bestätigt werden, was gleichzeitig als Beweis der Funktionsfähigkeit unserer Kulturmodelle bei hypoxischen Bedingungen diente. Darüberhinaus konnte durch Hypoxie auch für die Zytokine Il-1ß und G-CSF ein signifikanter Expressionsanstieg verzeichnet werden.

Landwirte sind durch ihr Arbeitsumfeld einer erhöhten Konzentration von organischem Staub, insbesondere Endotoxinen im Stall, bei erhöhtem Lungenminutenvolumen durch körperliche Arbeit ausgesetzt. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, unter Berücksichtigung der Endotoxinkonzentrationen das broncho-pulmonale System auf Entzündungsreaktionen zu untersuchen. Insbesondere war hier die nasale Lavage von Interesse, da hierbei durch eine nicht-invasive Untersuchungstechnik Rückschlüsse auf den Zustand des Respirationstraktes gezogen werden können. Zum Vergleich und um Aussagen über systemische Entzündungsreaktionen zu erhalten, wurden ausgewählte Entzündungsparameter im peripheren, venösen Blut quantitativ bestimmt. Die Untersuchung erfolgte an zwei Kollektiven gesunder Probanden. Es wurden 21 Landwirte mit 24 nicht beruflich exponierten Personen verglichen und das Auftreten von respiratorischen und allergischen Symptomen nach Exposition erfasst. Des Weiteren wurden eine Lungenfunktionsuntersuchung, eine Blutabnahme und eine Nasallavage zur Evaluierung der häufigsten Blut- und Entzündungsparameter durchgeführt. Im Plasma wurden die proinflammatorischen Zytokine TNF-, IL-6 und ENA-78 bestimmt. Zusätzlich wurde Endotoxin personenbezogen gemessen sowie die Kohlendioxid- und Ammoniakkonzentrationen im Stall ortsfest bestimmt. Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Windgeschwindigkeit im Stall wurden vor Ort am Expositionstag ermittelt. Die gemessenen Endotoxin Konzentrationen lagen im Bereich von 0,9 EU/m3 bis 20816,3 EU/m3. Die Lungenfunktionswerte zeigten eine signifikante Erhöhung über die Stallarbeit. VCinsp (vor Expo: 107,7 ± 3,7 %; nach Expo: 112,4 ± 3,7 %; pw=0,039), FEV1 (vor Expo:111,2 ± 4,0 %; nach Expo: 114,6 ± 3,8 %; pw=0,042), und MEF50 (vor Expo: 82,0 ± 7,5 %; nach Expo: 88,1 ± 6,2 %; pw=0,044) stiegen signifikant an. Die Analyse des Differentialblutbildes zeigte das Bild einer Entzündungsreaktion nach Exposition. Es erhöhte sich signifikant der Anteil der neutrophilen Granulozyten an den Leukozyten (vor Expo: 52,7 ± 1,6 %; nach Expo: 62,9 ± 1,6 %; pw=0,003). Lymphozyten fielen von 35 ± 1,56 % auf 27,5 ± 1,3 % ab (pw=0,003), eosinophile Granulozyten fielen von 3,5 ± 0,4 % auf 7,3 ± 0,3 % (pw=0,013), Monozyten von 8,4 ± 0,5 % auf 7,3 ± 0,3 % (pw=0,012), CRP von 0,2 ± 0,04 mg/dl auf 0,15 ± 0,04 mg/dl (pw=0,011). Auch in der Kontrollgruppe kam es zu einer ähnlichen, ebenfalls signifikanten Veränderung, diese war jedoch geringer ausgeprägt. Für die Zytokine im Serum zeigte sich keine statistisch signifikante Veränderung über die Exposition. Jedoch ergab sich ein positiver Zusammenhang zwischen der IL-6 Konzentration im Serum und der Höhe der Endotoxinbelastung im Stall. Dieser Zusammenhang war allerdings nicht statistisch signifikant (p=0,056). Bei Betrachtung der Zelldifferenzierung der Nasallavage konnte ein geringer, aber signifikanter Abfall der Anteile der neutrophilen Granulozyten (vor Expo: 88 ± 5,7 %; nach Expo: 77 ± 8,7 %; pw=0,047) festgestellt werden. Außerdem ergab sich ein hochsignifikanter Zusammenhang zwischen der Höhe der Endotoxinkonzentration und der nasalen Makrophagen (psp=0,0001), sowie der nasalen Epithelzellen (psp=0,022). Im Hinblick auf unsere Anfangs gewählte Fragestellung deutet unser Ergebnis an, dass eine Exposition gegenüber organischem Staub, insbesondere Endotoxin, zu einer Neutrophilie im Serum führen kann und bei hohen inhalierten Endotoxinkonzentrationen auch vermehrt Makrophagen in der Nasenschleimhaut rekrutiert werden. Da sowohl die Lungenfunktionsparameter, als auch die systemischen (Serum) und lokalen (Nasallavage) Entzündungszeichen das Bild einer Entzündungsreaktion zeigen, kann davon ausgegangen werden, dass die Lungenfunktion, sowie die systemischen und lokalen Messmethoden über ausreichende Sensitivität verfügen, um in diesem Studiendesign Entzündungsreaktionen nachzuweisen. Die Nasallavage konnte im Feldversuch als eine objektive, kostengünstige, schnelle und gut tolerable Messmethode zur Darstellung von nasalen Entzündungsreaktionen etabliert werden.

Die Schleimhaut des nasalen Raums stellt das primäre Kontaktorgan für inhalierte Stoffe dar. Um den Körper vor toxischen Wirkungen zu schützen und den Geruchssinn zu unterstützen, besitzen die Epithelzellen der respiratorischen Anteile erhebliche metabolische Kompetenz. Interindividuelle Unterschiede im Fremdstoffmetabolismus können in Verbindung mit einer beruflichen Exposition gegenüber inhalativen Karzinogenen zur Entstehung von Malignomen des sinonasalen Raums führen. Um gefährliche Stoffe und gefährdete Populationen anhand von in-vitro-Versuchen identifizieren zu können, wurde ein dreidimensionales Kultursystem humaner nasaler Mukosa vorgestellt, das die Verhältnisse in vivo möglichst realistisch abbildet. Dazu wurden Resektate humaner nasaler Mukosa in 1 mm3 großen Fragmenten unter optimierten Umweltbedingungen kultiviert. Innerhalb einer Woche bildeten sich daraus vollständig epithelisierte Miniorgane mit physiologischen histomorphologischen und funktionellen Eigenschaften. Um die Leistungsfähigkeit der Miniorgane zu evaluieren, wurden sie ein- oder mehrfach gegenüber den bekannt genotoxischen Substanzen Natriumdichromat, N-Nitrosodiethylamin (NDEA) und N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) exponiert. Parallel dazu wurden zum Vergleich Einzelzellsuspensionen mit diesen Stoffen inkubiert. Die induzierten genetischen Schäden wurden mit Hilfe der alkalischen Version des Einzelzell-Mikrogelelektrophorese-Assay quantifiziert. Der Anteil apoptotischer Vorgänge an hohen DNS-Schäden im Einzelzell-Mikrogelelektrophorese- Assay wurde durch den Annexin-V-Affinitätstest erfasst. Um den Erhalt der metabolischen Kompetenz der Zellen der Miniorgane im Verlauf der Kultivierung zu belegen, wurde die Konzentration von Cytochrom P450 2A6, einem Schlüsselenzym im Metabolismus zahlreicher inhalativer Giftstoffe, durchflusszytometrisch bestimmt. Die Miniorgane blieben über den Kulturzeitraum strukturell und funktionell intakt. Die einmalige Exposition gegenüber Natriumdichromat und MNNG verursachte erhebliche genetische Schäden, die bei wiederholter Inkubation trotz 48stündiger Reparaturphasen weiter zunahmen. Im Falle von Natriumdichromat stieg analog dazu der Anteil apoptotischer Zellen rasant an. Bei MNNG war dagegen keine erhöhte Apoptoserate nachweisbar. Die wiederholte Inkubation der Miniorganen mit NDEA ergab weder einen signifikanten genotoxischen Effekt, noch einen Anstieg der Apoptoserate, obwohl das für die Aktivierung von NDEA entscheidende Apoenzym Cytochrom P450 2A6 über den gesamten Untersuchungszeitraum in den Zellen nachgewiesen werden konnte. Im Vergleich der DNS-Fragmentierung erwiesen sich die in Suspension inkubierten Einzelzellen als empfindlicher gegenüber der Wirkung von Natriumdichromat und MNNG. Miniorgane nasaler Mukosa sind für toxikologische Studien optimal geeignet, da sie Untersuchungen an humanem Zielgewebe über einen längeren Untersuchungszeitraum erlauben. Dies eröffnet vielfältige Versuchsanordnungen hinsichtlich Expositionsfrequenz und Reparaturintervallen. Zudem erscheinen die Kulturen ausreichend robust, um zukünftig verschiedene realistische Expositionsmodelle, wie Begasungsanlagen und komplexe Mischungen, einzusetzen.

Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der bovinen Eileiterepithelzellen ex vivo und in Suspensionskultur. Ein Schwerpunkt meiner Arbeit bezüglich des bovinen Eileiters ex vivo lag bei den zyklischen Veränderungen des Eileiterepithels, über die bisher wenig präzise Daten vorlagen. Die Ampulla und der Isthmus wurden sowohl bei den Untersuchungen ex vivo als auch in der Zellkultur getrennt betrachtet. Es wurde deutlich, dass das Epithel der Ampulla stärkere morphologische Veränderungen während des Zyklus aufweist, als das Epithel des Isthmus. So war im Epithel der Ampulla die Bildung von Protrusionen zu beobachten, die abhängig vom Zyklusstadium verschiedenen Inhalt aufweisen. Die maximale Höhe des Epithels wurde in beiden Eileiterabschnitten im Östrus erreicht. Im Isthmus war das Epithel jedoch etwas niedriger als in der Ampulla. Im Metöstrus war die stärkste sekretorische Aktivität zu verzeichnen. Dies zeigte insbesondere die massive Ansammlung von sekretorischen Granula unter der apikalen Zytoplasmamembran. Nur in diesem Stadium konnte auch Exozytose der Granula beobachtet werden. Eine Veränderung der Anteile zilientragender und sekretorischer Zellen im Epithel, wie sie bei anderen Spezies beschrieben wurde, konnte beim Rindereileiter nicht festgestellt werden. Meine elektronenmikroskopischen Ergebnisse zeigen, dass beim Rind zumindest ein partieller Zilienverlust im Eileiter stattfindet. Durch die massiven Protrusionen der sekretorischen Zellen werden die Zilienbüschel außerdem im Diöstrus zur Seite gedrängt und teilweise verdeckt. Dadurch kann der Eindruck entstehen, dass die Anzahl der zilientragenden Zellen im Diöstrus abnimmt. Im bovinen Eileiterepithel wurde eine nur sehr geringe Mitoserate festgestellt, die in den verschiedenen Zyklusstadien kaum variiert. Sowohl in der Zellkultur als auch im Eileiterepithel ex vivo konnten Mitosen ausschließlich bei nicht-zilientragenden Zellen beobachtet werden. Die Zilien der Sphäroidzellen wiesen nach außen und waren während der gesamten Kultivierung vorhanden. Demnach blieb die Polarisierung der Epithelzellen erhalten. Dies sind Indize dafür, dass die Zellen einer nur geringen Dedifferenzierung während der Kultur unterliegen. Die sekretorische Aktivität der kultivierten Epithelzellen erscheint aber beeinträchtigt. Während sich die sekretorischen Granula bis zum 3. Kulturtag unter der apikalen Zellmembran ansammelten, waren sie am 5. Kulturtag bereits großflächig im apikalen Zytoplasma verteilt und an späteren Kulturtagen nur noch vereinzelt vorhanden. Da die sekretorische Funktion jedoch essentiell für die embryo-maternale Kommunikation ist, scheint die Suspensionskultur nur mit frisch isolierten Eileiterepithelzellen sinnvoll zu sein. Als weiteres Anzeichen einer Dedifferenzierung in Kultur ist die reduzierte Expression der Rezeptoren für Progesteron und Östrogen zu interpretieren. Nach diesen Ergebnissen sind die Sphäroiden in den ersten drei Kulturtagen für eine Kokultur geeignet, da sie während dieser Zeit nur leichte Anzeichen einer Dedifferenzierung aufweisen. Auch die physiologische Aufenthaltszeit des Embryos im Eileiter beträgt ungefähr drei Tage. Demnach scheint die Suspensionskultur als Kurzzeitmodell für eine Kokultur mit Embryonen gut geeignet zu sein.

Unzureichende Möglichkeiten in Diagnose und Behandlung von epithelialen Ovartumoren führen zu einer niedrigen Überlebensrate der Patientinnen. Die molekularen Zusammenhänge, die der Progression dieser Krankheit zugrunde liegen, sind noch weitgehend unbekannt und erschweren Verbesserungen in der Früherkennung und Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der Affymetrix Genchip-Technologie die Genexpressionsprofile von elf Ovartumor-Zelllinien mit denen von zwei IOSE-Zelllinien, die aus normalen Epithelzellen des Ovars etabliert wurden, verglichen. So sollten Gene identifiziert werden, welche die Tumorzellen von den normalen Zellen unterscheiden und eventuell als diagnostischer Marker oder als Zielgen für therapeutische Zwecke dienen können. Mit besonderem Augenmerk auf Transmembran- bzw. sezernierte Proteine wurden zunächst 21 bzw. sieben Gene in den beiden Gruppen identifiziert, deren Überexpression in Karzinomen des Ovars zum ersten Mal ermittelt wurde. Die Ergebnisse der Affymetrix-Analyse wurden mittels RT-PCR in sieben ausgewählten Genen bestätigt. Die Expressionsanalysen von drei ausgewählten Genen, NMU, JAG2 und L1CAM, wurden auf Ovartumor-Gewebeproben ausgeweitet und eine mögliche Rolle in der Tumorgenese des Ovarkarzinoms diskutiert. Da für L1CAM spezifische Antikörper zur Verfügung standen, konnte gezeigt werden, dass die Abundanz der L1CAM-mRNA mit der Protein-Abundanz korrelierte und die Lokalisierung in der Zelle wie erwartet in der Plasmamembran erfolgte. Die Expression von L1CAM konnte immunhistochemisch in Paraffinschnitten von Ovarkarzinomen nachgewiesen werden. Zu einem geringeren Prozentsatz konnte das Zelladhäsionsmolekül auch in Borderline-Tumoren, die in der Regel durch eine gute Prognose gekennzeichnet sind, und Fibromen identifiziert werden. In malignen Ovartumoren nicht epithelialer Herkunft konnte keine L1CAM-Expression festgestellt werden. Zeitgleich wurde die Überexpression von L1CAM in Ovarkarzinomen beschrieben und das Molekül als prognostischer Marker in Karzinomen des Ovars, Uterus und des Endometriums identifiziert. Durch funktionelle Analysen sollte die Funktion von L1CAM in Ovartumorzellen untersucht werden. Bei der Klonierung von L1CAM wurde festgestellt, dass aus den verwendeten Ovartumor-Zelllinien nur eine Isoform des Gens isoliert werden konnte, in der die Exons 2 und 27 deletiert sind. In stabilen L1CAMΔ2,27-Transfektanten konnte gezeigt werden, das die Expression dieser Isoform zu erhöhter Adhäsion an Laminin im Vergleich zu Vektor-Transfektanten führt. Die Invasionsfähigkeit der Transfektanten wurde durch die ektopische L1CAMΔ2,27-Expression nicht verändert. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit unter der Verwendung der Genchip-Technologie die zwei potenziellen Markergene NMU und JAG2 identifiziert, die in weiteren Analysen auf ihre Bedeutung in Ovarkarzinomen untersucht werden müssen. L1CAM wurde in immunhistochemischen Studien als Marker identifiziert, dessen prognostischer Wert in Zukunft die Diagnose und Therapie dieser aggressiven Erkrankung verbessern könnte. Zudem bieten die vielfältigen Funktionen von L1CAM Möglichkeiten bei der therapeutischen Intervention durch monoklonale Antikörper, die durch die Expression einer Spleißvariante in Ovartumorzellen spezifiziert werden könnte.

Dendritische Zellen (engl.: dendritic cells, DC) gelten seit ihrer Entdeckung als eine der wichtigsten Zelltypen des Immunsystems. Dies gilt sowohl für die Erzeugung von Immunität als auch von Toleranz, insbesondere in Bezug auf T-Zell-vermittelte Immunreaktionen (Banchereau et al. 1998). Im Zuge dessen wird in DC enorme Hoffnung bezüglich des Verständnisses von Autoimmunerkrankungen sowie Erkrankungen wie z.B. Krebs gesetzt, bei der DC schon seit einigen Jahren zur Immuntherapie verwendet werden (Banchereau et al. 2001). Die Analysen von DC beinhalteten jedoch bisher immer die Isolation von DC ex vivo oder deren Kultivierung in vitro. Diese experimentellen Versuchsschritte zeigten einen tiefgreifenden Einfluss auf den Phänotyp von DC und somit auch auf deren immunstimulatorischen Eigenschaften (Pierre et al. 1997; Gallucci et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde durch die Entwicklung eines transgenen Maussystems erstmals der generelle Einfluss von DC auf CD8-T-Zellen in vivo detailliert analysiert. Dies konnte direkt an der Qualität der CD8-T-Zellantworten auf bestimmte Immunstimuli abgelesen werden, ohne die DC isolieren oder anderweitig manipulieren zu müssen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Bedeutung von DC im Thymus bei der Selektion sich entwickelnder CD8-T-Zellen analysiert, da es in Bezug auf die Bedeutung von DC sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Selektion widersprüchliche Meinungen gibt. Es konnte gezeigt werden, dass DC im Thymus nicht zur positiven Selektion von CD8-T-Zellen befähigt sind, sondern dass hierbei den Epithelzellen des Thymus eine entscheidende Bedeutung zukommt. Durch Zelltransferversuche konnte weiterhin gezeigt werden, dass DC zur Eliminierung autoreaktiver CD8-T-Zellen, und somit zur Induktion zentraler Toleranz, durch negative Selektion im Thymus ausreichten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Vermögen von DC sowie die Qualität der durch sie induzierten CD8-T-Zell-Immunantworten untersucht. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass DC ausreichend sind, um eine vollständige und funktionelle Immunantwort durch CD8-T-Effektorzellen in vivo zu induzieren. Bei der Aktivierung von CD8-T-Zellen nur durch DC, konnten beim Vergleich mit Wildtyp-Mäusen jedoch auch qualitative sowie quantitative Unterschiede festgestellt werden, die eine mögliche Bedeutung weiterer Zellen bei der „Feinregulation“ CD8-basierter T-Zellantworten wahrscheinlich machen. Im Gegensatz hierzu konnten keine Unterschiede bei CD8-TZellreaktion nach Induktion von Toleranz erkannt werden. DC konnten in diesem Fall eindeutig als der hauptverantwortliche Zelltyp zur Erzeugung peripherer Toleranz in vivo identifiziert werden.

Die humanpathogenen Bakterien Yersinia enterocolitica und Yersinia pseudotuberculosis sind die Verursacher von Darminfekten wie Enteritis und Enterokolitis. Das äußere Membranprotein YadA stellt bei Y. enterocolitica einen essentiellen Pathogenitätsfaktor dar. Seine virulenzassoziierten Eigenschaften sind die Fähigkeit zur Autoagglutination, die Bindung an Moleküle der extrazellulären Matrix, an Epithelzellen und Granulozyten, und die Vermittlung von Serumresistenz. Welchen Teil die verschiedenen Domänen des Proteins zur Struktur und Funktion beitragen, war bisher kaum bekannt. Auch der Versuch, dem Adhäsin durch einen Domänenaustausch völlig neue Bindungs- oder Reaktionseigenschaften zu vermitteln, war bislang nicht unternommen worden. Darum wurden In-Frame-Deletionsmutanten, mit FLAG-Epitopen oder FaktorXa-Proteaseschnittstellen versehene YadA-Mutanten erstellt und FimH-YadA-Hybridproteine konstruiert. Die verschiedenen YadA-Mutanten wurden strukturell auf ihre Außenmembranlokation, Oberflächenexposition und Oligomerisierung untersucht, funktionell auf ihre Adhäsionseigenschaften und Serumresistenz. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: Kopf- und Stieldomäne bilden zusammen mit der interponierten, stark konservierten Neck-Region die translozierte, oberflächenexponierte Passenger-Domäne. Die C-terminale Membranankerregion (as 353-422) ist ausreichend für Insertion in die Außenmembran und Bildung eines trimeren YadA. Die Linker-Region vermittelt die Translokation der Passenger-Domäne durch die Außenmembran. Somit zeigte sich, dass YadA alle Kriterien für einen Autotransporter erfüllt. Der Versuch, ein Hybridadhäsin mit Mannosebindungsfähigkeit durch Austausch der Kopfdomäne mit der Lektin-Domäne von FimH zu erzeugen, schlug fehl. Dies zeigt, wie empfindlich Passenger-Domäne und Membrananker von YadA aufeinander abgestimmt sind. Die funktionelle Untersuchung der Mutanten ergab, dass die hochkonservierte Neck-Domäne zusammen mit der Kopfregion ein Bindungsmodul für Kollagen und Epithelzellen darstellt. Im Serumresistenztest erwiesen sich Kopf-, Neck- und auch Teile der Stiel-Region für ein Überleben entbehrlich. Es zeigte sich, dass keine Domäne für die Serumresistenz von YadA entscheidend ist.

In der vorliegenden Arbeit wurden 45 Nebenhoden von klinisch gesunden Katern im Alter zwischen fünf Monaten und zehn Jahren im Hinblick auf Morphologie, Ultrastruktur und Histochemie untersucht. Es wurden zehn verschiedene immunhistologische Reaktionen auf verschiedene Proteine bzw. Hormonrezeptoren durchgeführt. Der Nebenhoden des Katers entspricht in seinem anatomischen Aufbau dem anderer Tierarten. Durch das Auftreten verschiedener Zellarten, unterschiedlicher Epithelhöhe und der Länge des Zellbesatzes sowie Form und Lage des Nukleus kann der Epididymidis des Katers in fünf verschieden Segmente unterteilt werden. Die Ductuli efferentes bilden mit Segment 1 und 2 den Nebenhodenkopf, Segment 3 und 4 entsprechen dem Corpus epididymidis und der Nebenhodenschwanz besteht aus Segment 5. Die Ductuli efferentes besitzen zilienbesetzte und zilienlose Zellen, die in verschiedenen Färbungen und immunhistologischen Reaktionen auch unterscheiden. Das Epithel des Ductus epididymidis des Katers besteht aus Hauptzellen, Basalzellen und Lymphozyten, sowie Apikalzellen in Segment 2 und 5. Neben den genannten Zellarten bzw. ihrer Kerne oder des Zytoplasmas wurden bei den immunhistologischen Reaktionen Spermien, luminale Epithelzellen, Muskulatur, Gefäße und die Basallamina beurteilt. VEGF (“Vascular endothelial growth factor“) ist immunhistochemisch nur schwach nachweisbar, dafür zeigt sich der VEGF-Rezeptor deutlich positiv, vor allem in den Zellkernen der Hauptzellen von Nebenhodenkopf und –schwanz. GHR (“Growth hormone receptor“) reagiert in Kernen der Hauptzellen und Apikalzellen des gesamten Nebenhodens, sowie deren Zytoplasma. Außerdem ist es in den Gefäßen und der Muskulatur nachweisbar. Vimentin kommt im Zytoplasma der Ductuli efferentes sowie in Muskulatur, Interstitium, Gefäßen und Basallamina des Ductus epididymidis vor. Cytokeratin färbt das Zytoplasma der Ductuli efferentes und der Hauptzellen in Segment 1 und 5 an. Laminin kommt vorwiegend in der Muskulatur, den Gefäßen und der Basallamina, in geringer Menge auch im Zytoplasma der Hauptzellen vor. a-SMA (“Smooth muscle actin“) zeigt sich ausschließlich in den glatten Muskelzellen der Ductuli efferentes, des Nebenhodenganges und der Gefäße, ohne regionale Unterschiede. Androgen-Rezeptor ist in den Kernen aller Hauptzellen, vorwiegend aber von Segment 1 bis 4 sowie im Interstitium nachweisbar. Östrogen-Rezeptor a reagiert dagegen nur in den Kerne der Ductuli efferentes und färbt in Segment 4 und 5 den Zellbesatz und die Spermien an. Progesteron-Rezeptor reagiert im gesamten Nebenhodengang positiv im Interstitium, den Gefäßen und den luminalen Spermien. Außerdem färbt es den Zellbesatz von Segment 2 bis 5 an.

In der vorliegenden Arbeit wurde die pränatale Entwicklung und Morphologie des bovinen Nabelstrangs untersucht. Hierfür wurde die Nabelschnur von Feten ab dem 2. Graviditätsmonat (SSL 2,5 cm) bis zum geburtsreifen Kalb im 9. Monat (SSL 89 cm) verwendet. Neben lichtmikroskopischen (routinehistologischen, immun- und glykohistochemischen) Färbungen wurden elektronenmikroskopische Techniken angewendet. Dabei besitzt die Nabelschnur des Rindes zu jedem Gestationszeitpunkt zwei Nabelvenen, zwei Nabelarterien und einen Urachus, die allesamt in der Wharton Sulze (WS) eingebettet sind. Bis zu einer SSL von 26 cm können in der Nabelschnur des Rindes das extraembryonale Nabelzölom und die Reste des Dottersackganges beobachtet werden. Die Nabelschnur wird außen ausschließlich vom Amnionepithel umgeben. Das Amnionepithel besteht aus ein- und mehrschichtigen Bereichen. Bei den mehrschichtigen Arealen handelt es sich meist um lokal begrenzte, glykogenreiche Amnionepithelwarzen (Plaques), die der Oberfläche einen zottenartigen Charakter verleihen. Ihre Anzahl steigt im Laufe der Entwicklung an. Ab einer SSL von 42 cm (6. Monat) scheinen die nun dicht stehenden Warzen zu fusionieren, so dass nun auch über größere Strecken mehrschichtige Amnionepithelbereiche auftreten. Im 7. Trächtigkeitsmonat (SSL 53 cm) beginnt das Amnionepithel stellenweise zu verhornen. Zahlreiche desmosomale Zellverbindungen und Interdigitationen der Plasmamembranen der Amnionepithelzellen sprechen für eine hohe mechanische Festigkeit des Amnionepithels. Die zum Teil erheblich erweiterten Interzellularräume zwischen den Epithelzellen sowie der hohe Mikrovillibesatz der apikalen Zellschichten deuten auf Sekretions- und Resorptionsprozesse hin. Im Gegensatz zu anderen Gefäßen besitzt die Nabelvene des Rindes eine gut ausgebildete Lamina elastica interna, wohingegen sie in der Nabelarterie fehlt. Die Muskelzellen der Nabelvene sind weit voneinander durch Bindegewebe getrennt, wodurch die Diffusion und der Transport von Nährstoffen erleichtert werden. Beide Gefäße besitzen Vasa vasorum und bestehen während der ganzen fetalen Entwicklung aus α-smooth-muscle-Aktin (αSMA) exprimierenden Muskelzellen. Die bovinen Nabelgefäße sind nicht innerviert. Dies wurde auch durch das Ergebnis der immunhistologischen Untersuchung des S100 Proteins bestätigt. Die Ultrastruktur der Endothel- und glatten Gefäßmuskelzellen der Nabelgefäße gibt Hinweise auf eine hohe Proteinsyntheseleistung sowie auf einen regen Stofftransport dieser Zellen. Die bovine WS wird von zahlreichen feinen Blutgefäßen durchzogen. Sie wird im Laufe der fetalen Entwicklung zell- und grundsubstanzärmer, jedoch faserreicher. Im Gegensatz zu der makroskopisch einheitlich erscheinenden WS, stellt sie sich bei mikroskopischer Betrachtung heterogen dar. Dabei lassen sich der Bereich um den Urachus, die schwach ausgebildete Adventitia sowie unter dem Amnionepithel befindliche WS-Bereiche von der restlichen zentralen WS abgrenzen. Der Eindruck der Heterogenität entsteht durch den unterschiedlichen Zellgehalt, durch die Ultrastruktur der Zellen, durch das Verteilungsmuster der Intermediärfilamente und des αSMA sowie durch das Lektinbindungsmuster und durch die Reaktionen in der Alcianblau-Färbung. Besonders auffällig ist die Entstehung einer breiten Schicht αSMA-exprimierender Muskelzellen in der WS subepithelial unter dem Amnionepithel, wobei ein sphinkterähnlicher Muskelring gebildet wird. Der Urachus weist zunächst ein einschichtiges Epithel auf, das im Laufe der Entwicklung jedoch mehrschichtig wird. Ab einer SSL von 26 cm (4. Trächtigkeitsmonat) wird er von zirkulär angeordneten Muskelzellen umgeben. Um das Vorkommen und die Verteilung bestimmter Zuckergruppen in der bovinen Nabelschnur zu bestimmen, wurde das Bindungsmuster verschiedener Lektine untersucht. Dabei konnte mit Con A, WGA, ECA, GSA I, PNA und VVA eine deutliche, mit SBA, UEA I und LTA jedoch nur eine schwache Reaktion hervorgerufen werden. Weiterhin ließ sich eine altersabhängige Expression der Intermediärfilamente Vimentin, Desmin und Pan-Cytokeratin (CK) beobachten. Dabei konnte der Epithelzellmarker CK in einigen Zellen der Nabelgefäßwand bis zum 2. Monat (6,5 cm SSL) und in einigen WS-Zellen bis zum 4. Monat (26 cm SSL) nachgewiesen werden. In den Gefäßmuskelzellen der bovinen Nabelgefäße werden im Laufe der Entwicklung alle drei Intermediärfilamenttypen exprimiert, während in den WS-Zellen, mit Ausnahme der glatten Muskelzellen des Urachus, Desmin immunhistologisch nicht nachweisbar ist. Da die bovinen Nabelgefäße nicht innerviert sind, muss der umbilikale Blutfluss durch andere, nicht-nervale Faktoren reguliert werden. Dabei sind unter anderem die Anordnung der Gefäßmuskelzellen sowie die Kontraktionsfähigkeit der Nabelgefäße, die sich in der frühen Expression von αSMA aller Gefäßmuskelzellen widerspiegelt, von Bedeutung. Die in den bovinen Nabelgefäßen typische Verteilung der elastischen Fasern spielt diesbezüglich ebenfalls eine wichtige Rolle. Zusätzlich ist der umbilikale Blutfluss von der Struktur und Konsistenz der WS abhängig. Die Zusammensetzung der WS wird dabei entscheidend durch die die extrazelluläre Matrix produzierenden WS-Fibrozyten beeinflusst. Eine aktive Beteiligung des sphinkterähnlichen Muskelrings an der Regulation des Blutflusses ist sehr wahrscheinlich. Einen weiteren Faktor der Blutflussregulation stellen vasoaktive Substanzen dar, wobei die Ultrastruktur der Endothel- und Gefäßmuskelzellen Hinweise auf eine mögliche lokale Produktion dieser Substanzen in den Nabelgefäßen gibt. Der Nachweis von bovinem Progesteron-Rezeptor (bPR) in den Endothelzellen der Nabelgefäße aller untersuchten Feten lässt eine Beteiligung von Progesteron an der umbilikalen Blutflussregulation vermuten.

Teil I: Bereits seit Jahrzehnten wird der Anteil des nicht-genetisch bedingten Risikos für Brustkrebs auf über 60% geschätzt. Umweltfaktoren wie Adipositas, Ernährung und körperliche Aktivität, sozioökonomischer Status, elektromagnetische Felder und Nikotin sind in vielen Studien mit dem Brustkrebsrisiko assoziiert; jedoch nur radioaktive Bestrahlung und hormonelle Faktoren, die östrogenimitierend wirken, sind anerkannte Risikofaktoren für Brustkrebs. Teil II: 17 Studien mit Messung im Fettgewebe und 25 Serumstudien sind bisher zu der Fragestellung Pestizide und Brustkrebs als Fall-Kontroll-Studien publiziert, die in der Mehrzahl keine signifikanten Assoziationen zum Brustkrebsrisiko beobachteten. Für Untergruppen mit erhöhter Exposition, wie bei dunkelhäutigen Frauen oder bei Frauen, die nicht stillten, wird ein erhöhtes Brustkrebsrisiko mit steigenden Konzentrationen einiger Substanzen berichtet. Teil III: Für die Substanzen DDT/DDE, HCB, HCH, Pyrethroide, PCP und PCB existieren experimentelle Daten über hormonimitierende, zumeist östrogene Wirkungen, die bei hormonsensitiven Tumoren, wie dem Brustkrebs, an der Karzinogenese beteiligt sind. DDT/DDE, -HCH, HCB und PCP gelten als möglicherweise humankanzerogen, PCB als wahrscheinlich humankanzerogen. DDE, -HCH, HCB und hochchlorierte PCBs sind persistent und schwer abbaubar. Teil IV: Es wurde eine krankenhausbasierte Fall-Kontroll-Studie an neun Patientinnen mit histologisch nachgewiesenen Mammakarzinomen und sieben nach dem Alter gematchten Kontrollpatientinnen mit benignen Mammaveränderungen, die sich einem operativen Eingriff an ihrer Brust unterzogen, durchgeführt. Bezüglich der Confounder Alter, Alter bei Menarche, Alter bei erster Geburt, Stilldauer (Monate), BMI und Zahl der Kinder bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen Fall- und Kontrollgruppe. Die Patientinnen der Fallgruppe waren überwiegend postmenopausal, die in der Kontrollgruppe überwiegend prämenopausal; in der Fallgruppe rauchte eine von neun Patientinnen (= 11%), in der Kontrollgruppe fünf von sieben (= 71%). Es wurde Brust- bzw. Tumorgewebe auf die Gehalte an DDT/DDE, HCB, ß-HCH, Permethrin, PCP und die Summe der PCB-Abkömmlinge Nr. 28, 52, 101, 138, 153 und 180 gaschromatografisch mit Elektroneneinfangdetektor untersucht. Permethrin wurde in keiner Probe oberhalb der Nachweisgrenze von 50 ppb detektiert. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Fall- und Kontrollgruppe wurden für keine Substanz festgestellt. Die von uns gemessenen HCB-Konzentrationen sind mit 794/561 ppb in Fall-/Kontrollgruppe (arithmetrisches Mittel) nach hiesiger Kenntnis die höchsten, welche bisher im Brustgewebe festgestellt wurden. Dies ist vermutlich auf eine stärkere Belastung der deutschen Nahrungsmittel mit HCB zurückzuführen. Bei der Untersuchung der Werte des Gesamtkollektivs korrelierte die Anzahl der Geburten signifikant negativ mit dem Gehalt an DDT (r=-0,72; p

Thu, 6 May 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2126/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2126/1/Wild_Christopher.pdf Wild, Christopher

Das humanpathogene Bakterium H. pylori persistiert im Gastroduodenaltrakt für Jahre oder sogar Jahrzehnte und löst durch die Kolonisation der Magenmukosa eine chronische Entzündungsreaktion aus. In den meisten Fällen bleibt diese symptomlos, es können jedoch auch schwerwiegende Erkrankungen wie ein Magen- oder Zwölffingerdarm-Geschwür oder Magenkrebs daraus hervorgehen. Obwohl die Infektion eine starke zelluläre und humorale Immunantwort hervorruft, kann H. pylori durch das Immunsystem nicht eliminiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von H. pylori auf die Proliferation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass H. pylori zwei Faktoren besitzt, um die Expansion der T-Zellen zu hemmen. Der eine, nicht näher charakterisierte Faktor scheint mit der Oberfläche der Bakterien assoziiert zu sein und inhibiert die Proliferation der T-Zellen bei direktem Kontakt der Bakterien mit den Zellen. Der zweite Faktor wurde als vakuolisierendes Zytotoxin VacA identifiziert, das, wie bisher bekannt war, in Epithelzellen die Bildung saurer Vakuolen auslöst. T-Zellen produzieren, wenn sie aktiviert werden, den Wachstumsfaktor IL- 2, beginnen sich zu vermehren und setzen eine Immunreaktion gegen das Pathogen in Gang. Das VacA-Toxin hemmt jedoch die Bildung von IL-2 und bewirkt eine Hemmung des Zellzyklus bei T-Zellen, indem es die Expression der Cycline D3 und E reprimiert. Diese sind essentiell für die Aktivierung des Retinoblastom-Proteins, das den Übergang des Zellzyklus von der G1- in die S-Phase vermittelt. Durch die Hemmung der IL-2-Produktion und die Erniedrigung der Oberflächenlokalisation von CD25, der -Kette des IL-2-Rezeptors, unterbricht VacA die Signaltransduktion, die normalerweise über den IL-2-Rezeptor zur Expression der Cycline führt. Die Hemmung der IL-2-Produktion durch VacA erfolgt auf transkriptioneller Ebene, indem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) verhindert wird. Die anderen für die Transkription des IL-2-Gens essentiellen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-B werden durch VacA nicht beeinflusst. Die Stimulation der T-Zellen aktiviert zwei Haupt-Signalwege: einer führt über den MAPKinase / ERK-Kinase Weg zur Aktivierung von AP-1 und NF-B, der andere löst eine Erhöhung der Calcium-Konzentration im Zytoplasma aus, was die Ca2+-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert daraufhin den Transkriptionsfaktor NFAT und NFAT wird in den Zellkern transportiert, wo es zusammen mit AP-1 und NF-B die Transkription des IL-2-Gens initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass VacA die Translokation von NFAT in den Kern durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität von Calcineurin verhindert. Dies hat zur Folge, dass NFAT-abhängige Gene, wie das IL-2- Gen oder das für CD25 codierende Gen, nicht abgelesen werden können. Dass Calcineurin ein geeignetes Zielmolekül ist, um eine Immunantwort zu unterdrücken, zeigen auch die medizinisch bedeutsamen Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Cyclosporin A. Beide V Zusammenfassung 91 Substanzen verursachen durch Hemmung von Calcineurin eine starke Immunsuppression. In DNA-Microarray-Analysen wurde untersucht, ob VacA einen ähnlich drastischen Effekt auf die Funktion der T-Zellen hat wie FK506. Dabei zeigte der Vergleich der Genexpression von VacA- und FK506-behandelten T-Zellen, dass VacA eine Untergruppe der Gene, die auch von FK506 reprimiert werden, herunterreguliert, wie z.B. die Gene für die Zytokine Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1, MIP-1, Single C Motif-1 (SCM-1) und SCM- 1. VacA scheint also die Genaktivität von T-Zellen ähnlich wie FK506 zu modulieren, was auf einen ähnlichen Mechanismus, nämlich die Calcineurin-Hemmung schließen lässt. Da das VacA-Toxin ein sekretiertes Protein ist, das auch in den tieferen Schichten des Magengewebes nachgewiesen werden kann, erreicht H. pylori nicht nur die vereinzelt im Magenepithel vorkommenden T-Zellen, sondern auch die T-Zellen, die bei der Infektion in die Lamina propria, eine tiefere Schicht der Magenmukosa, einwandern. Durch die Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung und die Repression von Zytokin-Genen, die wichtig sind für die Modulation der Immunantwort, induziert H. pylori so vermutlich eine lokale Immunsuppression, die seine Eliminierung durch das Immunsystem verhindert und eine chronische Infektion des Magens ermöglicht. In einem zweiten Projekt wurde die Spaltung von CagA in ein 100 kD- und ein Tyrosinphosphoryliertes 40 kD- Fragment nach dessen Translokation in diverse Zelltypen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung nicht nur in Makrophagen, sondern auch in dendritischen Zellen und in T-Zellen auftritt. Die Spaltung scheint von der Tyrosin-Phosphorylierung des CagA-Proteins und von Calcium abhängig zu sein. Dabei wurde die Ca2+-abhängige Protease Calpain in einem in vitro-Ansatz als ein CagAprozessierendes Enzym identifiziert. Auch in Makrophagen kann die Spaltung von CagA in P100 und P40P-Tyr durch den Calpain-Inhibitor Calpeptin verhindert werden. Die Tatsache, dass transloziertes CagA in allen getesteten eukaryontischen Zelltypen außer der Magenepithelzellinie AGS prozessiert wird, deutet darauf hin, dass diese Prozessierung eine biologische Bedeutung hat.

Das Endometrium stellt ein komplexes Gewebe dar, das sehr genauen Kontrollmechanismen unterliegt. Die zyklischen Veränderungen und damit auch die Vorbereitung auf die Implantation einer Blastozyste werden durch verschiedene Faktoren reguliert. Hierzu gehören endokrine Mechanismen, vermittelt durch die Steroidhormone Östradiol und Progesteron, die Abstimmung des Immunsystems und die Anpassung der Gefäßversorgung. So spielen sowohl eine Vielzahl an Zytokinen als auch Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel VEGF, eine entscheidende Rolle. Das Ziel unserer Untersuchung war eine genauere Betrachtung der Regulationsmechanismen im endometrialen Zellverband anhand von Zellkulturen, durch Immunhistochemie sowie durch Analyse des Uterussekretes. IL-6, ein gut bekanntes Phospho-Glykoprotein, wird im endometrialen Gewebe sowohl von Epithel- als auch von Stromzellen produziert. IL-6 erfüllt im menschlichen Organismus vielfältige Funktionen. Eine entscheidende Rolle scheint ihm bei Entstehung und Erhalt einer frühen Schwangerschaft zuzukommen. IL-6 zeigt ein typisches Verteilungsmuster im Menstruationszyklus mit niedrigen Spiegeln in der Proliferationsphase und einem deutlichen Anstieg in der Sekretionsphase. Bei den zyklischen Veränderungen des Endometriums ist die Revaskularisierung des Gewebes und deren Regulation durch VEGF ein entscheidender Prozess. VEGF existiert in fünf Isoformen, die durch alternatives Spleißen der mRNA entstehen. Es kann sowohl in Stroma- wie auch in Epithelzellen nachgewiesen werden. Im Vergleich zur Proliferationsphase tritt VEGF ebenso wie IL-6 verstärkt in der Sekretionsphase auf. Dieses Verhalten konnte von uns mit Hilfe der Immunhistochemie bestätigt werden. Im Uterussekret steigt die VEGF-Konzentration im Verlauf des Zyklus an. Diese Tatsachen legen eine Regulation von IL-6 und VEGF durch die Steroidhormone 17ß-Östradiol und Progesteron nahe. Das Verhalten von Interleukin-6 in Bezug auf die Stimulation durch die Steroidhormone 17ß-Östradiol und Progesteron wird in der Literatur widersprüchlich dargestellt. So wird zum einen die Erhöhung der IL-6-Konzentration in endometrialen Stroma- und Epithelzellen beschrieben, zum anderen deren Abfall. In den von uns angelegten Versuchen konnte keine statistisch signifikante Änderung von IL-6 durch Östradiol oder Progesteron festgestellt werden. Einige vorhergehende Studien legten die Regulation von VEGF durch Östradiol und Progesteron nahe. Jedoch scheint es keinen direkten Weg der Regulation durch diese Faktoren zu geben. Östrogen verstärkte den mitogenen Effekt von parallel applizierten Wachstumsfaktoren, Progesteron inhibierte diesen. In endometrialen Stroma- und Epithelzellkulturen wurde die Stimulation von VEGF durch Östrogen von anderen Autoren nachgewiesen. Diese Stimulation konnte von uns nicht bestätigt werden. Es stellt sich die Frage, ob eine indirekte Beeinflussung von VEGF durch andere auto- beziehungsweise parakrine Mechanismen vorliegt. Unser Ziel war es nun, die Regulation von IL-6 und VEGF durch andere Faktoren, wie beispielsweise Zytokine, zu untersuchen. IL-1ß erweist sich in diesem Zusammenhang als relevant. Es zeigt ein zyklisches Verhalten im Endometrium mit hohen Spiegeln in der Sekretionsphase zur Zeit der Implantation. Gleichzeitig steigt auch seine Serumkonzentration an. IL-1ß stimuliert IL-6 in endometrialen Stromazellkulturen, nicht jedoch in Epithelzellen. Eine Stimulation von VEGF durch IL-1ß konnte von uns nicht festgestellt werden. Ein weiterer bedeutender Faktor, der von uns genauer untersucht werden sollte, war LIF. LIF erfüllt breite biologische Funktionen, was die Vielzahl an Zielzellen im menschlichen Organismus verdeutlicht. Auch im Endometrium spielt LIF vor allem bei der Implantation eine entscheidende Rolle. Die von uns untersuchte Regulation von VEGF und IL-6 durch LIF erbrachte kein signifikant positives Ergebnis. So konnte eine Stimulation durch LIF weder in Stroma- noch in Epithelzellkulturen nachgewiesen werden. Des weiteren analysierten wir die Regulation von VEGF durch IL-6. Auch hier zeigte sich weder in den Stroma- noch in den Epithelzellkulturen eine statistisch erfassbare Veränderung. Unter verringerter Sauerstoffversorgung finden im Zellverband bestimmte Veränderungen statt, die eine optimale Anpassung an die veränderten Umweltbedingungen ermöglichen. Die Hypoxie erweist sich als relevanter Faktor für eine gesteigerte Produktion von Interleukin-6 in verschiedenen Zelltypen. Es wurde gezeigt, dass sowohl endometriale Stroma- als auch Epithelzellen auf ein verringertes Sauerstoffangebot im Sinne einer IL-6 Erhöhung reagieren. Auch VEGF wird in endometrialen Stroma- und Epithelzellkulturen durch eine Reduktion des Sauerstoffangebots induziert. Hierbei kann man eine deutlichere Steigerung von VEGF in Stroma- als in Epithelzellkulturen beobachten. Unsere Versuchsansätze an Zellkulturen, am Uterussekret und an Endometriumsschnitten haben einen Beitrag zum genaueren Verständnis der Regulationsmechanismen im endometrialen Zellverband geleistet. Die Komplexität der Abläufe jedoch erfordert weiterhin intensive Forschungsarbeit in vivo sowie in vitro, um einen vollständiges Bild des Endometriums zu vermitteln. In diesen Erkenntnissen liegt die Chance, Therapieansätze für einige Erkrankungen, wie zum Beispiel Endometriose oder auch Infertilität zu entwickeln.

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.