Podcasts about hybridisierung fish

Thu, 10 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12679/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12679/1/Will_Armin.pdf Will, Armin ddc:6

Die Diagnose Brustkrebs betrifft jährlich etwa 55.150 Frauen in Deutschland. Das Mammakarzinom stellt somit die häufigste Krebsneuerkrankung und Krebstodesursache der Frau dar. Die Wahl der geeigneten Therapie wird für das metastasierte Mammakarzinom anhand des pathologisch untersuchten Gewebes des Primärtumors getroffen. Die Untersuchung der biologischen Marker von Fernund lokoregionären Lymphknotenmetastasen wird routinemäßig nicht durchgeführt. Dies beruht auf der Annahme, dass sich der histopathologische Charakter des Tumors in den Metastasen widerspiegelt, und sich selbst bei Metastasierung nach einigen Jahren nicht verändert. Die vorliegende Arbeit untersucht die Konkordanz des Expressionsverhaltens von HER-2/neu, Topoisomerase-II-α und den Hormonrezeptoren Östrogen- und Progesteronrezeptor in Geweben von Primärtumor und Lymphknotenmetastase von 121 Patientinnen mit mindestens einer ipsilateralen axillären Lymphknotenmetastase. Zusätzlich wird das Amplifikationsverhalten von HER-2/neu und Topoisomerase-II-α in den HER-2/neu überexprimierten Fällen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Chromogener in situ Hybridisierung analysiert. Die Tumorexzisionen sowie die Lymphknotendissektionen erfolgten im Rotkreuzklinikum – Frauenklinik – München, unter der Leitung von Prof. Dr. W. Eiermann in der Zeit zwischen Dezember 1999 und April 2002. Die immunhistochemischen Untersuchungen zeigen Ergebnisse von hoher Konkordanz (97,4% für Östrogenrezeptor, 96,6% für Progesteronrezeptor, 96,6% für HER-2/neu und 96,5% für Topoisomerase-II-α) zwischen Primärtumor und Lymphknotenmetastase. Die Fluoreszenz und Chromogene in situ Hybridisierung(FISH und CISH) zeigen sowohl für HER-2/neu als auch für Topoisomerase-II-α eine absolute (100%) Konkordanz zwischen Primärtumor und Lymphknoten. Bezüglich des HER-2/neu sind die Ergebnisse von FISH und CISH untereinander zu 100% konkordant. Im Gegensatz dazu detektiert CISH deutlich mehr Topoisomerase-II-α-amplifizierte Fälle als FISH (13 vs. 3). Eine Routine-Untersuchung der metastatischen Lymphknoten auf HER-2/neu ist trotz der hohen konkordanten Ergebnisse sinnvoll. Dies betrifft zwar nur einen geringen prozentualen Anteil im vorliegenden Kollektiv (2,6%), pro Jahr sind dies allerdings ca. 1400 Patientinnen in Deutschland. Weitere 1500 Patientinnen könnten von einer Hormonrezeptorbestimmung der Lymphknoten profitieren. Um eine Beurteilung des Stellenwertes der Topoisomerase-II-α zu ermöglichen,sollte deren Auswertung durch weitere Studien verbessert und standardisiert werden. Erst dann kann das Ziel der gerichteten und limitierten Anwendung von Anthrazyklinen zur Vermeidung unnötiger Nebenwirkungen angestrebt und verwirklicht werden.

Das Mammakarzinom ist eine Tumorerkrankung mit einem sehr heterogenen Krankheitsverlauf. Um den individuellen Krankheitsverlauf einer Patientin besser vorhersagen zu können und um individuelle Therapieentscheidungen treffen zu können, bedarf es prognostischer und prädiktiver Faktoren. Neben den etablierten Prognosefaktoren Tumorgröße, Lymphknotenstatus, Metastasierung und Grading werden momentan verschiedene biologische Faktoren untersucht. Darüber hinaus wird in letzter Zeit insbesondere die prognostische Bedeutung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark diskutiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die prognostische Relevanz von den biologischen Faktoren HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 sowie deren Korrelation mit dem Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark bei Patientinnen mit Mamma-CA zu evaluieren. Insgesamt wurden Gewebeproben von 256 primären Mammakarzinomen mit bekanntem Knochenmarkstatus untersucht. Zunächst wurden aus den archivierten Gewebeblöcken sogenannte Tissue-Micro-Arrays (TMAs) hergestellt. An diesen TMAs wurde die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen analysiert. Zusätzlich wurde das Tumorgewebe auf eine potentielle Genamplifikation von HER2 und Topoisomerase-IIalpha mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hin untersucht. Es stellte sich heraus, dass die meisten dieser biologischen Faktoren untereinander korrelieren. Darüber hinaus konnte eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von HER2 und einem kürzerem krankheitsfreien Überleben der Patientinnen nachgewiesen werden. Weitere Korrelationen zwischen den einzelnen Faktoren und dem Krankheitsverlauf wurden nur in einigen Subgruppen gefunden. Keiner der untersuchten Faktoren stellte sich jedoch als unabhängiger prognostischer Faktor bezüglich eines kürzeren krankheitsfreien bzw. metastasenfreien Verlaufs oder eines kürzeren Gesamtüberlebens heraus. Diese Ergebnisse deuten daher lediglich auf einen kausalen Zusammenhang zwischen den von mir untersuchten Tumorsuppressormolekülen, Proliferationsmarkern und Wachstumsfaktorrezeptoren hin. Die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 auf dem Primärtumor korrelierte nicht mit dem Vorhandensein von Tumorzellen im Knochenmark. Die Dissemination von Tumorzellen ins Knochenmark scheint daher ein von den untersuchten Faktoren unabhängiger Prozess zu sein. Allerdings korrelierte der Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark mit einem kürzeren Gesamtüberleben der Patientinnen. Bisher gehört die Knochenmarkspunktion zwar nicht zur Routinediagnostik beim primären Mammakarzinom. Allerdings wird diese Untersuchung in einigen Zentren empfohlen. Die weitere Charakterisierung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark sowie die Evaluation von zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut sind Gegenstand der aktuellen Forschung.

Die Mukoviszidose (engl: cystic fibrosis, CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung der kaukasischen Bevölkerung. Der Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, einem membranständigen Chloridionenkanal, manifestiert sich an diversen Organsystemen, wobei Infektionen des Respirationstraktes im Vordergrund stehen. CF-Patienten produzieren ein viskoses Tracheobronchialsekret, welches die mukoziliäre Clearance behindert. In der Folge etablieren sich chronisch verlaufende Lungeninfektionen mit einem CF-typischen Erregerspektrum (v.a. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia-Komplex, Haemophilus influenzae und Stenotrophomonas maltophilia), die letztendlich lebenslimitierend sind. Durch die frühzeitige und regelmäßige Gabe von Antibiotika wird versucht, die inflammatorische und erregerassoziierte Schädigung des Lungengewebes zu kontrollieren. Dabei ist eine mikrobiologische Diagnostik, die die Erreger schnell und mit hoher Sensitivität und Spezifität identifiziert, von großer Bedeutung. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit markierten Oliginukleotidsonden zum Nachweis ribosomaler RNS ist eine spezifische und sensitive Methode zum Erregernachweis. Sie benötigt im Vergleich zum mindestens 48h in Anspruch nehmenden kulturellen Nachweis nur wenige Stunden und erfasst auch bereits nicht mehr kultivierbare Erreger, z.B. nach erfolgter Antibiotikatherapie. Das relativ begrenzte Erregerspektrum der Lungeninfektionen bei CF bietet gute Voraussetzungen für den Einsatz der FISH-Diagnostik. Als problematisch hat sich hierbei das viskose und inhomogene CF-Sputum erwiesen, das aufgrund seiner Zusammensetzung bei der Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Sonden eine ausgeprägte Hintergrundfluoreszenz zeigt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz der FISH-Technik zum Nachweis CF relevanter Erreger weiter zu optimieren. Zum einen sollte der Einfluss, den die Probenlagerung bis zur Weiterverarbeitung auf den Erregernachweis hat, untersucht werden. Dabei erwies sich 4ºC als geeignete Lagerungstemperatur, da die Mikroorganismen trotz Verringerung der Ribosomenzahl und damit etwas abgeschwächtem Fluoreszenzsignal bis zu 72h nach Probenentnahme mit FISH unverändert sensitiv nachweisbar sind, ohne dass eine Überwucherung langsamer wachsender Keime eintritt. Zum anderen sollte eine Minimierung der Hintergrundfluoreszenz erreicht werden. Verschiedene Modifikationen des Hybridisierungsprotokolls wurden miteinander verglichen. Durch die Absättigung unspezifischer Bindungsstellen der Oligonukleotidsonden mittels einer 30minütigen Vorinkubation mit freiem Biotin wurde die Hintergrundfluoreszenz erfolgreich vermindert, wobei die markierten Bakterien unverändert gut nachweisbar waren. Um die quantitative Auswertung der Sputumproben zu vereinfachen, wurde weiter ein Protokoll zur Analyse der FISH-Proben im Durchflusszytometer entwickelt. Durch diese schnelle, automatisierte Technik entfällt die zeitraubende manuelle Auswertung der Proben. Eine Integration dieser neu entwickelten Ergänzungen in bestehende Protokolle vereinfacht und beschleunigt die mikrobielle Diagnostik CF-typischer Erreger und eröffnet die Möglichkeit eines größeren Probendurchsatzes ohne zusätzliche Kosten.

Thu, 11 Oct 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7541/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7541/1/Manowski_Tassilo_von.pdf Manowski von, Tassilo Christoph

Der obere Aerodigestivtakt ist das primäre Kontaktorgan für viele inhalative Karzinogene. Dies spielt insbesondere bei der tabak-assoziierten Karzinogenese eine entscheidende Rolle. Polyzyklische Kohlenwasserstoffe und der Metabolit des Benzo[a]pyrens, das Benz[a]pyren-7,8-diol-epoxid (BPDE) sind hierbei von herausragender Bedeutung. Mutationen an der DNA sind dabei nicht gleichmäßig über die gesamte DNA verteilt, sondern auf speziellen Chromosomen bzw. Genen lokalisiert. Zur Erstellung eines individuellen Risikoprofils wurde in dieser Arbeit die alkalische Einzellzell-Mikrogelelektrophorese (Comet Assay), eine etablierte Methode zur Quantifizierung von DNA-Schäden, erstmals mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) an Mucosazellen des oberen Aerodigestivtraktes kombiniert. Nach Inkubation mit BPDE konnte so eine Bestimmung der DNA-Schädigung an den Chromosomen 3,5,8 und dem Vergleichschromosom 1 durchgeführt werden. Dabei wurden frisch entnommene, makroskopisch gesunde Mukosaproben von Patienten mit Oropharynxkarzinom und tumorfreien Patienten verglichen. Es stellte sich heraus, dass Tumorpatienten eine höhere Schädigung der Chromosomen 5 und 8 im Vergleich zu Chromosom 1 aufwiesen. Bei tumorfreien Patienten konnten keine Unterschiede der einzelnen Chromosomen untereinander und im Vergleich zur Gesamt-DNA nachgewiesen werden. Neben einer quantitativen Bestimmung der DNA-Schädigung an Interphasezellen sollte in der vorliegenden Arbeit auch strukturelle DNA-Schädigungen an Metaphasechromosomen untersucht werden. Zur Einschätzung der Mutagensensitivität bei der Karzinogenese im Oropharynx wurden in multiplen Vorarbeiten Lymphozyten als Kontrollzellen herangezogen. Deshalb wurden auch in der vorliegenden Arbeit Metaphasechromosomen aus Lymphozyten präpariert und mit FISH untersucht. Zusätzlich wurde auch eine neue Methodik zur Präparation von Metaphasechromosomen aus Mukosazellen des oberen Aerodigestivtraktes etabliert. Es konnte jedoch an keinem der untersuchten Chromosomen ein statistisch signifikanter Unterschied in der Schädigung zwischen tumorfreien- und Tumorpatienten ausgemacht werden. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Modell zur Präparation von Chromosomen aus Mukosazellen bietet zur weiterführenden Erfassung des Risikoprofils für die Entstehung von Karzinomen des oberen Aerodigestivtraktes einen geeigneteten Ansatz. Unter Umständen lassen sich zusätzliche Gene lokalisieren, die für die Tumorentstehung im Kopf-Hals-Bereich von Bedeutung sind. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass einige dieser Veränderungen bereits in makroskopisch gesunder Schleimhaut des oberen Aerodigestivtrakts auftreten. Weitere Untersuchungen müssen ergeben, ob spezifische Veränderungen am Genom nicht schon vor Entstehung des Tumors nachweisbar sind. Aus solchen Veränderungen ließe sich eine umfangreiche Frühdiagnostik zur Einschätzung der individuellen Mutagensensitivität entwickeln. Dies eröffnet die Möglichkeit für künftige präventive und therapeutische Strategien für die Karzinogenese des oberen Aerodigestivtraktes.

Die Intention dieser retrospektiven Analyse war die Beschreibung und Charakterisierung von Patientinnen mit einer HER2/neu- Überexpression bei metastasiertem Brustkrebs unter einer auf Trastuzumab- (Herceptin®) basierenden Therapie. Ein spezielles Augenmerk galt dem Auftreten von Hirnmetastasen in Relation zur Remission der viszeralen Metastasierung unter der Trastuzumab- Therapie. Es wurden von März 2000 bis zum Mai 2004 insgesamt 136 Patientinnen in drei onkologischen Zentren, wie der Medizinischen Klinik III und der Gynäkologischen Klinik der Universitätsklinik Großhadern und der Praxis Dr. Heinrich in Augsburg in die Analyse einbezogen. Die HER2/neu- Überexpression wurde durch die Immunhistochemie (IHC) bestimmt. Dazu wurden zwei gängige Methoden angewandt, die Fluoreszenz- in- situ- Hybridisierung (FISH) und der HercepTest® mittels Immunhistochemie (IHC). Unter den 136 in dieser Analyse untersuchten Patientinnen mit HER2/neu- Überexpression und einem DAKO- Score von +3 wurden bei 42 Patientinnen in Nachuntersuchungen eine Metastasierung im zentralen Nervensystem festgestellt, dies entspricht 30,9% aller untersuchten Fälle. In Bezug auf den Hormonrezeptorstatus, wie dem Östrogenrezeptor und dem Progesteronrezeptor fiel eine starke Korrelation zum Auftreten einer Hirnmetastasierung auf. Unter den Hirnmetastasierten hatten 42,8% und in der Gruppe ohne Hirnmetastasierung nur lediglich 23,4% einen negativen Hormonrezeptorstatus (p=0,01). Bei der Gruppe der hirnmetastasierten Patientinnen lag das mediane Intervall zwischen der Diagnose von peripheren Metastasen und dem Auftreten von Hirnmetastasen bei 14 Monaten bei einer Bandbreite von 0 bis 69 Monaten. Zum Zeitpunkt der Diagnose der Hirnmetastasierung schlug bei 14 der 42 Patientinnen die auf Trastuzumab- basierende Therapie an (CR+PR: 33,3%; 95% CI: 18,5- 48,2%). Die Patientinnen hatten ab der Diagnose der Hirnmetastasierung eine mediane Überlebenszeit von 13 Monaten bei einer Bandbreite von 0 bis 60 Monaten. Die mediane Gesamtüberlebenszeit, berechnet ab der Diagnose einer peripheren Metastasierung, unterschied sich jedoch in beiden Patientinnengruppen nicht signifikant voneinander (37 Monate gegenüber 47 Monaten; p=0,07 log rank). Als zweiter wichtiger Punkt unserer Analyse war die Effektivität der Trastuzumab- Therapie über den Zeitpunkt der Progression und im Zusammenhang zwischen Erst- und Zweilinientherapie festzustellen. Unter den 136 untersuchten Patientinnen hatten 66 Patientinnen Trastuzumab als Erstlinientherapie erhalten und 47 als Zweitlinientherapie. 23 Patientinnen erhielten Trastuzumab über den Zeitpunkt der Progression hinaus. Es gab keinen Unterschied bezüglich der Dauer der auf Trastuzumab- basierenden Therapie. Bei der Erstlinientherapie 29,5 Wochen gegenüber 25 Wochen bei der Zweit- oder Mehrlinientherapie. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Ansprechrate zwischen Erst- und Zweitlinientherapie (37,9% gegenüber 35,7%) und dem jeweiligen medianen Überleben der Patientinnen (p=0,47 log rank). Die Patientinnen, die zwei oder mehr auf Trastuzumab- basierende Therapieregime erhielten, überlebten signifikant länger als jene, die lediglich ein Trastuzumab- Therapieregime verabreicht bekamen (62,4 Monate gegenüber 38,5 Monaten; p=0,01 log rank). Trastuzumab ist sehr effektiv bei der Behandlung einer Leber- und Lungenmetastasierung HER2/neu- überexprimierter Patientinnen, aber es scheint eine Hirnmetastasierung nicht verhindern zu können. Auch eine Progression der ZNS- Filiae kann durch Trastuzumab nicht aufgehalten werden. Das Gesamtüberleben aber wird durch eine Kombination aus mehreren Therapieregimen mit Trastuzumab und Kombinationspartnern entscheidend verlängert, speziell bei Patientinnen, welche Trastuzumab über den Zeitpunkt der Progression hinaus erhalten hatten. Da etwa ein Drittel der HER2/neu- überexprimierten Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs trotz effektiver Behandlung der peripheren Metastasen mit Trastuzumab eine Hirnmetastasierung entwickelten, sollten neue Screeningmethoden und engere Überwachungszeiträume eingeführt, sowie andere Behandlungsstrategien entwickelt werden, um diesem Teil der Brustkrebs- Patientinnen besser helfen zu können.

10-15% der de novo akuten myeloischen Leukämie (AML) zeigen einen komplex aberranten Karyotyp, der definitionsgemäß mindesten 3 numerische und/oder strukturelle Veränderungen pro Karyotyp beinhaltet. Patienten mit diesem Karyotyp weisen eine besonders ungünstige Prognose auf. Über die Pathogenese bei dieser Subgruppe ist bisher nur wenig bekannt. Ziel dieser Studie war das Aberrationsmuster bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp detaillierter zu charakterisieren. Hierzu wurden 44 AML-Patienten, die in der Routinediagnostik nach der klassischen Zytogenetik (G-Banden Analyse), der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und der 24-Farben-FISH (M-FISH) einen komplex aberranten Karyotyp zeigten, zusätzlich mit der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH) untersucht. Diese auf der in situ Hybridisierung basierende Methode ermöglicht es, einen Überblick über Verluste und Vermehrungen des genetischen Materials in einem Versuchsansatz zu erhalten und diese den einzelnen Chromosomen auf Bandenebene zu zuordnen. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp besonders Verluste, die durch strukturelle Aberrationen entstanden, häufiger auftreten wie Zugewinne von genetischem Material. Deletionen lagen besonders häufig in den Bereichen 5q (91%), 7q (59%) und 17p (61%), während nur 2% der Patienten keine Veränderung in mindestens einer dieser drei Regionen zeigte. Weiterhin konnten Verluste den Chromsomen 12p, 13q, 16q, 18q zugeordnet werden. Zugewinne lagen besonders in den Chromosomen 8q und 11q. Mit CGH war es zusätzlich möglich bei 6 Patienten Amplifikationen in 11q zu detektieren. Das Aberrationsmuster der AML mit komplex aberrantem Karyotyp konnte mittels CGH genauer beschrieben werden. Die erhobenen Daten lassen eine genauere Definition der AML mit komplex aberranten Karyotyp als eigene Entität sinnvoll erscheinen. Diese beinhaltet das Fehlen einer spezifischen, primär balancierte Aberration, das Vorkommen von mindesten 5 Aberrationen pro Karyotyp und das Vorhandensein einer Deletion in mindestens einer der chromosomalen Banden 5q31, 7q31 und 17p13. Insgesamt konnten Verluste 7 bestimmten Chromosomenbereichen und Zugewinne 2 bestimmten Chromosomenregionen genauer zugeordnet werden. Diese Eingrenzung der involvierten Chromosomenbereiche bei dieser AML-Subgruppe dient der Suche nach relevanten Tumorsuppressor- und Onkogenen. Als weiterer Pathomechanismus scheint der Gendosiseffekt eine besondere Rolle bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp zu spielen, da Amplifikationen nur in dieser Subgruppe nachgewiesen wurden. Insgesamt scheint besonders die Komplexität unterschiedlicher Rearrangements und weniger eine spezifische Aberration für die so ungünstige Prognose verantwortlich zu sein.

Aufgrund fehlender Methoden wurde bis zum heutigen Zeitpunkt nur selten eine molekulargenetische Analyse von Einzelzellen durchgeführt. In vielen Bereichen aber, wie beispielsweise den Tumoren, ist sie von entscheidender Bedeutung. Das Auftreten eines genetisch heterogenen Musters in einem Tumor könnte die Suche nach krankheitsauslösenden oder -fördernden Veränderungen erschweren. Auch bei der Untersuchung von seltenen Zellen (so genannte „rare cell events“), z.B. bei einer minimalen residualen Tumorerkrankung sind geeignete Methoden zur Einzelzellanalyse notwendig, da nur wenig Material zur Verfügung steht. Ziel dieser Doktorarbeit war es, zwei molekulargenetische Analysemethoden zu etablieren, weiterzuentwickeln und in einer geeigneten Strategie bei der Untersuchung von disseminierten Tumorzellen bei fünf Mammakarzinomen einzusetzen. Im ersten Teil der Doktorarbeit erfolgte die Auswahl eines geeigneten Markierungssystems für die Identifizierung disseminierter Tumorzellen im Knochenmark. Die Benutzung des pan-Zytokeratin Antikörpers A45 B/B3 direkt konjugiert mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 oder FluorX zeigte in verschiedenen Testsystemen die besten Ergebnisse. Sowohl seine Spezifität als auch die Durchführbarkeit einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) war möglich. Anhand disseminierter Tumorzellen von Nierentumoren wurde die Möglichkeit einer Untersuchung mittels zweier Interphase FISH Ansätze überprüft. Die Hybridisierung der Zentromernahen YAC Sonden konnte auf dem Knochenmarksgewebe bei pan-Zytokeratin positiven Zellen nach Erproben mehrerer Protokolle nicht durchgeführt werden, allerdings war die Hybridisierung von Zentromersonden erfolgreich. Die Optimierung des veröffentlichten Protokolls zur Einzelzell CGH (C. Klein et al. 1999; N. Stöcklein et al.2002) war das zweite Ziel der Arbeit. Diese Optimierung war notwendig, weil sich das ursprünglich publizierte Protokoll als Artefakt anfällig herausstellte. Durch die in dieser Arbeit beschriebenen Protokollveränderungen konnte die für Einzelzell Analysen notwendige Reproduzierbarkeit erreicht werden. Als Testsystem wurde eine molekulargenetisch ausreichend charakterisierte und in ihren Veränderungen stabile Zelllinie gewählt (RCC-26). Die ersten Versuche zur Einzelzellanalyse zeigten Veränderungen in der Zelllinie, die in allen vorangegangenen Analysen mit etablierten Techniken (M-FISH und CGH) nicht gezeigt werden konnten. Eine Optimierung des Protokolls führte zu übereinstimmenden Ergebnissen von Einzelzell CGH, CGH und M-FISH. Anschließend konnte die Reproduzierbarkeit dieser Methode anhand der Zelllinie RCC-26 gezeigt werden. Die Anwendung beider Methoden zur Analyse von seltenen Zellen wurde mit der Untersuchung von fünf Mammakarzinomen dargelegt. Der Vergleich von Primärtumor und kultivierten disseminierten Tumorzellen ins Knochenmark zeigte im Rahmen der untersuchten Fälle gemeinsame molekulargenetische Veränderungen beider Tumorentitäten. Mit der Anwendung dieser neuen Methoden ist es möglich detaillierte Informationen über seltene Zellen zu erhalten und diese in den biologischen Kontext einzuordnen.

In der Arbeit wurde die Methodik einer Kombination aus einer Immunzytochemischen Färbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit Sonden für 6p, 8p und 8q an Interpahsezellen etabliert. Anschließend erfolgte die Analyse von Tumorzelllinien und Primärkulturen, die aus Knochenmarkaspiraten von Patienten mit Prostatakarzinom gewonnen worden waren. Sowohl in den Zelllinien wie auch in den Primärkulturen der disseminierten Prostatakarzinomzellen wurden für alle drei untersuchten Chromosomenlokalisationen numerische Aberrationen entdeckt. In fast allen Tumorpräparaten zeigte sich eine verschieden große Zellpopulation mit normalem Hybridisierungsmuster (je zwei Signale für 6p, 8q und 8p) und mindestens ein Zellklon mit pathologischem Muster. Ein konsistentes Muster für 6p25, 8q24.3 und 8p23 Aberrationen, das in allen untersuchten Karzinomen vorhanden oder vorherrschend gewesen wäre, ließ sich nicht definieren. Dominierend war ein gemischtes Bild verschiedener Kombinationen von Aberrationen und eine ausgeprägte Heterogenität vorhanden. Ebenso wie an den in der Literatur beschriebenen Zellen aus Primärtumoren waren auch in den disseminierten Zellen 8p-Verluste und zum Teil 8q-Zugewinne und 6p-Zugewinne zu finden. Die Zugewinne dieser Chromosomenregionen waren überwiegend in den Zelllinien nachweisbar. Hervorzuheben ist der Verlust von 6p in sieben der elf Primärkulturen, eine Aberration, die bisher nur in einem einzigen Fall eines primären Prostatakarzinom-Gewebe beschrieben wurde.