Podcasts about deletionen

Hochpathogene Aviäre Influenzaviren (HPAIV) des Subtypes H5N1 zirkulieren seit den ersten Ausbrüchen vor mehr als 10 Jahren in Wirtschaftsgeflügel und Wildvögeln, vor allem in Asien und Afrika. Vakzinekampagnien mit ungeeigneten oder unwirksamen Impfstoffen sowie Transporte von infiziertem Geflügel, sowie Wildvogelzüge führten nicht nur zur Verbreitung der Viren, sondern auch zu Reassortierungen mit anderen zirkulierenden Influenzaviren und zur antigenetischen Drift. Bis heute ist kein Impfstoff verfügbar der ausreichenden und schnellen Schutz vor einer HPAIV H5N1 Infektion, sowie der Ausscheidung bietet, genauso wie eine einfache Applikation ermöglicht und sowohl im Säugetier, als auch Vogel einsetzbar ist. Im Falle eines Ausbruches wäre eine solche Vaccine das perfekte Werkzeug, um eine Pandemie zu verhindern. Die in dieser Dissertation vorgestellten Arbeiten zeigen die in-vitro und in-vivo Charakterisierung und einer Neuraminidase-negativen H5N1 Mutante, so wie den Einsatz als Impfstoffmodel zur Untersuchung der Frühimmunisierung. Ein hochpathogenes H5N1 Isolat des Stammes 2.1 (A/swan/Germany/R65/2006) wurde fünfzigmal im embryonierten Hühnerei passagiert. Den Passagen wurde bei jedem Durchgang polybasisches Hühnerserum mit Antikörper gegen H5 und N2 beigemischt, um einen selektiven Druck auf das Virus zu erzeugen. Die daraus resultierende Mutante zeigte überaschenderweise nicht die erwarteten Veränderungen und Anpassungen im Haemagglutinin, sondern Deletionen und „Segment-shuffling“ im Segment 6, welches für das Neuraminidaseprotein kodiert. Des Weiteren konnte keine Neuraminidaseaktivität mehr nachgewiesen werden. Die Deletionen führten zu Veränderungen im Wachstumsverhalten des Virus und der Pathogenität im Tier. So konnte hier gezeigt werden, dass die Mutante ohne Zugabe von externer Neuraminidase oder Adaptation des Haemagglutinins in Zellkultur und Ei hohe Infektionstiter erreichen kann. Im Vergleich zum Ursprungsvirus aber Wachstumsdefizite aufweist, die sich in kleineren Plaques und langsamerem Wachstum auf Zellkultur zeigen. Infektionsversuche im Huhn zeigten, dass das Virus weder Klinik auslöst, noch ausgeschieden oder übertragen wird, aber eine gute Immunantwort induziert. Hohe Antikörper konnten nur erreicht werden, wenn Hühner intramuskulär infiziert wurden, wohingegen eine Applikation über den oronasalen Weg nicht bei allen Tieren gelang. Die gute Immunantwort und Apathogenität des Virus machten es im weiteren Verlauf zu einem geeigneten Kandidaten für Frühimmunisierungsversuche im Säugetier- und Vogelmodell. So wurden Balb/C Mäuse, Frettchen und Hühner ein, drei und sieben Tage vor einer H5N1 Belastungsinfektion mit der H5N1 Mutante intramuskulär oder intranasal immunisiert. Dabei konnte ein 100% Schutz vor klinischen Symptomen und der Ausscheidung des Challenge-Virus nach nur 7 Tagen gezeigt werden. Darüber hinaus waren die Tiere vor Klinik bereits drei Tage nach der Immunisierung geschützt, wobei aber virale RNA in oronasalen Proben und auch den Organen nachgewiesen werden konnte. Die Neuraminidasedeletion der Mutante ermöglichte außerdem eine Unterscheidung von immunisierten zu infizierten Tieren, da erstere im ELISA NP- aber keine NA-Antikörper zeigten, wohingegen infizierte Tiere Antikörper gegen beide Proteine bildeten. In Zukunft könnten NA negative Influenzaviren zusätzlich oder als Alternative zu den gängigen stamping out Strategien eingesetzt werden. Dafür aber sind weiter Untersuchungen essentiell. Die hochpathogene Spaltstelle im HA von „EscEgg50A“ impliziert das Risiko mit zirkulierenden AI Stämmen zu reassortieren und ist daher für den Einsatz zum Beispiel in Zuchtherden ungeeignet. Darüber hinaus ist das Wissen über das NA Protein und seine Funktionsweise sehr lückenhaft und NA-negative Mutanten könnten für zukünftige Untersuchungen genutzt werden.

Der häufigste neuronale Verbindungstyp im Riechkolben (Bulbus olfactorius) der Säuger ist die reziproke dendrodendritische Synapse zwischen den glutamatergen Mitralzellen (den Prinzipalneuronen des Bulbus) und den GABAergen Körnerzellen. Die dendritische Kalziumdynamik der axonlosen Körnerzellen ist aufgrund ihrer dendritischen Freisetzung von besonderem Interesse und zeichnet sich durch einen ungewöhnlich langsamen Verlauf aus. Zwei mögliche Ursachen dafür stehen im Zentrum dieser Dissertation: (1) Der unspezifische Kationenstrom ICAN, der in Körnerzellen nach synaptisch evozierten Aktionspotenzialen beobachtet wird, und (2) die endogene Kalziumdynamik der Körnerzellen. Diese Phänomene wurden mittels Zwei-Photonen-Laser-Scan-Mikroskopie und simultaner Einzelzellableitung in akuten Hirnschnitten von adulten Mäusen untersucht. In dieser Arbeit wurde die molekulare Identität von ICAN als Kombination aus TRPC1 und TRPC4 (transient receptor potential classic) vermittels Tieren mit Deletionen der entsprechenden Gene aufgeklärt (Kollaboration mit Prof. Marc Freichel, Homburg). Im Vergleich zum Wildtyp fehlten in der TRPC1/4 Doppeldeletion ICAN und der assoziierte langsame Ca2+-Einstrom. Damit wurde erstmals eine synaptische Funktion von TRPC-Kanälen im Bulbus nachgewiesen. Weiterhin wurde ein bislang unbekannter Aktivierungsweg von TRPC-Kanälen entdeckt, nämlich über NMDA-Rezeptoren. Bezüglich der endogenen Kalziumdynamik wurde festgestellt, dass nicht etwa eine große Pufferkapazität dem langsamen Abbau von Ca2+-Signalen zugrunde liegt, sondern vielmehr eine geringe Extrusionsrate. Damit sind beide Mechanismen – TRPC-Kanäle und endogene Kalziumdynamik – für den langsamen Verlauf von Ca2+-Transienten in Körnerzellen mitverantwortlich.

Thu, 21 Jun 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14535/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14535/1/Laub_Christoph.pdf Laub, Christoph ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakultät

Thu, 6 Oct 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13654/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13654/1/Weber_Franziska.pdf Weber, Franziska

Die Bakteriophagen Integrase PhiC31 stellt ein viel versprechendes Werkzeug zur Integration genetischen Materials im nicht viral-basierten Gentransfer dar. Die PhiC31 Integrase vermittelt die Rekombination von spezifische Erkennungssequenz attB enthaltenden Plasmiden mit natürlich vorkommenden attP Erkennungssequenzen innerhalb des Zielgenoms mit unterschiedlicher Integrationsfrequenz und -spezifität. Nebeneffekte der Integration in Form von insertioneller Mutagenese, wie z.B. große Deletionen und chromosomale Veränderungen im Genom der Zielzelle konnten beobachtet werden. Ziel dieser Dissertation war, die PhiC31 vermittelte Effizienz zu verbessern und die Spezifität zu adressieren. Als Ansatz wurde die Mutagenese der DNA-Bindungsdomäne der Integrase basierend auf Punktmutanten zur verbesserten Integrationseffizienz gewählt. Integrationsassays wurden in verschiedenen humanen Zelllinien durchgeführt. Etablierung von Doppelmutanten, sowie Dosisoptimierung des Integrase kodierenden Plasmids verbesserten die Integrationseffizienz mehr als dreifach, verglichen mit der Wildtypintegrase in den Zelllinien HeLa und HCT. Weitere Assays verglichen die Exzisionsaktivität der Integrasemutanten mit dem Wildtyp. Bei fünf Mutanten wurde eine etwa zweifach erhöhte Exzision gefunden. Die Beurteilung der Spezifität der Integrasemutanten erfolgte durch Substitution der Wildtyp-attP Sequenz mit drei Pseudo attP Erkennungssequenzen des Reporterplasmids, deren erhöhte Spezifität bereits dokumentiert war. Einzelne Mutanten zeigten eine zweifach erhöhte Exzisionsaktivität. Die Rekombinationsaktivität von Integrasemutanten wurde im Kontext chromosomaler DNA mittels einer stabil GFP-exprimierenden Reporterzelllinie, in der die eGFP Expression mittels Integrase-vermittelter „Raus-Rekombination“ eines polyA Stoppsignals angeschaltet wird, untersucht. Auf chromosomaler Ebene wurde keine verbesserte Ausschneidungsaktivität erreicht. Zur Evaluierung der in vivo Effizienz zweier ausgewählter PhiC31 Integrasemutanten, die in vitro erhöhte Integrationsaktivität aufwiesen, wurden zwei Plasmide am C57BL/6 Mausmodell getestet. Reportergen war ein für den humanen Koagulationsfaktor IX kodierendes Gen. In Abhängigkeit von der Integrationseffizienz der Mutanten und des Wildtyps, wurden im Zeitraum von einhundert Tagen ähnliche Expressionslevel gefunden. Die Mutanten zeigten keine Verbesserung der Langzeitexpression von humanem Faktor IX. Die hier durchgeführten Studien zur Mutationsanalyse der Phagenintegrase PhiC31 zeigten einen wirksamen Ansatz zur Verbesserung der PhiC31 Integrase-vermittelten Integrationseffizienz in vitro.

Die einzige Möglichkeit, Patienten mit Pankreaskarzinom zu heilen, besteht in einer möglichst frühzeitigen Diagnose und Operation. Nach einer kurativen Resektion versterben dennoch über 95% aller Patienten innerhalb der folgenden fünf Jahre an einem Rezidiv, was belegt, dass nach der Operation disseminierte Tumorzellen (DTZ) im Körper des Patienten verbleiben und deren Progression zu einem Rezidiv der Krebserkrankung führt. Beim Pankreaskarzinom wurde gezeigt, dass der Nachweis von DTZ mit dem Antikörper A45-B/B3 gegen Zytokeratin im Knochenmark und mit dem Antikörper Ber-EP4 gegen EpCAM im Lymphknoten mit einer schlechteren Prognose korreliert. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Einblicke in die Biologie von hämatogener und lymphogener Disseminierung beim Pankreaskarzinom zu erarbeiten. Zunächst wurde die Prävalenz von DTZ durch immunzytochemische Färbungen gegen die oben genannten epithelialen Marker bestimmt. Anschließend wurden die Zellen isoliert, ihre DNA amplifiziert und mit der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) auf numerische Aberrationen hin untersucht, welche mit den chromosomalen Veränderungen des Primärtumorkollektivs verglichen wurden. Diese Gegenüberstellung sollte ergründen, ob Ähnlichkeiten zwischen hämatogen disseminierten (H-DTZ), lymphogen disseminierten Tumorzellen (L-DTZ) sowie Primärtumoren (PT) bestehen und ob charakteristische Veränderungen für H-DTZ und L-DTZ existieren, welche möglicherweise im Rahmen der Disseminierung selektiert wurden. Die Prävalenz von DTZ bei Patienten mit nicht metastasiertem Pankreaskarzinom lag im Knochenmark bei 23,0% und im Lymphknoten bei 38,1%. Dieser Unterschied war nicht signifikant. Die genomische Analyse von DTZ und PT deckte auf, dass Primärtumore die höchste Anzahl an numerischen Aberrationen aufwiesen (Mittelwert: 12,8), gefolgt von den L-DTZ (Mittelwert: 9) und den H-DTZ (Mittelwert: 4,7). Zum anderen zeigten EpCAM-positive Zellen aus den Lymphknoten häufiger abnorme Karyotypen (78,3%) als Zytokeratin-positive Zellen aus dem Knochenmark (68,8%), während alle PT numerische Aberrationen aufwiesen. Die Häufigkeit von chromosomalen Gewinnen und Verlusten war unterschiedlich in den verschieden Gruppen und betrug bei H-DTZ 3,6 DNA-Gewinne und 1,1 DNA-Verluste, bei L-DTZ 4,5 DNA-Gewinne und 4,5 DNA-Verluste und bei PT 5,6 DNA-Gewinne und 7,2 DNA-Verluste pro analysierter Probe. Die Ähnlichkeitsanalyse numerischer Aberrationen der drei Kollektive zeigte, dass PT und insbesondere DTZ untereinander sehr heterogen sind. Charakteristische Veränderungen, die möglicherweise selektiert worden waren, wurden in erster Linie in PT gefunden, in geringerem Ausmaß auch in Tumorzellen aus Lymphknoten. Es handelte sich dabei in erster Linie um DNA-Verluste, wie zum Beispiel auf Chromosom 17 und 18, welche PT und L-DTZ gemeinsam waren und eine größere Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Gruppen im Vergleich zu PT und H-DTZ nahelegen. Andererseits konnten auch Aberrationen identifiziert werden, die charakteristisch für die jeweilige Gruppe waren. Insbesondere handelte es sich dabei bei H-DTZ um DNA-Gewinne von 5p und 15q und bei L-DTZ um DNA-Gewinne von 4p oder 19 beziehungsweise DNA-Verluste von 11q oder 12p. Häufige DNA-Gewinne und -Verluste auf den Chromosomen 1, 3 oder 22 waren kennzeichnend für die Gruppe der Primärtumore. In der Analyse gepaarter Proben desselben Patienten waren gemeinsame Aberrationen zwischen PT und H-DTZ nur in der Hälfte (3/6), zwischen PT und L-DTZ dagegen in allen der untersuchten Fälle (2/2) anzutreffen. Auch die Anzahl dieser gemeinsamen Veränderungen war bei letzteren größer (Anteil gemeinsamer Veränderungen zwischen a) PT und H-DTZ: 5,9%, 5,9%, 4,8% und b) PT und L-DTZ: 16,3%, 8,9%). Der Vergleich solcher Aberrationen zwischen den verschiedenen Patienten mit gepaarten Proben dagegen führte nicht zur eindeutigen Identifikation typischer Veränderungen, welche im Zusammenhang mit einer hämatogenen oder lymphogenen Disseminierung gesehen werden können. Eine Zunahme numerischer Aberrationen mit fortschreitender Tumorprogression im Primärtumor wurde für die meisten soliden Tumoren nachgewiesen. Auch bei der Progression der pankreatischen intraepithelialen Neoplasie zum Pankreaskarzinom ist die Akkumulation von genetischen Veränderungen zu beobachten. Vor diesem Hintergrund deuten die vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die Disseminierung ein frühes Ereignis im Rahmen der Progression des Pankreaskarzinoms ist. In sehr frühen Tumorstadien, welche möglicherweise von den Genomprofilen der DTZ im Knochenmark repräsentiert werden, sind in erster Linie DNA-Gewinne anzutreffen. Interessanterweise scheinen diese DTZ im Milieu des Knochenmarks keine Deletionen zu akkumulieren. Mit fortschreitender Tumorprogression kommt dagegen DNA-Verlusten eine zunehmend bedeutende Rolle zu, was in DTZ aus Lymphknoten sowie im Primärtumor zu beobachten ist. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage für eine Vielzahl weiterführender Fragestellungen, wie zum Beispiel die Identifikation der genetischen Veränderungen, die am Anfang der genetischen Progression stehen. Gerade diese Veränderungen könnten von allen Tumorzellen geteilt werden und somit ideale Zielstrukturen für neue Therapieansätze darstellen.

Im Escherichia coli Stamm ECOR31 konnte erstmals eine atypische Insertionsstelle der weit verbreiteten Pathogenitätsinsel Yersinia-HPI beschrieben werden. Statt dem asnT-tRNA-Gen findet sich am Integrase-Ende der HPI eine weitere, offenbar horizontal transferierte Region, die RegX genannt wurde. Diese besitzt eine Größe von 24196 Basenpaaren und unterscheidet sich mit einem G+C-Gehalt von 47,9% vom E. coli-Kerngenom. Weder auf DNA noch auf Protein-Ebene existieren höhere Homologien zu E. coli-DNA. Nach Anfertigung einer Cosmid-Bank wurde die gesamte Region sequenziert und annotiert. RegX weist eine mosaikartige Struktur auf, mit Punktmutationen, Deletionen und Insertionen. Sie besteht aus 22 offenen Leserastern und alle potentiellen Gene und deren Translationsprodukte wurden durch Vergleiche mit der NCBI-Datenbank charakterisiert. Die Transkription verschiedener Gen-Cluster und deren Operonstruktur wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Die DNA-Region enthält eine interessante Anhäufung von putativen Aufnahme-Systemen für divalente Metallionen, wie Eisen, Zink, Mangan. Zudem beheimatet die Region X Regulatorgene ähnlich zu Fur und Zur und Zink-abhängige Enzyme. Im Gesamtvergleich der Region X ergeben sich die höchsten Homologien zu Teilen des Plasmids pLVPK von Klebsiella pneumoniae CG43 30. Anhand der strukturellen Unterschiede der Sequenzen mit Punktmutationen und Rekombinations-Ereignissen kann der anhaltende Wandel bakterieller Genome nachvollzogen werden. Des Weiteren wurde die Verbreitung dieser Region unter klinisch relevanten Enterobacteriaceae und Pseudomonaceae untersucht. Von 530 gescreenten Bakterien konnte ein Klebsiella pneumoniae Stamm isoliert werden, der in der groben Struktur identisch zu der untersuchten Region von ECOR31 ist. In diesem Isolat, das aus der Blutkultur eines Patienten mit Sepsis stammt, konnte sowohl die gesamte Region X, als auch die benachbarte Yersinia-HPI und die atypische Insertionsstelle der HPI nachgewiesen werden. Es ist davon auszugehen, dass die untersuchte Region auf einem konjugativen Klebsiella-Plasmid lokalisiert ist und so zusammen mit der HPI horizontal zwischen verschiedenen Spezies übertragen werden kann.

Thu, 11 Oct 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7541/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7541/1/Manowski_Tassilo_von.pdf Manowski von, Tassilo Christoph

Ziel dieser Arbeit war es BoHV-1 Doppeldeletionsmutanten zu generieren, zu charakterisieren und bezüglich ihrer Vakzineeignung zu bewerten. Die vorgestellten Studien zur Charakterisierung eines gE und UL49.5 deletierten Virus (BoHV-1-DgEDUL49.5) konnten belegen, dass diese Deletionskombination als letal für BoHV-1 anzusehen ist. Ein UL49.5 deletiertes Virus verhielt sich dagegen funktionell wie ein Virus ohne UL49.5/gM-Komplex. Ähnlich wie bei anderen Alpha-Herpesviren war hier wahrscheinlich der zweite Umhüllungsschritt im Zytoplasma der infizierten Zelle gestört, so dass keine infektiöse Virusnachkommenschaft gebildet wurde. Ein Virus mit Deletionen der Genorte UL49 und gE (BoHV-1-DgEDUL49) zeigte hingegen fast keine Beeinträchtigungen im Hinblick auf die Replikationsfähigkeit. Dagegen war die Ausbreitungsmöglichkeit von Zelle-zu-Zelle (cell-to-cell-spread CTCS) einer solchen Mutante im Vergleich zu den entsprechenden einzel-deletierten Viren erheblich verringert. Da es sich hierbei um eine synergistische Verstärkung gegenüber den Einzelmutanten handelte, wurde geschlussfolgert, dass beide Proteine an derselben Funktionskette des CTCS beteiligt sind. Da die doppelt UL49 und gE deletierte Mutante allerdings weiterhin extrazelluläre, infektiöse Virusnachkommenschaften bildete, ist der CTCS als unabhängige Ausbreitungsform offensichtlich durch andere Funktionen bedingt als der klassische Weg der Virusausschleusung. Hinweise darauf, dass gE auch bei BoHV-1 mit pUL49 interagiert konnten dabei durch Kolokalisationsstudien im Laserscanmikroskop abgeleitet werden. Allerdings ließ keine dieser BoHV-1-Mutanten eine besondere Eignung als Vakzinestamm erkennen. Ein gE und TK doppelt deletiertes Virus zeigte hingegen in vitro kaum veränderte Wachstumseigenschaften verglichen mit dem einfach gEdeletierten Virus. Diese Deletionskombination sollte zudem gegenüber einer Virulenzsteigerung durch Rekombination mit Feldviren unempfindlicher sein, als die derzeit erhältlichen Lebendvakzinen. Zur Steigerung der immunogenen Wirkung des Lebendvirus wurde dieser neue Stamm (BoHV-1DgEDTK) in Kombination mit einem adjuvierenden, nicht viruziden, Blockpolymer eingesetzt. Dieser Ansatz wurde in einem Tierversuch an Kälbern im Vergleich zu der Immunisierung mit dem nicht adjuventierten Lebendvirus getestet. Im Ergebnis dieses Tierversuches schieden die Tiere, welche adjuventiert immunisiert wurden, weniger Virus und zudem für eine kürzere Zeit aus. Dies galt im Vergleich mit den nicht immunisierten Kontrolltieren wie auch im Vergleich mit den Tieren, die allein das Lebendvirus zur Immunisierung appliziert bekommen hatten. Auch die Quantifizierung der neutralisierenden Antikörper verdeutlichte eine gesteigerte Immunogenität der Kombination des doppelt deletierten Lebendvirus mit dem Adjuvants. Die sehr gute Immunitätslage der Tiere nach Impfung führte allerdings nach Belastungsinfektion auch zu einer zeitlich verzögerten Serokonversion im Markertest auf Basis des Nachweises von gE-spezifischen Antikörpern. Auch dies muss als Beleg für die hervorragende, immunisierende Leistung der neuen Präparation angesehen werden, da offensichtlich bei einigen der immunisierten Tiere die Virusreplikation soweit unterdrückt wird, dass keine gEspezifische Antikörperantwort mehr erfolgt. Die vorgestellte Kombination eines genetisch überattenuierten Lebendvirus und die Verstärkung der immunogenen Eigenschaften durch Zusatz eines nicht viruziden, potenten Adjuvants können die Grundlage für eine zukünftige Vakzinestratgie zur Bekämpfung der BoHV-1 oder anderer herpesviraler Infektionskrankheiten bilden.

Thu, 14 Dec 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6355/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6355/1/Eberhardt_Andrea.pdf Eberhardt,

Die gamma-Sekretase ist ein Proteasekomplex, der aus vier Komponenten, Presenilin (PS), Nicastrin (NCT), APH-1 und PEN-2, besteht und der die intramembranöse Prozessierung verschiedener Typ I Transmembranproteine, einschliesslich des Alzheimer-assoziierten beta-Amyloid Vorläuferproteins, katalysiert. In der vorliegenden Arbeit wurden stabile PEN-2 RNAi-Knockdown Zellen (PEN-2KD) dazu verwendet, um Hinweise auf die Funktion von PEN-2 bei der Assemblierung und Reifung des gamma-Sekretasekomplexes, die Rolle von PEN-2 im aktiven Komplex und für die gamma-Sekretaseaktivität zu erhalten. Zusätzlich wurden, vor dem Hintergrund des PEN-2KD, RNAi-resistente PEN-2 Varianten analysiert, die in einer Struktur- /Funktionsanalyse auf ihre Fähigkeit hin untersucht wurden, den Defekt des PEN- 2KD aufzuheben, um damit funktionell wichtige Domänen im PEN-2 Protein zu identifizieren. Der Knockdown von PEN-2 war mit gestörter Reifung von NCT und blockierter PS Endoproteolyse assoziiert. PS akkumulierte als Vollängenprotein (PSholo), das durch Komplexbildung mit NCT und APH-1 stabilisiert wurde. In Abwesenheit von PEN-2 können PS, NCT und APH-1 zu einem trimeren Komplex assemblieren, PEN- 2 ist danach allerdings notwendig, um die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes durch Initialisierung der PS Endoproteolyse einzuleiten. Interessanterweise bewirkte der Knockdown von PEN-2 auch in Endoproteolyse defizienten SwAPP/PS1 deltaExon9 Zellen einen Defekt in der Reifung von NCT. Dies schlägt eine generelle Rolle von PEN-2 bei der Reifung und für die Aktivität der gamma-Sekretase vor, die unabhängig von der PS Endoproteolyse ist. Die Defekte des PEN-2KD konnten effektiv durch RNAi-resistentes wt-PEN-2 revertiert werden. In der folgenden Struktur-/Funktionsanalyse erwies sich am N-Terminus mit einem Epitop-tag verlängertes PEN-2 als voll funktionell, wohingegen sowohl die Verlängerung des C-Terminus mit einem tag, als auch eine Trunkierung des C-Terminus (PEN-2 deltaC) defekte PEN-2 Varianten hervorrief. Diese konnten zwar die Akkumulation von PSholo, die mit dem Knockdown von PEN-2 assoziiert war ausgleichen, konnten aber weder normale Spiegel an PS-NTF und -CTF herstellen, noch für eine Reifung von NCT sorgen. PEN-2 deltaC war sehr instabil und wurde schnell vom Proteasom abgebaut, was mit der Unfähigkeit einen stabilen gamma-Sekretasekomplex zu bilden konsistent war. Zusätzlich verursachte die Expression von PEN-2 deltaC eine selektive Instabilität des PS-NTF/-CTF Heterodimers, das ebenfalls vom Proteasom abgebaut wurde, wohingegen NCT und APH-1 stabil blieben. Der C-Terminus von PEN-2 ist nicht für die Einleitung der PS Endoproteolyse notwendig. Danach wird er allerdings benötigt um die entstandenen PS Fragmente und PEN-2 selbst im Komplexzu stabilisieren. Um den PEN-2 C-Terminus genauer zu untersuchen, wurden unterschiedliche Deletionen und Mutationen mehrerer konservierter Aminosäuren, im PEN-2KD auf funktionelle Aktivität hin analysiert. Progressive Verkürzung des C-Terminus bewirkte einen zunehmenden Funktionsverlust. Dieser wurde auch bei einer internen Deletion oder der groben Verdopplung der Länge durch einen Epitop-tag beobachtet. Interessanterweise störte nur die kombinierte, nicht aber die einzelne Mutation der konservierten Aminosäuren D90, F94, P97 und G99 die Funktion von PEN-2. Alle funktionslosen Mutanten erlaubten zwar die PS Endoproteolyse, die PS Fragmente und PEN-2 selbst waren aber instabil und wurden durch das Proteasom abgebaut. Länge und gesamter Sequenzkontext des PEN-2 C-Terminus sind also, in der engen räumlichen Anordnung der Komplexpartner, für die Stabilisierung des PS-NTF/- CTF Heterodimers und von PEN-2 selbst im gamma-Sekretasekomplex notwendig. Die Interaktion der C-terminalen PEN-2 Mutanten mit den PS Fragmenten und den anderen beiden Komplexpartnern konnte allerdings unter Bedingungen, wo der proteasomale Abbau blockiert war, wiederhergestellt werden. Somit wurde ein Komplex aus allen vier essentiellen gamma-Sekretasekomponenten stabilisiert und isoliert, der zwar vollständig assembliert, aber noch nicht komplett gereift war. Dieser prämature Komplex zeigte noch keine gamma-Sekretaseaktivität, für welche sowohl die vollständige Assemblierung der Komponenten, als auch deren komplette Reifung essentiell sind. Zusammenfassend schlagen die vorliegenden Daten folgende Funktionen für PEN- 2 im gamma-Sekretasekomplex vor: PEN-2 wird für die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes und die Einleitung der PS Endoproteolyse benötigt. Darüber hinaus stabilisiert PEN-2 die, durch die Endoproteolyse entstandenen PS Fragmente im Komplex. Für letztere Funktion ist ein in Länge und Gesamtsequenzkontext intakter C-Terminus wichtig, der allerdings für die Einleitung der PS Endoproteolyse nicht benötigt wird. Unabhängig von der Rolle bei der PS Endoproteolyse ist PEN-2 aber generell für die Reifung und Aktivität des gamma-Sekretasekomplexes wichtig.

Aktivierende Mutationen in Rezeptortyrosinkinasen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese solider und hämatologischer Neoplasien, wie der akuten myeloischen Leukämie (AML). Im Rahmen dieser Arbeit wurden bislang nicht-charakterisierte Mutationen der Protoonkogene c-KIT und FLT3, die in der AML auftreten, in Zellkulturmodellen auf ihr transformierendes Potential hin untersucht. In-frame-Mutationen in Exon 8 des c-KIT-Gens, die aus kleinen Deletionen mit oder ohne Insertionen im extrazellulären Bereich bestehen, treten nahezu ausschließlich in Core-binding-Faktor-Leukämien auf und verschlechtern die Prognose der betroffenen Patienten. Drei repräsentative Exon-8-Mutationen wurden stabil in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen exprimiert. Sie führten zur Hyperaktiverung des Rezeptors nach Ligandenstimulation, was sich in verstärkter Proliferation und Resistenz gegenüber Apoptose äußerte. In Rezeptor-Crosslinking-Experimenten zeigte eine repräsentative Exon-8-Mutante spontane und erhöhte liganden-induzierte Dimerisierung. Die biologischen Effekte konnten anhand einer erhöhten Phosphorylierung des nachgeordneten Signalmoleküls Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu hatte der FLT3-D324N-Single-Nukleotid-Polymorphismus, der in 6.4% von De-novo-AML-, 9.0% von CML- und 4.5% von ALL-Patientenproben detektiert wurde, keinerlei Auswirkungen auf die Prognose von AML-Patienten und wurde auch bei Kontrollpersonen gefunden (1.5%). Er wies keine funktionellen Unterschiede zu Wildtyp-FLT3 hinsichtlich Rezeptorphosphorylierung, Proliferation oder Apoptoseresistenz auf. Im Gegensatz zu Exon-8-Mutationen besitzen KIT-Mutationen in der Aktivierungsschleife, die – wie hier gezeigt wurde- die Prognose von Patienten mit günstigem Karyotyp verschlechtern, Resistenz gegenüber dem PTK-Inhibitor Imatinib. Zwei dem Imatinib nicht-verwandte Inhibitoren – PKC412 und SU5614 – wurden auf die Ansprechbarkeit von KIT-D816V getestet. Nur PKC412 war in der Lage, das spontane Wachstum von KIT-D816V-transduzierten Ba/F3-Zellen und die Rezeptorautophosphorylierung in HEK 293T-Zellen zu inhibieren. PKC412 führte überdies in den Ba/F3-Zellen zu einem deutlichen G0/G1-Arrest. Die beschriebenen In-vitro-Versuche können zwar einen ersten Einblick in die Rolle der untersuchten Mutationen in der AML bieten, tiefergehende Modelle sind jedoch vonnöten, um das Verständnis der Krankheitsentstehung in diesem Kontext zu erhöhen.

Die Grundlage für die Entstehung von Tumoren bildet der Erwerb genetischer Veränderungen, wobei neben Mutationen wie Chromosomeninstabilitäten, Insertionen, Deletionen oder Basenmutationen auch epigenetische Vorgänge von Bedeutung sind. Hierzu zählt die veränderte Methylierung von DNA in neoplastisch transformierten Zellen, die bei einigen Genen in deren transkriptionellen Inaktivierung resultiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Kolon- und Magenkarzinome auf bestehende Methylierungsdefekte in zwei Genen untersucht werden. Im ersten Teil wurde ein in die Mismatch-Reparatur involviertes Gen, das hMLH1-Gen, untersucht. Gastrointestinale Karzinome wurden hierbei hinsichtlich eines Zusammenhangs zwischen ihrer Mikrosatelliten- instabilität und einer möglichen Methylierung von Cytosinbasen im hMLH1-Promotor analysiert. Hierfür kam die Bisulfitmethode zur Anwendung, bei der die Umwandlung von unmethylierten Cytosinbasen zu Uracil erfolgt und die damit die Grundlage für die anschließende methylierungssensitive PCR bildet. Insgesamt ließ sich die Mikrosatelliten- instabilität bei sieben von neun untersuchten Karzinomproben auf Methylierung der proximalen Promotorsequenz zurückführen. Der Methylierungsstatus der beiden übrigen mikrosatelliteninstabilen Tumoren konnte nicht eindeutig bestimmt werden, obwohl die Vollständigkeit der Bisulfitmodifikation über den Nachweis des maternalen Methylierungsmusters des Exons 1 von SNRPN bestätigt wurde. Überdies konnte eine Deletion dieser Sequenz mittels Überprüfung der unbehandelten DNA ausgeschlossen werden. Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war die Untersuchung des CD95-Gens, eines Mitglieds der Tumor- Nekrose-Faktor-Rezeptor-Familie (sog. Todesrezeptoren), das eine entscheidende Rolle bei der ungestörten Apoptose von Zellen spielt. Grundlage hierfür waren die Ergebnisse von Peli et al., 1999, denen zufolge die CD95-Expression in mehreren etablierten Säugetierzellinien durch onkogenes Ras (H-Ras) herunterreguliert wird, wodurch sich eine Resistenz der Zellen für CD95L-induzierte Apoptose entwickelt. Hinweise aus den genannten Untersuchungen, die Inaktivierung von CD95 sei möglicherweise durch Methylierung des Promotors verursacht, sollte in der vorliegenden Arbeit anhand von gastrointestinalen Karzinomen näher analysiert werden. Hierzu wurde der Methylierungsstatus von Promotor, Exon 1 und Intron-Enhancer des CD95-Gens von 17 Tumorproben mit Ras-Mutationen (KRAS2-Mutation in Kodon 12) mittels methylierungssensitiver Restriktionsenzyme, nachfolgendem Southernblot und Hybridisierung ermittelt. Bei 16 Tumoren erbrachte die Restriktionsanalyse für Sma I ein Restriktionsmuster, das eine Methylierung der Cytosine der CCCGGG-Motive im genannten Bereich ausschließt. Die nicht geschnittene Sma I-Sequenz in einer Tumor-DNA (Position 143901) wurde auch für die Normal-DNA nachgewiesen und erwies sich als RFLP. Ein aufgrund dieses Ergebnisses postulierter Polymorphismus innerhalb einer Sma I- Schnittstelle konnte durch Sequenzierung der isolierten Sequenz aus dem entsprechenden Tumor verifiziert werden. Möglicherweise ist die Entstehung dieses Polymorphismus zwar die Folge einer ehemaligen Methylierung des Cytosins in der Konstellation CpG; allerdings konnte nachgewiesen werden, daß der entsprechende Nukleotidaustausch nicht im Rahmen der Karzinogenese erfolgt war, da die DNA aus PBL des gleichen Patienten die identische Sequenz aufwies. Insgesamt wurde somit für keinen der untersuchten Tumoren eine Abschaltung der CD95-Expression aufgrund einer Methylierung des Gens durch aktiviertes, onkogenes Ras festgestellt.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Deletionsscreening mittels qunatitativer Multiplex-PCR am Beispiel des APC-Gens etabliert, mit dem Deletionen ganzer Exons detektiert werden können. Die Gendosis einzelner Exons wird dabei durch Vergleich der Produktmengen der Exons untereinander und mit einem Kontrollexon eines anderen Gens ermittelt. Bei sechs der zwölf untersuchten DNA-Proben (Blut und Gewebe) konnten Deletionen eines oder mehrerer Exons nachgewiesen werden.

Summary CADASIL (cerebral autosomal arteriopathy with subcortical infarcts and eukoencephalopathy) is a autosomal dominant disease,which lead among other things to migraen headache and early stroke. Shortly before beginning of this work Notch3 was identified as responsible gene. Notch3 coded for a large transmembranereceptor with 34 extracellularly located,epidermal growth factor (EGF) similar domains. In this work 70 related families (70 index patients and 13 relatives) with bioptisch secured diagnosis in substantial two Exons (3 and 4) were examined, since within this range the mutations accumulate. By sequencing of Exon 3 and Exon 4 mutations in 70 % of the cases were identified. Three types of mutations were found: Point mutations ((n = 50), Dinukleotid mutation (n = 1) and Deletionen (n= 2). In addition numerous Polymorphismen was identified (n =43). Seven of the mutated nucleotides mutations arose frequently, whereby transitions of cytosine to thymine occure. All mutations including the Deletionen led either to an acquisition or a loss of a Cystein. Therefore it is to be accepted obviously that the change of a Cystein in a EGF similar domain of Notch3 represents the crucial mutation mechanical which is responsible for CADASIL. With the Polymorphismen no changes of the Cystein arose. Genotyp/Phaenotyp correlations could not be proven. This stands in the agreement with the uniformity of the mutations. Due to the results of this work an improvement in the procedure results for the existing diagnostics. Scinbiopsie and MRT photographs can be supplemented by the sequencing of Exon 3 and 4. Thus 2/3 of the mutations are already discovered. If no mutations are found there, still the remaining 22 Exons of the extracellular domain can be sequenzed, whereby here first on Exon 6 (and 12) the emphasis should be put. This procedure is used meanwhile as standard technique for the diagnostics. In this work as the further supplementing diagnostic method the analysis with mutation-specific restriction enzymes was developed. Under consultation of the theoretically computed restriction enzymes of the 7 most frequent mutations one receives 52% (amount of = 37) of the mutations with 70 index patients (74% of the found mutations). In families, in which a mutation already admits is, further family members with this method let themselves be examined faster and more economically, than by sequencing. In this work it could be shown that forecasts of mutation effects make the development of protein models possible on the protein structure. As possible working hypothesis a Conformationchange ore a Surfacechange can be accepted, the one effect on the connection partner be had can and possibly the function affected. An incorrect dismantling of the Notch3 of receptor leads to the fact that truncated receptor fragments collect in the Media of the vessels in the proximity of osmiophilen deposits. Because of the stereotyped mutations with those frequently so-called CpG (modulators of the Epigenetic)is present further possible mutations can be predicted.

10-15% der de novo akuten myeloischen Leukämie (AML) zeigen einen komplex aberranten Karyotyp, der definitionsgemäß mindesten 3 numerische und/oder strukturelle Veränderungen pro Karyotyp beinhaltet. Patienten mit diesem Karyotyp weisen eine besonders ungünstige Prognose auf. Über die Pathogenese bei dieser Subgruppe ist bisher nur wenig bekannt. Ziel dieser Studie war das Aberrationsmuster bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp detaillierter zu charakterisieren. Hierzu wurden 44 AML-Patienten, die in der Routinediagnostik nach der klassischen Zytogenetik (G-Banden Analyse), der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und der 24-Farben-FISH (M-FISH) einen komplex aberranten Karyotyp zeigten, zusätzlich mit der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH) untersucht. Diese auf der in situ Hybridisierung basierende Methode ermöglicht es, einen Überblick über Verluste und Vermehrungen des genetischen Materials in einem Versuchsansatz zu erhalten und diese den einzelnen Chromosomen auf Bandenebene zu zuordnen. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp besonders Verluste, die durch strukturelle Aberrationen entstanden, häufiger auftreten wie Zugewinne von genetischem Material. Deletionen lagen besonders häufig in den Bereichen 5q (91%), 7q (59%) und 17p (61%), während nur 2% der Patienten keine Veränderung in mindestens einer dieser drei Regionen zeigte. Weiterhin konnten Verluste den Chromsomen 12p, 13q, 16q, 18q zugeordnet werden. Zugewinne lagen besonders in den Chromosomen 8q und 11q. Mit CGH war es zusätzlich möglich bei 6 Patienten Amplifikationen in 11q zu detektieren. Das Aberrationsmuster der AML mit komplex aberrantem Karyotyp konnte mittels CGH genauer beschrieben werden. Die erhobenen Daten lassen eine genauere Definition der AML mit komplex aberranten Karyotyp als eigene Entität sinnvoll erscheinen. Diese beinhaltet das Fehlen einer spezifischen, primär balancierte Aberration, das Vorkommen von mindesten 5 Aberrationen pro Karyotyp und das Vorhandensein einer Deletion in mindestens einer der chromosomalen Banden 5q31, 7q31 und 17p13. Insgesamt konnten Verluste 7 bestimmten Chromosomenbereichen und Zugewinne 2 bestimmten Chromosomenregionen genauer zugeordnet werden. Diese Eingrenzung der involvierten Chromosomenbereiche bei dieser AML-Subgruppe dient der Suche nach relevanten Tumorsuppressor- und Onkogenen. Als weiterer Pathomechanismus scheint der Gendosiseffekt eine besondere Rolle bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp zu spielen, da Amplifikationen nur in dieser Subgruppe nachgewiesen wurden. Insgesamt scheint besonders die Komplexität unterschiedlicher Rearrangements und weniger eine spezifische Aberration für die so ungünstige Prognose verantwortlich zu sein.

Das TT-Virus wurde 1997 in Japan bei einem Patienten mit Non A-G-Hepatitis entdeckt. Weitere Arbeiten zeigten eine weite Verbreitung auch in der gesunden Bevölkerung, die sich vor allem durch den fäkal-oralen Übertragungsweg erklären lässt. Zudem konnte eine enorme genetische Variabilität innerhalb der TTV Familie mit bislang 39 beschriebenen Genotypen aufgeklärt werden. Diese ist charakteristisch für die Familie der Circoviren, zu der sich TTV phylogenetisch zuordnen lässt. Bei den schon bekannten tierischen Circoviren konnte festgestellt werden, dass geringe Sequenzunterschiede mit einer erheblich veränderten Pathogenität einhergehen. Bislang konnte trotz intensiver Forschungsarbeit keine Krankheitsassoziation für TTV nachgewiesen werden. Interessant sind jedoch erste Hinweise, dass die zur TTV-Familie gehörenden SENV-Isolate D und H mit Symptomen einer Hepatitis einhergehen. In dieser Arbeit konnten zwei SENV-H Isolate von unterschiedlichen Patienten charakteriert werden. Eine Krankheitsassoziation konnte jedoch bei beiden hier beschriebenen Isolaten nicht nachgewiesen werden. Bislang liegen wenige Arbeiten vor, die sich mit der Etablierung von TTV-genotypen-spezifischen Nachweisverfahren beschäftigen. Für das weitere Verständnis der TTV-Familie ist es jedoch unabdingbar, genotyp-spezifische Nachweisverfahren anzuwenden. In der vorliegenden Arbeit gelang ein solcher typ-spezifischer Nachweis mittels neuentwickelter Restriktions-Fragment-Längenpolymorphismus-Analyse (RFLP) für die TTV-Genotypen SENV-A und KAV. In einer Gruppe von 86 HCV-infizierten Patienten konnte eine Prävalenz von 9,3% für das SEN A Virus eine Prävalenz von 19,7% für KAV bestimmt werden. SENV-A Isolate konnten von vier verschiedenen Patienten sequenziert werden. Die Isolate zeigten dabei eine Homologie von mindestens 95%. Das KAV-Isolat ist dabei Prototyp des in dieser Studie neu entdeckten TTV-Genotyp 28. Es gelang, das Gesamtgenom von KAV zu sequenzieren. Genotyp 28 besitzt mit 3705 Nt das bis dahin kürzeste Genom aller TTV-Genotypen. Dabei fallen besonders zahlreiche Deletionen im Offenen Leserahmen 1 auf. Das KAV-Isolat konnte der zweiten genetischen Gruppe zugeordnet werden und stellt den vierten Genotyp dieser Gruppe dar. Durch Klonierung und anschließende Sequenzierungsanalyse wurden 28 TTV-Isolate gewonnen. Die Analyse dieser Sequenzen zeigte eine enorme genetische Variabilität mit fließenden Übergängen zwischen TTV-Geno- bzw. Subtypen. Einige Wissenschaftler gehen deshalb bei der TTV-Familie inzwischen von einem Virusschwarm aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit können als weitere Hinweis für die Richtigkeit dieser Theorie gewertet werden. Eine Gruppe von 86 HCV-infizierten Patienten wurde im Verlauf einer antiviralen Interferon-Therapie auch dreimal auf TTV untersucht. Dabei zeigte eine TTV-Prävalenz von 79,1% zu Beginn der IFN-Therapie. Nach Therapieende ergab sich ein signifikanter Rückgang auf 47,7%, wohingegen eine im Verlauf durchgeführte Follow-up-Untersuchung wieder einen signifikanten Anstieg der TTV-Prävalenz auf 61,6% ergab. Die hier entwickelte RFLP-Methode erwies sich als geeignet zur Analyse von TTV-Mehrfachinfektionen. Dabei zeigte sich eine Mehrfachinfektionsrate von 88%. Dieses Ergebnis läßt den Schluss zu, dass die Häufigkeit von TTV-Mehrfachinfektionen bislang erheblich unterschätzt wurde. Eine Mehrfachinfektion beeinflusste signifikant das Antwortverhaltens von TTV bezüglich Interferon. Das Vorliegen einer Mehrfachinfektion bei Therapiebeginn war mit einer signifikant schlechteren Virus-Clearance durch Interferon vergesellschaftet. Eine Infektion mit einem TT-Virus führte signifikant häufiger zum Verschwinden von TTV unter der antiviralen Therapie. Unter der IFN-Therapie verringerte sich der Anteil von Trägern von mehr als zwei TT-Viren von 47,7% auf 18,6%. Eine Beeinflussung des Therapieerfolgs bezüglich HCV durch das Vorliegen einer zusätzlichen TTV-Mehrfachinfektion konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In der Klonierungsanalyse der im Blut nachweisbaren Viruspopulation von fünf Patienten mit TTV-Mehrfachinfektion konnte eine außergewöhnliche Dynamik in der TTV-Population während der IFN-Therapie festgestellt werden. Sowohl das Verschwinden von Genotypen als auch das Auftreten neuer Genotypen wurde registriert. Bei einer Patientin waren während eines Jahres sieben TTV-Genotypen nachweisbar, wobei kein TTV-Genotyp zu allen drei Untersuchszeitpunkten nachweisbar war. Auch sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit für das Vorliegen großer Unterschiede in der IFN-Sensibilität einzelner TTV-Genotypen.

Das gasf?xF6;rmige Signalmolek?xFC;l Stickstoffmonoxid (NO) ist an der Steuerung vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Zahlreiche Studien weisen darauf hin, dass NO die Synthese des "second Messengers" cGMP bewirkt, welcher die cGMP-abh?xE4;ngige Proteinkinase Typ I (cGKI) aktiviert. Um die in vivo-Funktion der cGKI aufzukl?xE4;ren, wurden bereits konventionelle cGKI Knockout M?xE4;use generiert und analysiert. Da diese Nullmutanten einen multiplen Ph?xE4;notyp und eine stark verminderte Lebenserwartung aufweisen, k?xF6;nnen bestimmte Fragestellungen mit diesen Tieren nicht untersucht werden. Die Probleme, die sich aus der Deletion des cGKI Gens im gesamten Organismus ergeben, konnten durch die Methode der konditionalen somatischen Mutagenese mit Hilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems umgangen werden. Diese Technik erm?xF6;glicht es, ein Gen Zeit- und Gewebe-spezifisch auszuschalten und damit den schwerwiegenden Ph?xE4;notyp der konventionellen cGKI Mutanten zu umgehen. Ziel der Arbeit war es, konditional cGKI-defiziente M?xE4;use zu generieren, die cGKI Expression in diesen Tieren zu analysieren und deren Ph?xE4;notyp zu charakteriesieren. In dieser Arbeit sind vier konditional cGKI-defiziente Mausmutanten beschrieben, welche einen selektiven Verlust der cGKI im jeweils gew?xFC;nschten Gewebe (Hippocampus, Purkinje Zellen des Kleinhirns, Kardiomyozyten oder viszerale und vaskul?xE4;re glatte Muskelzellen) zeigten. Dadurch konnten erstmals Gewebe-spezifische Funktionen der cGKI in erwachsenen M?xE4;usen untersucht werden

Der menschliche Igl-Enhancer besteht aus den drei DNase I-hypersensitiven Regionen HSS-1, -2 und -3, wobei HSS-3 den eigentlichen Enhancer darstellt und HSS-1 und -2 gemeinsam auf HSS-3 synergistisch wirken. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die B-zellspezifische Region HSS-2 näher einzugrenzen und zu charakterisieren. Dazu wurden transiente Transfektionen und In-vivo-Footprinting-Versuche durchgeführt. Die Transfektionsexperimente erfolgten mit den reifen B-Zelllinien MN60 und Daudi. Dazu wurden Luciferasereportergenkonstrukte mit Punktmutationen in den beiden NFkB-Bindungsstellen von HSS-2 oder mit 5’- bzw. 3’-Deletionen in HSS-2 eingesetzt. Die Auswertung der Daten ergab, daß der Transkriptionsfaktor NFkB eine sehr wichtige Rolle in der Regulierung des humanen Igl-Locus spielt. Die Transkriptionskontrolle durch NFkB erfolgt als Bestandteil von Transkriptionskomplexen unter anderem über die Öffnung des Chromatins, womit die DNA auch für andere Faktoren zugänglich wird. Die anschließenden In-vivo-Footprinting-Versuche sollten Aufschluß über die Proteinbedeckung der genomischen DNA von B-Zellen in HSS-2 geben. Für die Untersuchungen wurden die reifen B-Zelllinien Daudi und MN60, die Prä-B-Zelllinie BV173, die T-Zelllinien Jurkat und CCRF-CEM und die myeloische Zelllinie K562 verwendet und zum Teil mit PMA oder TPCK vorbehandelt. Als Nachweismethode diente die LMPCR, als Vergleichs-DNA die freie Plazenta-DNA AF. Den meisten geschützten Sequenzbereichen, deren Anordnung eine Unterteilung von HSS-2 in zwei Teile ermöglicht, konnten mit der Datenbank Transfac bestimmte Faktoren zugeordnet werden. Einige der identifizierten Proteine spielen in der B-Zellentwicklung eine wichtige Rolle. Eine wahrscheinliche Bindung an die Sequenz des HSS-2-Bereichs ist von E47, Ikaros und NFkB anzunehmen. Alle drei stellen Transkriptionsfaktoren dar, die die B-Zellentwicklung und -differenzierung in verschiedenen Stadien steuern. Als Masterfaktor für die Chromatinöffnung im Igl-Locus kommt vermutlich E47 in Frage, die synergistische Wirkung von HSS-2 wird wahrscheinlich durch NFkB, Ikaros und E47 entscheidend beeinflußt.

Der menschliche Igl-Enhancer besteht aus den drei DNase I-hypersensitiven Regionen HSS-1, -2 und -3, wobei HSS-3 den eigentlichen Enhancer darstellt und HSS-1 und -2 gemeinsam auf HSS-3 synergistisch wirken. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die B-zellspezifische Region HSS-2 näher einzugrenzen und zu charakterisieren. Dazu wurden transiente Transfektionen und In-vivo-Footprinting-Versuche durchgeführt. Die Transfektionsexperimente erfolgten mit den reifen B-Zelllinien MN60 und Daudi. Dazu wurden Luciferasereportergenkonstrukte mit Punktmutationen in den beiden NFkB-Bindungsstellen von HSS-2 oder mit 5’- bzw. 3’-Deletionen in HSS-2 eingesetzt. Die Auswertung der Daten ergab, daß der Transkriptionsfaktor NFkB eine sehr wichtige Rolle in der Regulierung des humanen Igl-Locus spielt. Die Transkriptionskontrolle durch NFkB erfolgt als Bestandteil von Transkriptionskomplexen unter anderem über die Öffnung des Chromatins, womit die DNA auch für andere Faktoren zugänglich wird. Die anschließenden In-vivo-Footprinting-Versuche sollten Aufschluß über die Proteinbedeckung der genomischen DNA von B-Zellen in HSS-2 geben. Für die Untersuchungen wurden die reifen B-Zelllinien Daudi und MN60, die Prä-B-Zelllinie BV173, die T-Zelllinien Jurkat und CCRF-CEM und die myeloische Zelllinie K562 verwendet und zum Teil mit PMA oder TPCK vorbehandelt. Als Nachweismethode diente die LMPCR, als Vergleichs-DNA die freie Plazenta-DNA AF. Den meisten geschützten Sequenzbereichen, deren Anordnung eine Unterteilung von HSS-2 in zwei Teile ermöglicht, konnten mit der Datenbank Transfac bestimmte Faktoren zugeordnet werden. Einige der identifizierten Proteine spielen in der B-Zellentwicklung eine wichtige Rolle. Eine wahrscheinliche Bindung an die Sequenz des HSS-2-Bereichs ist von E47, Ikaros und NFkB anzunehmen. Alle drei stellen Transkriptionsfaktoren dar, die die B-Zellentwicklung und -differenzierung in verschiedenen Stadien steuern. Als Masterfaktor für die Chromatinöffnung im Igl-Locus kommt vermutlich E47 in Frage, die synergistische Wirkung von HSS-2 wird wahrscheinlich durch NFkB, Ikaros und E47 entscheidend beeinflußt.

Die vorliegende Promotionsarbeit beschäftigt sich vorwiegend mit der Untersuchung von Patienten mit partieller Monosomie 10p. Der Phänotyp dieser Patienten ähnelt häufig dem des DiGeorge-Syndroms. Neben fazialen Dysmorphien und weiteren Nebensymptomen ist die Symptomentrias Herzfehler, T-Zelldefekt und Hypoparathyreoidismus das typische Merkmal dieses Entwicklungsdefektes. Viele Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p zeigen diese Symptome, was für einen DiGeorge-Syndrom-Locus auf Chromosom 10p spricht. Der Hauptlocus für das DiGeorge-Syndrom liegt jedoch auf Chromosom 22q11. Mehr als 90 % der DiGeorge-Syndrom-Patienten haben eine Mikrodeletion 22q11. Diese Mikrodeletion zählt mit einer Frequenz von etwa 1/4000 zu den häufigsten Deletionen beim Menschen überhaupt und ist deshalb schon seit langem das Ziel intensiver Forschungstätigkeit. Dennoch ist es erst in der jüngsten Zeit gelungen, zumindest ein Gen aus der Mikrodeletionsregion 22q11 (TBX-1) zu isolieren, welches für den beobachteten Herzfehler verantwortlich sein könnte. Ansonsten sind die molekularen Ursachen dieses Entwicklunsdefektes noch immer weitgehend unbekannt. Die Deletionen auf Chromosom 10p sind sehr selten. Sie sind aber von wissenschaftlichem Interesse, da die molekulare Aufklärung dieser Region zu einem tieferen Verständnis der Pathogenese des DiGeorge-Syndroms und isolierter Fehlbildungen insgesamt beitragen kann. Im ersten Teil der Arbeit wurden 16 Patienten mit partieller Monosomie 10p zytogenetisch und molekulargenetisch untersucht. Elf dieser Patienten zeigten einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp, fünf Patienten wurden nicht in das DiGeorge-Syndrom-Krankheitsbild eingeordnet. Die Patienten besaßen terminale und interstitielle Deletionen im Größenbereich von 13-48 cM. Mit Hilfe von FISH mit genomischen YAC-, PAC- und BAC-Sonden wurden die Bruchpunktregionen in den Patienten bestimmt. Bei einigen Patienten, bei denen DNA der Eltern vorlag, konnte auch eine Genotypisierung mit polymorphen Markern aus der Region vorgenommen werden. Mittels zweier Patienten konnte eine Haploinsuffizienzregion (DGCR2) kartiert werden, die für den Herzfehler und den T-Zelldefekt verantwortlich sein sollte. Die Region DGCR2 ist um den Marker D10S585 lokalisiert und besitzt eine minimale Ausdehnung von etwa 300 kb. Eine genaue Genotyp-Phänotyp-Analyse unter Einbeziehung von Patienten aus der Literatur zeigte jedoch, daß der gesamte Phänotyp der partiellen Monosomie 10p nicht mit der Haploinsuffizienz nur einer Region erklärt werden konnte, sondern daß zumindest noch ein zweiter Locus (HDR1) deletiert sein mußte. Dieser Locus war mit dem typischen DiGeorge-Syndrom-Symptom des Hypoparathyreoidismus assoziiert. Zusätzlich kartierten in diesen Locus noch eine sensorineurale Taubheit und Nierendefekte. Patienten mit diesen drei Symptomen leiden an einem HDR-Syndrom. Dieser zweite Haploinsuffizienzlocus HDR1 kartiert etwa 3 Mb distal zur Region DGCR2. Im zweiten Teil der Arbeit wurde sowohl über die Region DGCR2 als auch über die HDR1-Region ein PAC/BAC-Contig etabliert. Ausgewählte Klone aus den Contigs wurden im Rahmen des Humangenomprojekts vom Sanger Centre sequenziert. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der molekulargenetischen Untersuchung der beiden Haploinsuffizienzregionen DGCR2 und HDR1. Es konnten 12 EST-Klone in die Region DGCR2 kartiert werden. Bei allen Klonen handelte es sich um Transkripte, die nicht zu funktionellen Proteinen translatiert wurden. Nachdem die genomische Sequenz zugänglich war, konnte eine In-silico-Analyse dieser Region durchgeführt werden. Es handelt sich um eine sehr genarme Region. In die minimale Region DGCR2 kartiert nur das Gen NAPOR, das für ein RNA bindendes Protein kodiert. Es wurde als Kandidatengen für den mit dieser Region assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt näher charakterisiert. Eine Northern-Blot-Hybridisierung zeigte eine Expression in allen aufgetragenen Herzgeweben. Es wurden mindestens sechs verschiedene Transkripte identifiziert, was für die Existenz mehrerer Isoformen des Gens spricht. RNA-in-situ-Hybridisierungen auf Schnitte humaner Embryos und Foeten ergaben eine Genexpression in verschiedenen Geweben beginnend von Embryos des Carnegie-Stadiums C12 bis zu 18 Wochen alten Foeten. Es wurde eine Expression im Thymus vom Carnegie-Stadium C16 an und eine Expression im Herzen bei einem Foetus der 9. Woche beobachtet. Das Expressionsmuster machte NAPOR zu einem guten Kandidatengen für den mit der Haploinsuffizienzregion DGCR2 assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt. Mutationsanalysen in mehr als 100 Patienten ergaben keine Mutationen im NAPOR-Gen. Die meisten untersuchten Patienten besaßen einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp waren aber zytogenetisch normal. Besonderer Wert wurde auf die Anwesenheit eines Herzfehlers gelegt. Nur bei etwa 10 % der untersuchten Patienten lag auch eine Thymus-Hypoplasie vor. Ein direkter Beweis für die Beteiligung des NAPOR-Gens am Herzfehler und/oder T-Zelldefekt bei Patienten mit partieller Monosomie 10p steht noch aus. Die HDR1-Region konnte mit Hilfe zweier Mikrodeletionspatienten auf etwa 200 kb eingegrenzt werden. In diese Region kartiert das Gen GATA-3. Mutationsanalysen in zytogenetisch normalen HDR-Patienten zeigten in drei Patienten Mutationen, die zu einem funktionslosen GATA-3-Protein führen. Damit wurde der Beweis erbracht, daß das HDR-Syndrom eine Einzelgenerkrankung ist und daß die Symptome Hypoparathyreoidismus,sensorineurale Taubheit und Nierendefekte bei Patienten mit partieller Monosomie 10p auf eine Haploinsuffizienz des GATA-3-Gens zurückzuführen sind. Zusätzlich zu Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p wurden auch zwei Patienten näher charakterisiert, die eine interstitielle Deletion auf dem Chromosom 14q11-q13 aufwiesen. Diese Region war von Interesse, da das Gen PAX-9 dorthin kartiert und homozygote Pax9 -/- Knockout-Mäuse unter anderem eine Thymus-Hypoplasie und einen Hypoparathyreoidismus zeigen. Die Mäuse haben zwei der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms und stellen eine Beziehung zum Phänotyp der partiellen Monosomie 10p her. Die Deletionsbruchpunktregionen der beiden Patienten wurden über eine Genotypisierung mit polymorphen Markern identifiziert. Mit Hilfe eines Dosis-Blots und einer FISH-Analyse konnte gezeigt werden, daß beide Patienten für PAX-9 hemizygot waren. Beide Patienten zeigen keine Symptome des DiGeorge-Syndroms, was daraufhin weist, daß beim Menschen eine PAX-9-Haploinsuffizienz nicht zu einem DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp führt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen an Patienten mit partieller Monosomie 10p und an Patienten mit einer interstitiellen Deletion 14q11-q13 lieferten einen Beitrag zur molekulargenetischen Charakterisierung des DiGeorge-Syndroms. Der DiGeorge-Syndrom ähnliche Phänotyp bei vielen Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p ist das Resultat eines Contiguous Gene Syndroms, bei dem mindestens zwei unabhängige Regionen (DGCR2 und HDR1) auf Chromosom 10p hemizygot vorliegen müssen. Es wurde gezeigt, daß eine GATA-3-Haploinsuffizienz u.a. zu einem Hypoparathyreoidismus führt, einem der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms. Für den mit dem Syndrom assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt wurde mit NAPOR ein gutes Kandidatengen aus der Haploinsuffizienzregion DGCR2 identifiziert und charakterisiert. Eine Haploinsuffizienz des PAX-9-Gens auf Chromosom 14q12 führt zu keinem DiGeorge-Syndrom beim Menschen.

Die Aktivierung naiver Lymphozyten bezeichnet einen komplexen, immunmodulatorischen Prozeß, in dessen Verlauf mitotisch inaktive B- und T-Zellen als Folge des Kontakts mit Antigen in den Zellzyklus eintreten, proliferieren und anschließend zu spezifischen Effektorzellen oder zu langlebigen Gedächtniszellen differenzieren. Die klonale Expansion von Lymphozyten ist somit einerseits bedeutsam für die Förderung der akuten Immunantwort, andererseits ist sie auch Voraussetzung für die Etablierung von dauerhafter, adaptiver Immunität, deren zelluläre Grundlage die lymphozytären Gedächtniszellen darstellen. Auf wiederholte Antigen-Exposition reagieren Lymphozyten mit unmittelbarer und effizienter Aktivierung der Effektorfunktionen, beispielsweise der Produktion von Antikörpern durch BZellen oder der zytotoxischen bzw. immunmodulatorischen Aktivität von T-Zellen. Die Spezifität der Antigen-Erkennung wird in Lymphozyten durch hypervariable Antigenrezeptoren gewährleistet, deren Stimulation ein komplexes Netzwerk von Signaltransduktionsprozessen im Zellinneren initiiert. In T-Lymphozyten des Helfertyps resultieren diese Signalkaskaden unter anderem in der transkriptionellen Induktion des IL-2 Promotors. Das Signal des Antigenrezeptors wird jedoch moduliert durch die Aktivität von Corezeptoren, im Falle von T-Helferzellen beispielsweise unter Beteiligung des CD4-Moleküls. CD4 bindet an konstante Bereiche der antigenpräsentierenden MHC-II-Moleküle und stabilisiert so deren Interaktion mit dem T-Zell-Antigenrezeptor (TCR). Detaillierte Untersuchungen zu den Mechanismen der Koordination und Integration von Signalen des T-Zell-Antigenrezeptors mit denen des CD4-Moleküls bildeten das übergeordnete Thema der vorliegenden Arbeit. Sowohl der T-Zell-Antigenrezeptor als auch CD4 gehören zu einer Klasse von Rezeptoren, deren zytoplasmatische Anteile an Proteintyrosinkinasen (PTKs) koppeln. CD4 interagiert konstitutiv und nahezu stöchiometrisch mit der src-ähnlichen Kinase p56lck, welche während der Induktion von T-Zell Aktivierung eng mit der TCR-assoziierten Syk-ähnlichen Kinase ZAP-70 zu kooperieren vermag. Die Verknüpfung beider Kinasen mit den nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden erfolgt durch die Phosphorylierung spezifischer Substrate, welche zu Beginn dieser Untersuchungen noch größtenteils unbekannt waren. Zwei unabhängige experimentelle Ansätze sollten eine Identifikation potentieller in vivo Substrate der Tyrosinkinase ZAP-70 ermöglichen. Aufgrund von Befunden mit transmembran exprimierten Kinase-Fusionsproteine konnten mehrere Phosphoproteine als wahrscheinliche Substrate von ZAP-70 bestätigt werden, die zur selben Zeit von anderen Autoren als solche diskutiert wurden. Die zweite, parallel verfolgte experimentelle Strategie zielte auf die Charakterisierung einer konstitutiv-aktiven Variante von ZAP-70, deren Expression in TZellen zu einer Entkopplung von stimulierenden Signalen und somit zur Phosphorylierung spezifisch nachgeschalteter Substrate führen sollte. Tatsächlich konnte - durch Substitution carboxyterminaler Tyrosinreste von ZAP-70 - eine funktionell konstitutiv-aktive Mutante generiert und deren Substrate in vivo analysiert werden. Dieser Ansatz resultierte in der Charakterisierung einer bislang unvermuteten, positiv-regulatorischen Rückkopplungsschleife zwischen ZAP-70 und der ζ-Untereinheit des T-Zell-Antigenrezeptors. Dieser Rückkopplungsmechanismus könnte bedeutsam sein für die Amplifikation von Signalen des T– Zell Rezeptors. Dem Carboxyterminus von ZAP-70 würde somit entscheidendes Potential zur Modulation von T-Zell Aktivierung zukommen. Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Charakterisierung des bislang unbekannten Proteins ACP33, welches im Vorfeld als ein potentieller Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne von CD4 identifiziert worden war. Verschiedene Befunde hatten zuvor darauf schließen lassen, daß - neben p56lck - alternative intrazelluläre Liganden von CD4 existieren könnten. Mittels der Two-Hybrid Methodik konnte daraufhin die cDNA des ACP33 Proteins kloniert und zudem dessen Bindungsspezifität analysiert werden. ACP33 besitzt offenbar eine peptidbindende Domäne, welche spezifisch eine Kombination zweier hydrophober, nicht-aromatischer Aminosäurereste am Carboxyterminus von Peptiden erkennt. In der zytoplasmatischen Domäne von humanem CD4 und der aller bekannter CD4-Orthologe ist ein derartiges Interaktionsmotiv konserviert. Copräzipitationsexperimente und Mutationsanalysen bestätigten, daß C-terminale Deletionen von CD4 einen Verlust der Interaktion mit ACP33 zur Folge haben. Derselbe Effekt resultierte überraschenderweise auch aus der Substitution des Serinrestes 109 in ACP33, wodurch eine zu Hydrolasen homologe Region des ACP33 Proteins als neuartige peptidbindende Domäne identifiziert werden konnte. Funktionelle Analysen der carboxyterminalen CD4-Deletionsmutanten identifizierte das Interaktionsmotiv mit ACP33 als eine inhibitorische Determinante der antigenabhängigen T-Zell Aktivierung. ACP33 könnte demnach als eine negativ-regulatorische Komponente des Signalnetzwerkes einen bedeutenden Beitrag zur Modulation von TZell Aktivierung leisten. Zusammengenommen verdeutlichen die Resultate beider Teilprojekte, daß Regulation von T-Zell Aktivierung als ein integrativer Prozeß aus stimulatorischen und inhibitorischen Signalen anzusehen ist. Detailliertere Analysen zur Koordination dieser gegensätzlichen Signale sollte in Zukunft wesentlich zu einem besseren Verständnis von T-Zell Aktivierungsprozessen beitragen.