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Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Für das Überleben von Bacillus subtilis ist eine verlässliche Überwachung der Integrität der Zellhülle essentiell, um diese zu schützen und bei Schäden adäquat zu reagieren. Neben den ECF � Faktoren spielen Zwei-Komponenten-Systeme (2KS) in der Zellhüllstressantwort von B. subtilis eine zentrale Rolle. Eines dieser Systeme, das LiaRS- 2KS reagiert auf eine große Anzahl verschiedener Zellwand-Antibiotika sowie andere zellhüllstress-auslösende Substanzen. Die zelluläre Funktion und Rolle des Lia-Systems konnte bisher nicht genau definiert werden. In der hier vorliegenden Dissertation wurde das Lia-System erstmals hinsichtlich seiner funktionalen Rolle in B. subtilis untersucht. Im ersten Teil der Ergebnisse wurde eine detaillierte Analyse der LiaR-vermittelten Zellhüllstressantwort in B. subtilisvorgenommen. Transkriptom-Studien dienten zur Identifizierung des LiaR-Regulons. Hierbei wurde die Genexpression des Wildtyps mit zwei Mutanten, die den „ON“ (�liaF) und „OFF“ (�liaR) Zustand des Lia-Systems repräsentierten, verglichen. Von den dabei identifizierten drei potentiellen LiaR-Zielloci (liaIH, yhcYZ-ydhA, ydhE) konnten durch anschließende Folgeuntersuchungen nur die Gene liaI und liaH als in vivo relevante Zielgene für LiaR verifiziert werden. Umfangreiche phänotypische Analysen zeigten, dass �liaIH-Mutanten nur schwach sensitiv auf einige Antibiotika sowie oxidativen Stress reagierten. Ebenso vermittelt eine Überexpression von LiaH in einer �liaF-Mutante keine Resistenz gegenüber stressauslösenden Substanzen. LiaH gehört zur Familie der Phagenschock-Proteine. Weitere Mitglieder dieser Familie sind PspA aus Escherichia coli und Vipp1 aus Arabidopsis thaliana, die große oligomere Ringstrukturen bilden. Die strukturelle Untersuchung von LiaH ergab, dass auch dieses Protein große Ringe bildet (>1MDa). Der zweite Ergebnisteil befasst sich mit der Untersuchung der Stimuluswahrnehmung der Zellhüllstress-detektierenden Systeme in B. subtilis. Die Zellhüllstressantwort auf das Antibiotikum Bacitracin wurde hierbei mittels �-Galaktosidase-Assay sowie Western Blot- Analyse erforscht. Das Bce-System reagiert dabei am stärksten und spezifischsten auf Bacitracin-Stress. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der ABC-Transporter BceAB essentiell für die Stimuluswahrnehmung ist und dass das Bce-System an sich eine Resistenzdeterminante in B. subtilis darstellt. Das Lia-System hingegen wird erst bei höheren Bacitracin-Konzentrationen induziert. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Bce-System Bacitracin direkt wahrnimmt (drug sensing) und das LiaSystem in indirekter Weise auf Zellhüllstress ausgelöst durch Bacitracin reagiert (damage sensing). Im dritten Teil der Ergebnisse wurdendie zelluläre Lokalisation von LiaI, LiaH und LiaG sowie die Beziehung der Proteine untereinander mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und biochemische Ansätze untersucht. Die Membranproteine LiaI und LiaG sind unter Stressbedingungen in der Zellmembran lokalisiert. LiaH, ein cytoplasmatisches Protein verändert unter Stressbedingungen seine Lokalisation vom Cytoplasma an die Membran. Die Funktion von LiaH scheint sich also an der Zellmembran zu vollziehen, wobei LiaI als Interaktionspartner identifiziert wurde. Da in einer �liaI-Mutante LiaH unter Stressbedingungenebenfallsnoch an die Zellmembran assoziert ist, wurde nach weiteren Interaktionspartnern von LiaH gesucht. Eine umfangreiche bacterial-two-hybrid-Analyse ergab, dass sowohl LiaH als auch LiaI und LiaG in ein Interaktionsnetzwerk eingebettet sind, in welchem das bisher uncharakterisierte Protein YvlB eine Schlüsselrolle spielt.Die ebenso in dieses Netzwerk involvierten Proteine YjoB, DnaK und HtpG üben als Proteasen/Chaperone Funktionen in der Faltung und Degradierung von Proteinen aus. Ein Zusammenspiel des Lia-Systems und des Schlüsselproteins YvlB mit den Proteasen/Chaperonen als Reaktion auf Zellhüllstress ist denkbar. Die Phagenschock-Homologe PspA in Streptomyces lividans und E. coli üben einen erheblichen Einfluss auf die Proteinsekretion sowie die elektronenmotorische Kraft der Zelle aus. Daher wurde im letzten Teil der Ergebnisse die Rolle von LiaH in der Proteinsekretion sowie im Energiestoffwechsel näher analysiert. Ein Einfluß des Lia- Systems in der Aufrechterhaltung der elektronenmotorischen Kraft der Zelle konnte nicht bestätigt werden. Durch die Analyse des Sekretoms in B. subtilis konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Proteom einer �PliaI-liaIH-Mutante im Vergleich zum Wildtyp signifikante Veränderungen in der Komposition aufwies.So wurde im Sekretom der �PliaIliaIH- Mutante vor allem das Zellwand-assoziierte Protein WapAidentifiziert, welches im Wildtyp oder in einer �liaF-Mutante nicht auftrat. Das Lia-System beeinflußt somit auch die Proteinsekretion von B. subtilis, wobei die molekularen Mechanismen noch unbekannt sind.

Blutgerinnung und Entzündung sind zwei stark miteinander verknüpfte Vorgänge im menschlichen Körper. Es ist gängige Meinung, dass während einer Sepsis die systemische Entzündung unweigerlich zu einer Aktivierung des Gerinnungssystems und einer gleichzeitigen Inhibition des blutgerinnungshemmenden Systems sowie der Fibrinolyse führt. Durch die massive Aktivierung der Gerinnung kommt es zu einer sogenannten Verbrauchskoagulopathie, bei der vor allem die antikoagulatorische Kapazität stark reduziert ist. So ist die Aktivität von ATIII und APC, zwei der wichtigsten körpereigenen Gerinnungsinhibitoren, während der Sepsis erheblich vermindert. Rekombinant hergestelltes APC hat als Xigris® seit 2002 die europäische Zulassung zur Behandlung der schweren Sepsis. In einer klinischen Studie der Phase 3 wurde eine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit durch die Gabe von APC bei Patienten mit schwerer Sepsis festgestellt. Im Gegensatz zu APC zeigte ATIII in einer Studie der Phase 3 an Patienten mit schwerer Sepsis keine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit. Es ist generell akzeptiert, dass das septische Mehrorganversagen durch die systemische Immunantwort des Organismus auf eine Infektion und die daraus resultierende überschießende systemische Freisetzung inflammatorischer Mediatoren vermittelt wird. Die Freisetzung dieser Mediatoren erfolgt unter anderem aus Monozyten. Durch den entzündlichen Stimulus während einer Verletzung oder Sepsis wird auf Monozyten neben der Freisetzung von Zytokinen auch TF induziert, der Rezeptor und Aktivator von FVII. Der Komplex aus TF und FVIIa stellt den Anfangspunkt der exogenen Gerinnung dar. Seit einigen Jahren wird rFVIIa als „rescue therapy“ zur Kontrolle schwerer traumatisch verursachter Hämorrhagien diskutiert. Dabei soll durch die Gabe von rFVIIa die Gerinnung spezifisch am Ort der Verletzung verstärkt werden. Da durch das Trauma und die damit verbundene Entzündungsreaktion Monozyten vermutlich TF exprimieren, stellen auch diese Zellen einen potentiellen Angriffspunkt für rFVIIa dar. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war, mögliche gerinnungsunabhängige immunmodulatorische Eigenschaften dieser, in der Intensivmedizin verwendeten, körpereigenen Substanzen zu untersuchen. Im Speziellen sollte die Auswirkung der Pro- bzw. Antikoagulantien auf die LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von Monozyten untersucht werden, ein wichtiger Bestandteil in der Entstehung von Sepsis und MODS. Dazu wurde ein Versuchsmodell mit einer humanen, monozytären Zelllinie, MonoMac6, etabliert. Die Produktion von IL-1β, IL-8 und TNFα wurde intrazellulär mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Im Zellkulturüberstand wurden die Konzentrationen von IL-1β, IL-8, IL-10 und TNFα mit einem Luminex-100 System gemessen. Zusätzlich wurde für rFVIIa der Einfluss auf die LPS-induzierte IL-1β-, IL-6-, IL-8- und TNFα-Synthese von CD14+ Monozyten in PBMCs durchflusszytometrisch erfasst. In der vorgelegten Arbeit konnte eine limitierende Wirkung von APC und ATIII auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten festgestellt werden. APC verminderte die IL-1β-, IL-10- und TNFα-Ausschüttung signifikant, wobei Überstandsmessungen die eindeutigsten Ergebnisse zeigten. Der Effekt von ATIII ließ sich durchflusszytometrisch besser bestimmen, als aus dem Überstand. Es zeigte sich eine signifikant verminderte LPS-induzierte IL-1β- und TNFα-Produktion der Monozyten. Zusätzlich wurde der Effekt von Heparin auf die ATIII-Wirkung untersucht, da es mehrere Hinweise auf eine negative Beeinflussung der ATIII-Therapie in der Sepsis durch gleichzeitige Gabe von Heparin gibt. In der vorgelegten Arbeit konnte interessanter Weise kein antagonisierender Effekt von Heparin auf die immunologische Wirkung von ATIII festgestellt werden. Neben dem positiven Effekt durch die Wiederherstellung der Antikoagulation während der Sepsis, kann APC auch zur Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen Pro- und Antiinflammation beitragen. APC vermindert sowohl die Synthese pro-, als auch die antiinflammatorisch wirkender Mediatoren, was eine Erklärung für die Wirksamkeit bei dem sehr heterogenen Kollektiv der Sepsispatienten sein könnte. ATIII reduziert nach unseren Ergebnissen lediglich die Synthese der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β, nicht aber die von IL-10. Geht man davon aus, dass APC deshalb wirksam ist, weil es sowohl eine überschießende Pro- als auch Antiinflammation dämpfen kann, wäre das eine Erklärung für das Fehlen des klinischen Wirksamkeitsnachweises für ATIII bei Patienten mit schwerer Sepsis. Für rFVIIa ergab sich ein messbarer, aber nicht eindeutig charakterisierbarer immunmodulatorischer Effekt auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten. Bei MonoMac6 Zellen zeigte sich ein leicht begrenzender Effekt auf die IL-8- und TNFα-Produktion. Die Behandlung von PBMCs mit rFVIIa ergab keine veränderte LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von CD14+ Monozyten. In verschiedenen Versuchsabläufen wurden MonoMac6 Zellen zur Erhöhung der TF-Expression vor der Inkubation mit rFVIIa mit TNFα oder LPS behandelt. Dabei zeigte sich je nach Messmethode und Vorbehandlung außer einer geringen Steigerung der TNFα-Synthese LPS-vorbehandelter Monozyten kein Effekt. Zusätzlich wurde eine Transfektion der MonoMac6 Zellen mit TF durchgeführt. In Versuchen mit dieser Zelllinie ergab sich eine erhöhte TNFα-Synthese unter rFVIIa-Einfluss. Dieses Ergebnis ist jedoch mit Vorsicht zu betrachten, da die Reaktion der transfizierten Zellen auf LPS alleine im Kontrollexperiment nicht der des Wildtyps entsprach. Eine rFVIIa-induzierte Bildung von Thrombin kann ebenfalls in die Immunreaktion eingreifen, dies illustriert die in der vorgelegten Arbeit unter Thrombineinfluss gemessene, stark verminderte LPS-induzierte IL-10 Ausschüttung. Allerdings konnte der direkte immunmodulatorische Effekt von rFVIIa weder mit der Komplexbildung aus TF und rFVIIa noch mit der von rFVIIa vermittelten Produktion von Thrombin in Verbindung gebracht werden. Die immunmodulatorische Wirkung von rFVIIa auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten konnte mit den in der vorgelegten Arbeit verwendeten Modellen nicht abschließend geklärt werden und lässt noch viel Raum für weitere Untersuchungen. Transfektionsversuche mit anderen monozytären Zelllinien oder die Selektion von TF-exprimierenden Immunzellen aus kritisch kranken Patienten wären mögliche Versuchsansätze für die Zukunft. Auch ein geeigneter Stimulus zur Induktion von TF auf isolierten humanen Monozyten, der nicht gleichzeitig die Zytokinsynthese anregt, würde vielversprechende Möglichkeiten bieten.

Die Bakteriophagen Integrase PhiC31 stellt ein viel versprechendes Werkzeug zur Integration genetischen Materials im nicht viral-basierten Gentransfer dar. Die PhiC31 Integrase vermittelt die Rekombination von spezifische Erkennungssequenz attB enthaltenden Plasmiden mit natürlich vorkommenden attP Erkennungssequenzen innerhalb des Zielgenoms mit unterschiedlicher Integrationsfrequenz und -spezifität. Nebeneffekte der Integration in Form von insertioneller Mutagenese, wie z.B. große Deletionen und chromosomale Veränderungen im Genom der Zielzelle konnten beobachtet werden. Ziel dieser Dissertation war, die PhiC31 vermittelte Effizienz zu verbessern und die Spezifität zu adressieren. Als Ansatz wurde die Mutagenese der DNA-Bindungsdomäne der Integrase basierend auf Punktmutanten zur verbesserten Integrationseffizienz gewählt. Integrationsassays wurden in verschiedenen humanen Zelllinien durchgeführt. Etablierung von Doppelmutanten, sowie Dosisoptimierung des Integrase kodierenden Plasmids verbesserten die Integrationseffizienz mehr als dreifach, verglichen mit der Wildtypintegrase in den Zelllinien HeLa und HCT. Weitere Assays verglichen die Exzisionsaktivität der Integrasemutanten mit dem Wildtyp. Bei fünf Mutanten wurde eine etwa zweifach erhöhte Exzision gefunden. Die Beurteilung der Spezifität der Integrasemutanten erfolgte durch Substitution der Wildtyp-attP Sequenz mit drei Pseudo attP Erkennungssequenzen des Reporterplasmids, deren erhöhte Spezifität bereits dokumentiert war. Einzelne Mutanten zeigten eine zweifach erhöhte Exzisionsaktivität. Die Rekombinationsaktivität von Integrasemutanten wurde im Kontext chromosomaler DNA mittels einer stabil GFP-exprimierenden Reporterzelllinie, in der die eGFP Expression mittels Integrase-vermittelter „Raus-Rekombination“ eines polyA Stoppsignals angeschaltet wird, untersucht. Auf chromosomaler Ebene wurde keine verbesserte Ausschneidungsaktivität erreicht. Zur Evaluierung der in vivo Effizienz zweier ausgewählter PhiC31 Integrasemutanten, die in vitro erhöhte Integrationsaktivität aufwiesen, wurden zwei Plasmide am C57BL/6 Mausmodell getestet. Reportergen war ein für den humanen Koagulationsfaktor IX kodierendes Gen. In Abhängigkeit von der Integrationseffizienz der Mutanten und des Wildtyps, wurden im Zeitraum von einhundert Tagen ähnliche Expressionslevel gefunden. Die Mutanten zeigten keine Verbesserung der Langzeitexpression von humanem Faktor IX. Die hier durchgeführten Studien zur Mutationsanalyse der Phagenintegrase PhiC31 zeigten einen wirksamen Ansatz zur Verbesserung der PhiC31 Integrase-vermittelten Integrationseffizienz in vitro.

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) ist ein 12,5 kDa großes Protein, das als Homotrimer in fast allen Körpergeweben konstitutionell exprimiert wird und proinflammatorische wie wachstumsregulierende Eigenschaften aufweist. Die experimentelle Datenlage über die Wirkmechanismen von MIF zeigen, dass MIF sowohl extrazelluläre Wirkung als Zytokin/Chemokin wie auch eine intrazelluläre Wirkung als Regulator von Ubiquitylierung und proteasomaler Aktivität oder als Enzym mit Tautomerase-Aktivität besitzt. Für alle Mechanismen ist ein Einfluss von MIF auf Wachstumsregulation beschrieben. Die Evidenz für MIF als Tautomerase ist allerdings schlecht belegt und es wird diskutiert, ob dies ein Artefakt oder ein Relikt aus evolutionären Vorformen von MIF ist. Ziel dieser Arbeit ist es, über genetisch modifizierte Mäuse, die entweder eine komplette Deletion des MIF-Gens (MIF Knock-Out-Maus) oder eine Punktmutation mit Verlust der Enzymaktivität tragen, die funktionelle Rolle von MIF bei der Hauttumorgenese zu bestimmen und zu testen, ob die Tautomerase-Aktivität von MIF von funktioneller Relevanz bei der Tumorgenese ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Abwesenheit von MIF in der murinen Haut während der chemischen One Stage-Karzinogenese mit Benzo[α]pyren zu verstärkter Tumorbildung führt. Der Verlust von Prolin 1 und damit der Tautomeraseaktivität alleine führt zu einem Phänotyp, welcher zwischen dem des Knock-Outs und dem des Wildtyps liegt. Dies weist daraufhin, dass Prolin 1 oder alternativ die Tautomeraseaktivität eine wichtige biologische Rolle für die Funktion von MIF bei der malignen Transformation von Keratinozyten spielt.

In der vorliegenden Arbeit wurde basierend auf der genotypischen Charakterisierung von Stämmen des Mycobacterium tuberculosis - Komplexes anhand des gyrA-Gens mit Hilfe einer auf dem LightCycler® System basierenden gyrA Real-time-PCR ein neuartiges Testverfahren zur Bestimmung von Chinolonresistenzen konzipiert und etabliert. Bei der Evaluierung des Testverfahrens mit 13 phänotypisch resistenten Stämmen mit einer MHK ≥ 4 µg/ml für Ciprofloxacin zeigten 9 Stämme bei der Schmelzpunktanalyse einen eine Mutation anzeigenden Shift des Tm’s, 2 weitere wiesen die typische Schmelzkurve einer Heteroresistenz auf. Die Sequenzierung ergab, dass 5 dieser Stämme eine Mutation des Codon 90 (Ala→Val, GCG→GTG) und 6 Stämme eine Mutation des Codons 94 (Asp→Gly, GAC→GGC) aufwiesen. Die beiden verbliebenen Stämme hatten den Schmelzpunkt des Wildtyps, der durch die Sequenzierung bestätigt werden konnte. Die molekularepidemiologische Unabhängigkeit der resistenten Stämme wurde durch das IS6110 Fingerprinting bestätigt. 44 phänotypisch sensible Stämme wiesen ebenfalls den Tm des Wildtyps auf. Damit besitzt das Testverfahren für den Nachweis von Chinolonresistenzen eine Sensitivität von 85% und eine Spezifität von 100%. Die Speziesspezifität wurde anhand von 7 typischen und 16 atypischen Mykobakterien sowie humanen DNA-Präparationen und Sputumproben überprüft, wobei sich eine Amplifikation nur bei Mitgliedern des M.tb. - Komplexes fand. Das Testverfahren ist somit hochspezifisch für den Mycobacterium tuberculosis - Komplex. Der Test wurde für die Bestimmung von der Primärkultur und für den Direktnachweis aus dem Sputum evaluiert. Der Nachweis von Mykobakterien direkt aus dem Sputum mit dem Testverfahren ist mit 103 KBE/ml eine Größenordnung sensitiver als die Mikroskopie. Das Testergebnis liegt in der Regel innerhalb eines Tages vor. Für die Testdurchführung und die Testauswertung wurden Standardprotokolle erstellt. Anhand einer kritischen Evaluation der Primärliteratur konnte gezeigt werden, dass eine hohe Konkordanz von über 90% zwischen höhergradigen Chinolonresistenzen (MHK ≥ 4 µg/ml) und Mutationen des gyrA-Gens besteht. Die Informationen aus der phänotypischen und der genotypischen Resistenztestung sollte genutzt werden, um die beiden Verfahren gegenseitig zu evaluieren. So sprechen die bisherigen molekularbiologischen Daten für den von der WHO vorgeschlagenen Grenzwert von >2µg/ml bei der phänotypischen Resistenzbestimmung. Anhand von klinischen Studien sollte die Grenzwertsetzung überprüft und vor allem der Nutzen der Techniken für den Patienten evaluiert werden. Chinolone haben eine stark zunehmende Bedeutung bei der Behandlung der Tuberkulose und werden bisher vor allem bei der Behandlung der MDR-Tuberkulose eingesetzt. In mehreren klinischen Studien wird derzeit auch der Einsatz von Gyrasehemmern der neusten Generation als Standardmedikament untersucht. Hiervon verspricht man sich insbesondere eine Verkürzung und eine bessere Verträglichkeit der Therapie. Sollten sich die Chinolone als First Line Medikament zur Behandlung der Tuberkulose durchsetzten, könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte auf dem LightCycler® System basierende gyrA Real-time-PCR aufgrund der schnellen Resistenzbestimmung innerhalb eines Tages dem Kliniker entscheidende Hinweise für die primäre Einleitung einer effektiven Therapie geben.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene physiologische Parameter hinsichtlich ihres Einflusses auf die Kolonisierungs- und Plasmidtransfereffizienz von P. chlororaphis SPR044 in der Rhizosphäre von A. thaliana zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden TnMod-Insertionsderivate mit Veränderungen "Quorum-Sensing"-regulierter Funktionen untersucht. Darüber hinaus sollten Auswirkungen von pJP4 auf die Fitness von SPR044 festgestellt werden. Weiterhin sollte eine Strategie zur in situ-Detektion plasmid-tragender Stämme in der Rhizosphäre entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Das natürliche Isolat P. chlororaphis SPR044 produzierte BHSL, 3-OH-OHSL und ein weiteres, bisher nicht identifiziertes Acyl-HSL. Alle drei Acyl-HSLs wurden ebenfalls von den PCN-negativen SPR044-Derivaten sowie vom PCN-Überproduzierer produziert, nicht jedoch von den "Quorum-Sensing"-negativen Derivaten. Entsprechend der regulatorischen Funktion der Acyl-HSLs zeigten quantitative Analysen eine Korrelation zwischen der Menge von produzierten Acyl-HSLs, antimikrobiellen Metaboliten und extrazellulären Proteasen. Die einzige Ausnahme bildete der PCN-Überproduzierer. Dessen PCN-Überproduktion basiert vermutlich auf einer Veränderung des LPS und nicht auf der Ausschaltung eines negativen Regulators. In Einzelkultivierungs-Experimenten zeigte sich nach 14 Tagen kein Unterschied zwischen den Populationsgrößen des Wildtyps und der Derivate. Nach 28 und 42 Tagen war die Population des Wildtyps gleich groß wie die des PCN-negativen Derivats und signifikant größer als die des gacS-negativen Derivats und des PCN-Überproduzierers. In Kokultivierungs-Experimenten war die Population des gacS-negativen Derivats hingegen stets gleich groß wie die des Wildtyps. Eine Erklärung dieses Phänomens konnte durch Untersuchung der Wachstumskinetiken in Flüssigkultur erbracht werden. Die "Quorum-Sensing"-negativen Derivate wiesen eine stark verkürzte Lag-Phase und eine reduzierte Produktion des für die stationäre Phase spezifischen Sigmafaktors Rpos auf. Dies führte nach Koinokulation mit anderen Bakterien offenbar zu einer Aufhebung des selektiven Nachteils. Vermutlich nutzen die gacS-negativen Stämme komplexe C-Quellen, die durch die Enzyme des Wildtyps zugänglich gemacht werden und profitieren darüber hinaus von der verkürzten Lag-Phase. Die Frequenz des konjugativen pJP4-Transfers von SPR044 zu R. eutropha ist unabhängig von "Quorum-Sensing"- und PCN-Produktion. Die Transformation mit pJP4 per se hatte keinen negativen Einfluss auf die Rhizosphäre-Kolonisierungseffizienz von SPR044. Lag jedoch zusätzlich abiotischer oder biotischer Stress vor, manifestierte sich die metabolische Last durch pJP4 in einer verringerten Populationsgröße. Dieser Effekt war unabhängig vom "Quorum-Sensing"-System und der PCN-Produktion von SPR044. VirB5 von A. tumefaciens assembliert in einer höhermolekularen Struktur, die durch Scherkräfte von der Zelle gelöst und mittels Ultrazentrifugation sedimentiert werden kann. Bei verschiedenen Reinigungsschritten wurde eine Kofraktionierung mit der Haupt-Piluskomponente VirB2 beobachtet. VirB5 ist somit eine Nebenkomponente des T-Pilus. Das homologe Protein TraC aus dem IncN-Plasmid übt vermutlich eine ähnliche Funktion in pKM101-determinierten Pili aus. Zellfraktionierung pJP4-tragender P. chlororaphis-Zellen und Detektion mit spezifischen Antiseren deuten darauf hin, dass TrbC und TrbF Haupt- und Nebenkomponente pJP4-determinierter Pili sind. Bei TrbH handelt es sich um ein membran-assoziiertes Lipoprotein. Die Detektion pJP4-tragender Bakterien aus der Rhizosphäre war mit den TrbF- und TrbH-spezifischen Antiseren in situ möglich. Das TrbF-spezifische Antiserum ermöglichte die Erkennung IncP-Plasmid-tragender Bakterien. Das TrbH-spezifische Antiserum ermöglichte eine zusätzliche Unterscheidung zwischen IncPa- und IncPß-Plasmid-tragenden Zellen. Eine Kombination der Immunfluoreszenz-Analyse mit FISH erwies sich als geeignet für die Detektion von pJP4-Transfer zwischen SPR044 und R. eutropha in der Rhizosphäre von A. thaliana.