Podcasts about a45 b b3

Die einzige Möglichkeit, Patienten mit Pankreaskarzinom zu heilen, besteht in einer möglichst frühzeitigen Diagnose und Operation. Nach einer kurativen Resektion versterben dennoch über 95% aller Patienten innerhalb der folgenden fünf Jahre an einem Rezidiv, was belegt, dass nach der Operation disseminierte Tumorzellen (DTZ) im Körper des Patienten verbleiben und deren Progression zu einem Rezidiv der Krebserkrankung führt. Beim Pankreaskarzinom wurde gezeigt, dass der Nachweis von DTZ mit dem Antikörper A45-B/B3 gegen Zytokeratin im Knochenmark und mit dem Antikörper Ber-EP4 gegen EpCAM im Lymphknoten mit einer schlechteren Prognose korreliert. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Einblicke in die Biologie von hämatogener und lymphogener Disseminierung beim Pankreaskarzinom zu erarbeiten. Zunächst wurde die Prävalenz von DTZ durch immunzytochemische Färbungen gegen die oben genannten epithelialen Marker bestimmt. Anschließend wurden die Zellen isoliert, ihre DNA amplifiziert und mit der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) auf numerische Aberrationen hin untersucht, welche mit den chromosomalen Veränderungen des Primärtumorkollektivs verglichen wurden. Diese Gegenüberstellung sollte ergründen, ob Ähnlichkeiten zwischen hämatogen disseminierten (H-DTZ), lymphogen disseminierten Tumorzellen (L-DTZ) sowie Primärtumoren (PT) bestehen und ob charakteristische Veränderungen für H-DTZ und L-DTZ existieren, welche möglicherweise im Rahmen der Disseminierung selektiert wurden. Die Prävalenz von DTZ bei Patienten mit nicht metastasiertem Pankreaskarzinom lag im Knochenmark bei 23,0% und im Lymphknoten bei 38,1%. Dieser Unterschied war nicht signifikant. Die genomische Analyse von DTZ und PT deckte auf, dass Primärtumore die höchste Anzahl an numerischen Aberrationen aufwiesen (Mittelwert: 12,8), gefolgt von den L-DTZ (Mittelwert: 9) und den H-DTZ (Mittelwert: 4,7). Zum anderen zeigten EpCAM-positive Zellen aus den Lymphknoten häufiger abnorme Karyotypen (78,3%) als Zytokeratin-positive Zellen aus dem Knochenmark (68,8%), während alle PT numerische Aberrationen aufwiesen. Die Häufigkeit von chromosomalen Gewinnen und Verlusten war unterschiedlich in den verschieden Gruppen und betrug bei H-DTZ 3,6 DNA-Gewinne und 1,1 DNA-Verluste, bei L-DTZ 4,5 DNA-Gewinne und 4,5 DNA-Verluste und bei PT 5,6 DNA-Gewinne und 7,2 DNA-Verluste pro analysierter Probe. Die Ähnlichkeitsanalyse numerischer Aberrationen der drei Kollektive zeigte, dass PT und insbesondere DTZ untereinander sehr heterogen sind. Charakteristische Veränderungen, die möglicherweise selektiert worden waren, wurden in erster Linie in PT gefunden, in geringerem Ausmaß auch in Tumorzellen aus Lymphknoten. Es handelte sich dabei in erster Linie um DNA-Verluste, wie zum Beispiel auf Chromosom 17 und 18, welche PT und L-DTZ gemeinsam waren und eine größere Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Gruppen im Vergleich zu PT und H-DTZ nahelegen. Andererseits konnten auch Aberrationen identifiziert werden, die charakteristisch für die jeweilige Gruppe waren. Insbesondere handelte es sich dabei bei H-DTZ um DNA-Gewinne von 5p und 15q und bei L-DTZ um DNA-Gewinne von 4p oder 19 beziehungsweise DNA-Verluste von 11q oder 12p. Häufige DNA-Gewinne und -Verluste auf den Chromosomen 1, 3 oder 22 waren kennzeichnend für die Gruppe der Primärtumore. In der Analyse gepaarter Proben desselben Patienten waren gemeinsame Aberrationen zwischen PT und H-DTZ nur in der Hälfte (3/6), zwischen PT und L-DTZ dagegen in allen der untersuchten Fälle (2/2) anzutreffen. Auch die Anzahl dieser gemeinsamen Veränderungen war bei letzteren größer (Anteil gemeinsamer Veränderungen zwischen a) PT und H-DTZ: 5,9%, 5,9%, 4,8% und b) PT und L-DTZ: 16,3%, 8,9%). Der Vergleich solcher Aberrationen zwischen den verschiedenen Patienten mit gepaarten Proben dagegen führte nicht zur eindeutigen Identifikation typischer Veränderungen, welche im Zusammenhang mit einer hämatogenen oder lymphogenen Disseminierung gesehen werden können. Eine Zunahme numerischer Aberrationen mit fortschreitender Tumorprogression im Primärtumor wurde für die meisten soliden Tumoren nachgewiesen. Auch bei der Progression der pankreatischen intraepithelialen Neoplasie zum Pankreaskarzinom ist die Akkumulation von genetischen Veränderungen zu beobachten. Vor diesem Hintergrund deuten die vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die Disseminierung ein frühes Ereignis im Rahmen der Progression des Pankreaskarzinoms ist. In sehr frühen Tumorstadien, welche möglicherweise von den Genomprofilen der DTZ im Knochenmark repräsentiert werden, sind in erster Linie DNA-Gewinne anzutreffen. Interessanterweise scheinen diese DTZ im Milieu des Knochenmarks keine Deletionen zu akkumulieren. Mit fortschreitender Tumorprogression kommt dagegen DNA-Verlusten eine zunehmend bedeutende Rolle zu, was in DTZ aus Lymphknoten sowie im Primärtumor zu beobachten ist. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage für eine Vielzahl weiterführender Fragestellungen, wie zum Beispiel die Identifikation der genetischen Veränderungen, die am Anfang der genetischen Progression stehen. Gerade diese Veränderungen könnten von allen Tumorzellen geteilt werden und somit ideale Zielstrukturen für neue Therapieansätze darstellen.

Fragestellung: Der Nachweis von CK+-KMM ist ein unabhängiger Prognosefaktor, der das primär auf den LK_Status ausgerichtete, aktuelle Tumorstaging beeinflussen könnte. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob CK+-KMM und LKM parallel nachweisbar und jeweils prognostisch Relevant sind. Methode: 300 KM-Aspirate und 1590 axilläre Level I LK von 150 nodal-negativer Patientinnen wurden mit monoklonalen anti-CK Antikörpern (A45-B/B3 und NCL-5D3) prospektiv analysiert und mit etablierten Prognosefaktoren verglichen. Die mediane Beobachtungszeit betrug 39 Monate Ergebnisse: CK+-KMM fanden sich bei 44/150 (29%)und CK+-LKM bei 13/150 (9%) Patientinnen. ein CK+-Befund korrelierte nicht mit den etablierten Prognosefaktoren. Der Nachweis von CK+-KMM war nicht mit locoregionären Rezidiven aber mit Fernmetastasierung und tumorabhängigen Tod assoziiert. Der immunzytochemische LKM-Nachweis hatte keine prognostische Bedeutung. In der multiarianten Analyse blieb die CK-Positivität des KM ein unabhängiger Prognosefaktor mit einer Hazard-Ratio von 6,1 für ein verkürztes Gesamtüberleben. Schlussfolgerung: Hämatogene, nicht jedoch lymphogene Mikrometastasierung scheint ein unabhängiger Prognosefaktor für nodal-negative Patientinnen zu sein. Dies könnte als Stratifizierungskriterium in adjuvanten Therapiestudien eingesetzt werden und zukünftige chirurgische Strategien beeinflussen.

Aufgrund fehlender Methoden wurde bis zum heutigen Zeitpunkt nur selten eine molekulargenetische Analyse von Einzelzellen durchgeführt. In vielen Bereichen aber, wie beispielsweise den Tumoren, ist sie von entscheidender Bedeutung. Das Auftreten eines genetisch heterogenen Musters in einem Tumor könnte die Suche nach krankheitsauslösenden oder -fördernden Veränderungen erschweren. Auch bei der Untersuchung von seltenen Zellen (so genannte „rare cell events“), z.B. bei einer minimalen residualen Tumorerkrankung sind geeignete Methoden zur Einzelzellanalyse notwendig, da nur wenig Material zur Verfügung steht. Ziel dieser Doktorarbeit war es, zwei molekulargenetische Analysemethoden zu etablieren, weiterzuentwickeln und in einer geeigneten Strategie bei der Untersuchung von disseminierten Tumorzellen bei fünf Mammakarzinomen einzusetzen. Im ersten Teil der Doktorarbeit erfolgte die Auswahl eines geeigneten Markierungssystems für die Identifizierung disseminierter Tumorzellen im Knochenmark. Die Benutzung des pan-Zytokeratin Antikörpers A45 B/B3 direkt konjugiert mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 oder FluorX zeigte in verschiedenen Testsystemen die besten Ergebnisse. Sowohl seine Spezifität als auch die Durchführbarkeit einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) war möglich. Anhand disseminierter Tumorzellen von Nierentumoren wurde die Möglichkeit einer Untersuchung mittels zweier Interphase FISH Ansätze überprüft. Die Hybridisierung der Zentromernahen YAC Sonden konnte auf dem Knochenmarksgewebe bei pan-Zytokeratin positiven Zellen nach Erproben mehrerer Protokolle nicht durchgeführt werden, allerdings war die Hybridisierung von Zentromersonden erfolgreich. Die Optimierung des veröffentlichten Protokolls zur Einzelzell CGH (C. Klein et al. 1999; N. Stöcklein et al.2002) war das zweite Ziel der Arbeit. Diese Optimierung war notwendig, weil sich das ursprünglich publizierte Protokoll als Artefakt anfällig herausstellte. Durch die in dieser Arbeit beschriebenen Protokollveränderungen konnte die für Einzelzell Analysen notwendige Reproduzierbarkeit erreicht werden. Als Testsystem wurde eine molekulargenetisch ausreichend charakterisierte und in ihren Veränderungen stabile Zelllinie gewählt (RCC-26). Die ersten Versuche zur Einzelzellanalyse zeigten Veränderungen in der Zelllinie, die in allen vorangegangenen Analysen mit etablierten Techniken (M-FISH und CGH) nicht gezeigt werden konnten. Eine Optimierung des Protokolls führte zu übereinstimmenden Ergebnissen von Einzelzell CGH, CGH und M-FISH. Anschließend konnte die Reproduzierbarkeit dieser Methode anhand der Zelllinie RCC-26 gezeigt werden. Die Anwendung beider Methoden zur Analyse von seltenen Zellen wurde mit der Untersuchung von fünf Mammakarzinomen dargelegt. Der Vergleich von Primärtumor und kultivierten disseminierten Tumorzellen ins Knochenmark zeigte im Rahmen der untersuchten Fälle gemeinsame molekulargenetische Veränderungen beider Tumorentitäten. Mit der Anwendung dieser neuen Methoden ist es möglich detaillierte Informationen über seltene Zellen zu erhalten und diese in den biologischen Kontext einzuordnen.