Podcasts about disseminierung

Die einzige Möglichkeit, Patienten mit Pankreaskarzinom zu heilen, besteht in einer möglichst frühzeitigen Diagnose und Operation. Nach einer kurativen Resektion versterben dennoch über 95% aller Patienten innerhalb der folgenden fünf Jahre an einem Rezidiv, was belegt, dass nach der Operation disseminierte Tumorzellen (DTZ) im Körper des Patienten verbleiben und deren Progression zu einem Rezidiv der Krebserkrankung führt. Beim Pankreaskarzinom wurde gezeigt, dass der Nachweis von DTZ mit dem Antikörper A45-B/B3 gegen Zytokeratin im Knochenmark und mit dem Antikörper Ber-EP4 gegen EpCAM im Lymphknoten mit einer schlechteren Prognose korreliert. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Einblicke in die Biologie von hämatogener und lymphogener Disseminierung beim Pankreaskarzinom zu erarbeiten. Zunächst wurde die Prävalenz von DTZ durch immunzytochemische Färbungen gegen die oben genannten epithelialen Marker bestimmt. Anschließend wurden die Zellen isoliert, ihre DNA amplifiziert und mit der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) auf numerische Aberrationen hin untersucht, welche mit den chromosomalen Veränderungen des Primärtumorkollektivs verglichen wurden. Diese Gegenüberstellung sollte ergründen, ob Ähnlichkeiten zwischen hämatogen disseminierten (H-DTZ), lymphogen disseminierten Tumorzellen (L-DTZ) sowie Primärtumoren (PT) bestehen und ob charakteristische Veränderungen für H-DTZ und L-DTZ existieren, welche möglicherweise im Rahmen der Disseminierung selektiert wurden. Die Prävalenz von DTZ bei Patienten mit nicht metastasiertem Pankreaskarzinom lag im Knochenmark bei 23,0% und im Lymphknoten bei 38,1%. Dieser Unterschied war nicht signifikant. Die genomische Analyse von DTZ und PT deckte auf, dass Primärtumore die höchste Anzahl an numerischen Aberrationen aufwiesen (Mittelwert: 12,8), gefolgt von den L-DTZ (Mittelwert: 9) und den H-DTZ (Mittelwert: 4,7). Zum anderen zeigten EpCAM-positive Zellen aus den Lymphknoten häufiger abnorme Karyotypen (78,3%) als Zytokeratin-positive Zellen aus dem Knochenmark (68,8%), während alle PT numerische Aberrationen aufwiesen. Die Häufigkeit von chromosomalen Gewinnen und Verlusten war unterschiedlich in den verschieden Gruppen und betrug bei H-DTZ 3,6 DNA-Gewinne und 1,1 DNA-Verluste, bei L-DTZ 4,5 DNA-Gewinne und 4,5 DNA-Verluste und bei PT 5,6 DNA-Gewinne und 7,2 DNA-Verluste pro analysierter Probe. Die Ähnlichkeitsanalyse numerischer Aberrationen der drei Kollektive zeigte, dass PT und insbesondere DTZ untereinander sehr heterogen sind. Charakteristische Veränderungen, die möglicherweise selektiert worden waren, wurden in erster Linie in PT gefunden, in geringerem Ausmaß auch in Tumorzellen aus Lymphknoten. Es handelte sich dabei in erster Linie um DNA-Verluste, wie zum Beispiel auf Chromosom 17 und 18, welche PT und L-DTZ gemeinsam waren und eine größere Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Gruppen im Vergleich zu PT und H-DTZ nahelegen. Andererseits konnten auch Aberrationen identifiziert werden, die charakteristisch für die jeweilige Gruppe waren. Insbesondere handelte es sich dabei bei H-DTZ um DNA-Gewinne von 5p und 15q und bei L-DTZ um DNA-Gewinne von 4p oder 19 beziehungsweise DNA-Verluste von 11q oder 12p. Häufige DNA-Gewinne und -Verluste auf den Chromosomen 1, 3 oder 22 waren kennzeichnend für die Gruppe der Primärtumore. In der Analyse gepaarter Proben desselben Patienten waren gemeinsame Aberrationen zwischen PT und H-DTZ nur in der Hälfte (3/6), zwischen PT und L-DTZ dagegen in allen der untersuchten Fälle (2/2) anzutreffen. Auch die Anzahl dieser gemeinsamen Veränderungen war bei letzteren größer (Anteil gemeinsamer Veränderungen zwischen a) PT und H-DTZ: 5,9%, 5,9%, 4,8% und b) PT und L-DTZ: 16,3%, 8,9%). Der Vergleich solcher Aberrationen zwischen den verschiedenen Patienten mit gepaarten Proben dagegen führte nicht zur eindeutigen Identifikation typischer Veränderungen, welche im Zusammenhang mit einer hämatogenen oder lymphogenen Disseminierung gesehen werden können. Eine Zunahme numerischer Aberrationen mit fortschreitender Tumorprogression im Primärtumor wurde für die meisten soliden Tumoren nachgewiesen. Auch bei der Progression der pankreatischen intraepithelialen Neoplasie zum Pankreaskarzinom ist die Akkumulation von genetischen Veränderungen zu beobachten. Vor diesem Hintergrund deuten die vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die Disseminierung ein frühes Ereignis im Rahmen der Progression des Pankreaskarzinoms ist. In sehr frühen Tumorstadien, welche möglicherweise von den Genomprofilen der DTZ im Knochenmark repräsentiert werden, sind in erster Linie DNA-Gewinne anzutreffen. Interessanterweise scheinen diese DTZ im Milieu des Knochenmarks keine Deletionen zu akkumulieren. Mit fortschreitender Tumorprogression kommt dagegen DNA-Verlusten eine zunehmend bedeutende Rolle zu, was in DTZ aus Lymphknoten sowie im Primärtumor zu beobachten ist. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage für eine Vielzahl weiterführender Fragestellungen, wie zum Beispiel die Identifikation der genetischen Veränderungen, die am Anfang der genetischen Progression stehen. Gerade diese Veränderungen könnten von allen Tumorzellen geteilt werden und somit ideale Zielstrukturen für neue Therapieansätze darstellen.

Die Ermittlung von molekularbiologischen Faktoren, die mit dem Ovarialkarzinom assoziiert sind, kann für die Beurteilung der Prognose und die Wahl der optimalen Therapie der Patientinnen sehr hilfreich sein. In dieser Arbeit wurde die prognostische Bedeutung der Disseminierung von Tumorzellen ins Knochenmark und der HER-2/neu (Human Epidermal Growth factor receptor-2) Proteinüberexpressions- und Genamplifikationsrate in Ovarialkarzinomzellen mittels Immunhistochemie und Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung untersucht.

Trotz erfolgreicher Resektion des Primärtumors sterben bis heute ca. 40% aller Brustkrebspatientinnen an den Folgen der Metastasierung. Inzwischen ist zunehmend anerkannt, dass wenige selektierte Tumorzellen für die Progression der Erkrankung und eine Therapie-Resistenz verantwortlich sind. Es ist deshalb fraglich, ob genomische Veränderungen, die zur Disseminierung führen, entdeckt werden können, wenn die Masse der Zellen eines heterogenen Primärtumors untersucht wird. Einzelne Tumorzellen disseminieren in ektope Organe, wie das Knochenmark, und gelten als die Vorläufer der metachronen Metastasen. Eine genetische Analyse dieser Zellen könnte zur Entdeckung neuer Zielstrukturen für adjuvante Therapien führen. Um genomweit und hochauflösend genomische Aberrationen identifizieren zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation ein Protokoll entwickelt, das Array-CGH-Analysen von einzelnen Zellen ermöglicht. Hierfür war es notwendig ein Verfahren zur Aufreinigung und Amplifikation von BAC-DNA zu entwickeln, die Bedingungen zur Array-Herstellung zu optimieren und ein Hybridisierungsprotokoll zu etablieren. Der daraufhin hergestellte, 3000 BAC-Klone umfassende 3K BAC-Array mit einer mittleren Auflösung von 1 Mb war bei der Analyse amplifizierter DNA aus Einzelzellen konventionellen BAC- und Oligonukleotid-Arrays überlegen. Bei Hybridisierungen von Einzelzell-DNA mit bekanntem Karyotyp wurde bei normalen Zellen ein balanciertes Profil, bei Einzelzell-DNA eines Patienten mit Trisomie 21 die zusätzliche Kopie des Chromosoms 21 und bei Einzelzell-DNA von T47D-Zellen der komplexe Karyotyp in Übereinstimmung mit der Literatur dargestellt. Zusätzlich wurden Kriterien zur Auswahl zuverlässig hybridisierender BAC-Klone identifiziert und ein Assay zur Vorhersage einer erfolgreichen Array-CGH Analyse von Einzelzell-Amplifikaten entwickelt. Bei der Untersuchung einzelner disseminierter Tumorzellen aus dem Knochenmark von Brustkrebspatientinnen wurden sowohl große Alterationen, die durch Metaphasen-CGH detektiert worden waren, als auch kleine zusätzliche Aberrationen zwischen 3,5 und 4,7 Mb Größe detektiert. Ausgewählte chromosomale Gewinne konnten durch eine qPCR unabhängig verifiziert werden. Der 3K BAC-Array erhöht die Auflösung der Metaphasen-CGH um den Faktor 10-30 und ist außerdem publizierten Verfahren zur Array-CGH mit Einzelzellen überlegen. Mit seiner Hilfe war eine hochauflösende Untersuchung gestreuter Methaphasen-CGH-negativer Tumorzellen möglich, was zur Identifizierung bislang unerkannter Veränderungen führte. Die Einzelzell-Array-CGH-Technologie ermöglicht nun die Charakterisierung mikrometastatischer Vorläuferzellen und damit neue Erkenntnisse über frühe Stadien der Krebserkrankung.

Der Prozess der Metastasierung, gerade in der frühen Phase, ist beim malignen Melanom noch unzureichend verstanden. In der vorliegenden Studie wurden einzelne disseminierte Melanomzellen aus Wächterlymphknoten mit der komparativen genomischen Hybridisierung auf genomische Veränderungen untersucht. Für ein Teil dieser disseminierten Tumorzellen standen die entsprechenden dazugehörigen Primärtumore zur Verfügung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, chromosomale Aberrationen disseminierter Melanomzellen aus Wächterlymphknoten mit den chromosomalen Aberrationen der dazugehörigen Primärtumore zu vergleichen. Die untersuchten einzelnen disseminierten Tumorzellen wiesen bezüglich chromosomaler Aberrationen zu ihren dazugehörigen Primärtumoren große Abweichungen auf. Dieses Ergebnis spricht für eine frühe Disseminierung von Tumorzellen, die sich anschliessend unabhängig vom Primärtumor entwickeln. Die oft nach einer vollständigen Resektion des Primärtumors beobachtete zeitlich verzögerte Entstehung von Fernmetastasen beim malignen Melanom, kann durch die frühe Disseminierung der Tumorzellen erklärt werden. Es gab Unterschiede in den genomischen Aberrationen zwischen disseminierten Melanomzellen aus Wächterlymphknoten, die histopathologisch als tumorfrei klassifiziert waren, und Tumorzellen, die bereits erfolgreich eine Lymphknotenmetastase gegründet hatten. Mit der Progression zum histopathologisch nachweisbaren Befall in den Wächterlymphknoten werden bestimmte genomische Veränderungen in den Tumorzellen beim malignen Melanom selektiert, die eine Expansion in manifeste Metastasen fördern. Diese Ergebnisse können nur als Ausgangspunkt für weiterführende Arbeiten zur Identifizierung von Tumorgenen sein, da die Auflösung der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) lediglich zehn Megabasen beträgt.

Bei Patienten mit malignen gastrointestinalen Tumoren kommt es auch nach erfolgter R0-Resektion des Primärtumors häufig in der Folgezeit noch zur Ausbildung von Fernmetastasen. Ursächlich hierfür sind disseminierte Tumorzellen, die sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Tumorentstehung vom Primärtumor absiedeln, anschließend jedoch in eine Art Ruhephase als „dormant cells“ fallen und erst zu einem späteren Zeitpunkt wieder in die Proliferationsphase eintreten. Hinsichtlich der Evaluation des Rezidivrisikos stellen diese disseminierten Zellen zwar einen unabhängigen Prognosefaktor dar, sind jedoch im Einzelfall mit bisher zur Verfügung stehenden Nachweismethoden nur unzureichend zu identifizieren. In dieser Arbeit haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein diagnostisches Verfahren zu entwickeln, das es uns einerseits erlaubt, disseminierte Tumorzellen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu charakterisieren und quantifizieren, andererseits dem Patienten eine permanente Verlaufskontrolle durch einen einfachen Zugang zu ermöglichen. Hierfür entwickelten wir eine quantitative Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), die hinsichtlich der Zielstruktur auf die außerordentlich spezifische Familie der Melanom-Antigen-Gene (MAGE)-A ausgerichtet war. Die Expression dieser Antigene konnte bisher in vielen verschiedenen Tumortypen nachgewiesen werden, nicht jedoch in nicht-tumorösen, adulten Geweben mit Ausnahme des Hodens. Eine hohe Sensitivität der Methode war durch die Identifikation einer Consensus-Sequenz der MAGE-A-Gene gewährleistet, wodurch wir in der Lage waren, unsere Primer so zu konstruieren, dass in einem Ansatz die MAGE-Subtypen A1-A6 gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Zum einen führten wir damit Zellverdünnungs-Experimente mit der Kolonkarzinom-Zelllinie HT 29 durch, bei denen jeweils 10 ml zentralvenöses Vollblut mit einer unterschiedlichen Anzahl HT 29-Zellen versetzt wurden. Ebenfalls wurden zur Kontrolle 14 Vollblutproben von Patienten ohne Tumorerkrankung aufgearbeitet. Zum anderen untersuchten wir 22 zentralvenöse prä- und postoperative Vollblutproben von Patienten mit operablen gastrointestinalen Tumoren und 19 intraoperativ gewonnene Peritoneallavagen auf das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen. Die Zellverdünnungs-Experimente erbrachten das Ergebnis, dass mit dem verwendeten Analyseverfahren das Vorhandensein von fünf einzelnen Tumorzellen in zehn Millilitern zentralvenösen Vollblutes nachgewiesen werden kann. Dies entspricht einer Empfindlichkeit des Nachweises von einer malignen Zelle in 107 bis 108 mononuklären Zellen. Alle 14 untersuchten Negativkontrollen wurden korrekt als MAGE-A-negativ identifiziert. Von den 22 Vollblutproben der Tumorpatienten konnte präoperativ bei 10 (= 45,5%), postoperativ bei 13 (= 59,1%) eine Disseminierung nachgewiesen werden. Fünf der 19 analysierten Peritoneallavagen erbrachten ein MAGE-A-positives Ergebnis. Dabei zeigte sich keinerlei Abhängigkeit der Disseminierung von der Tumorausdehnung (pT), der Lymphknotenbeteiligung (pN), Fernmetastasen (M), Grading (G), Tumortyp, Alter oder Geschlecht der Patienten. Ob und in welcher Art und Weise die Expression von MAGE-Genen möglicherweise Zellen überhaupt erst dazu befähigt, sich vom Primärtumor abzusiedeln und welchen Einfluss die Operation selbst am Auftreten einer Disseminierung maligner Zellen hat, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausreichend untersucht und sollte Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein. Hierfür haben wir ein hochsensitives und –spezifisches Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen entwickelt, auf dessen Grundlage es gelingen könnte, geeignete Patienten spezifischen adjuvanten Immuntherapiekonzepten mit MAGE als Zielstruktur zuzuführen und so das späte Auftreten von Metastasen zu verhindern.