Podcasts about die nachweisgrenze

In den letzten Jahren hat ein durch psychrophile und psychrotolerante Clostridium spp. ausgelöstes Verderbsgeschehen bei vakuumverpacktem Rindfleisch, bei dem es zum Aufgasen der Vakuumverpackungen kommt, immer mehr an Bedeutung gewonnen. Neben C. estertheticum und C. gasigenes wurden eine Reihe verschiedener psychrophiler Clostridien beschrieben, die die Fähigkeit für dieses Verderbsgeschehen besitzen. Da divergente Beschreibungen dieser verderbsverursachenden Bakterien vorliegen, wurden sechs psychrotolerante Clostridien-Referenzstämme phänotypisch untersucht und die Ergebnisse mit bereits bestehenden Studien verglichen. Dabei wurden insbesondere hinsichtlich des Hämolyseverhaltens auf Blutagarplatten sowie der Größe der vegetativen Zellen abweichende Ergebnisse ermittelt. Bei der Untersuchung von C. gasigenes wurden obendrein im letzten Drittel der Stäbchen deutliche Querfortsätze beobachtet, die nach derzeitigem Kenntnisstand bisher in der Literatur nicht beschrieben wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mehr Erkenntnisse über das Vorkommen und die Verbreitung von psychrotoleranten Clostridien in fleischverarbeitenden Betrieben zu erlangen. Im Vorfeld dazu wurde die Nachweisbarkeit von C. estertheticum-Sporen von unterschiedlichen, häufig in fleischverarbeitenden Betrieben vorkommenden Oberflächen mittels Wattetupfern überprüft. Dabei konnten Sporen auf Kunststoff- und Edelstahloberflächen nachgewiesen werden, wobei die Nachweisintensität bei glatten Kunststoff- und Edelstahloberflächen annähernd gleich ausfiel, während die Nachweisintensität bei eingekerbten Kunststoffoberflächen deutlich abnahm. Da bislang kein PCR-System zum Nachweis von C. bowmanii und C. frigoris vorhanden war, wurde zur Beantwortung der Fragestellung ein neues PCR- System entwickelt sowie das von Broda et al. (2003a) entwickelte System zum Nachweis von C. gasigenes modifiziert. Bei Anwendung der konventionellen Gelelektrophorese lag die Nachweisgrenze von vegetativen Zellen im Bereich von 10 bis 10³ Organismen/ml Fleischtropfsaft. Bei Anwendung des Experion Automated Electrophoresis System mit vorangehender Aufreinigung der PCR-Produkte lag die Nachweisgrenze zwischen 10³ und 10^4 Organismen/ml Fleischtropfsaft. Die Nachweisgrenze für Sporen von C. frigoris und C. gasigenes war sowohl bei Anwendung der konventionellen Gelelektrophorese als auch bei Anwendung des Experion Automated Electrophoresis Systems für den jeweiligen Keim identisch. Sie lag bei C. frigoris bei 10^5 Organismen/ml Fleischtropfsaft, bei C. gasigenes bei 10² Organismen/ml Fleischtropfsaft. Die Nachweisgrenze für Sporen von C. bowmanii konnte aus technischen Gründen nicht ermittelt werden. Beim Vergleich des konventionellen sowie des automatisierten Elektrophorese-Systems zeigte sich, dass es bei einer Aufreinigung der PCR-Produkte zu DNA-Verlusten kommen kann, die sich in der Ermittlung der Nachweisgrenze widerspiegeln. Wird auf eine Aufreinigung verzichtet, führen beide Elektrophorese-Methoden zu gleich guten Ergebnissen. Abschließend wurden drei fleischverarbeitende Betriebe auf das Vorkommen von C. estertheticum, C. gasigenes, C. frigoris und C. bowmanii unter Anwendung der entwickelten Methoden untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass in jedem Betrieb C. estertheticum und C. estertheticum-like Organismen vorhanden waren. C. frigoris wurde ebenfalls in allen Betrieben detektiert, jedoch mit deutlich geringerer Häufigkeit, wohingegen C. bowmanii nur in einer Probe in Betrieb C nachweisbar war. C. gasigenes wurde ebenfalls nur in Betrieb C an zwölf verschiedenen Beprobungsstellen nachgewiesen. In den drei Betrieben wurden unterschiedliche Maßnahmen zur Eliminierung der psychrotoleranten Clostridien ergriffen und der Erfolg der Maßnahmen durch erneute Untersuchungen kontrolliert. Dabei wurde deutlich, dass durch die Verbesserung der allgemeinen Betriebshygiene und durch die Anwendung von peressigsäurehaltigen Desinfektionsmitteln die Nachweisbarkeit von psychrotoleranten Clostridien erheblich gesenkt werden konnte. Durch die Grundsanierung eines ursprünglich stark kontaminierten Betriebes wurde erreicht, dass keine der im Anschluss daran genommenen Tupferproben zu einem positiven Ergebnis auf psychrotolerante Clostridien führte.

Zum Nachweis von PrPc und PrPsc wurde eine Kapillarelektrophorese-Immunofluoreszenz-Methode (CE-LIF) etabliert und mit konventionellen Verfahren (ELISA, Westernblot, Dot-EIA) verglichen. Zur CE-LIF wurde der monoklonale Antikörper F89 und ein Fluoreszenz-markiertes Peptid (FITC-P3) eingesetzt. Die Nachweisgrenze für rekombinantes bovines PrPc liegt bei 1 pg/Test. Zur Anreicherung von PrPsc aus Hirn und Liquor wurden (Ultra-) Zentrifugations-, Extraktions- (HFIP) und Chromatographieverfahren (HPLC, Festphasenextraktion) einzeln oder in Kom-binationen geprüft; darüber hinaus wurden Anreicherungsversuche mit Affinität- bzw. Immu-nomagnetischer Separation vorgenommen. Die Überprüfung des PrPsc-Gehaltes ausgewählter Extrakte im Vergleich zum Ausgangsma-terial mittels ELISA ergab deutliche Substanzverluste. Eine selektive Bindung von PrPsc an Dynabeads® gekoppeltem Plasminogen konnte nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde eine Anlagerung an Antikörper-beschichteten Beads festgestellt. Allerdings war die Bin-dungskapazität der Beads bei Versuchen in mit in PBS gelöstem PrPc oder PrPsc höher als bei vergleichbaren Versuchen mit Liquor. Bei der kapillarelektrophoretischen Analyse erwiesen sich alle mittels einfacher Probenauf-bereitung hergestellten Extrakte als ungeeignet. Sie führten entweder zu technischen Prob-lemen (Verstopfung der Kapillare; Durchbrennen) oder zu Interferenzen im Elektrophe-rogramm, die eine Auswertung nicht ermöglichten. Die Aufbereitung mittels HPLC ergab zwar verwendbare Präparationen, allerdings variierte die Retentionszeit von PrPsc derart stark, dass dieses Verfahren nicht weiter eingesetzt wurde. Bezüglich der Verwertbarkeit von CE-LIF wurden die besten Resultate mit Hilfe einer Aufreinigung nach Bio-Rad® mit an-schließender Festphasenextraktion erzielt. Während der Nachweis von PrPsc mittels CE-LIF aus Hirngewebe eindeutig gelang, führte die Untersuchung des Liquors eines bekannt BSE-positiven Tieres zu keinem eindeutigen Ergebnis. Prinzipiell ist die CE-LIF zum Nachweis von PrPsc geeignet. Allerdings handelt es sich dabei um ein sehr störanfälliges Verfahren. Die Sensitivität kann deutlich erhöht werden, wenn die Konzentration von PrPsc in kleine Volumina noch besser gelingt.

Bis vor wenigen Jahren war es üblich, Gehirne von Rindern und Schweinen in Fleischerzeugnisse zu mischen. Erst nachdem die Bovine Spongiforme Enzephalopathie entdeckt worden war, wurde Rindergehirn zum Spezifizierten Risikomaterial deklariert, da bei einer Infektion vor allem in diesem Organ die pathogenen Prionen vorhanden sind. Daraufhin entwickelte Testsysteme zum Nachweis von ZNS in Fleischerzeugnissen ermöglichten keinen gezielten Nachweis von bovinem Nervengewebe. Dies führte im Falle eines Testsystems zu falschpositiven Ergebnissen bei Schweinefleisch und Geflügelfleisch, begleitet von wirtschaftlichen Folgen für die Hersteller von Fleischerzeugnissen. In dieser Arbeit wurde ein speziesspezifisches Nachweisverfahren für bovines Nervengewebe in Fleischerzeugnissen entwickelt. Dabei handelt es sich um einen indirekten ELISA, der auf der Detektion des Myelin Basic Protein (MBP) basiert. Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers wird ein kontinuierliches Epitop dieses Proteins nachgewiesen. Diese Epitop ist wahrscheinlich auch dafür verantwortlich, dass der Nachweis des MBP auch nach lang anhaltenden und hohen Temperaturen, die zur Denaturierung anderer Proteine führen würden, noch möglich ist. Die Nachweisgrenze konnte auf 0,1 % Rindergehirn in Brühwurst bzw. Fleischerzeugnissen mit einem Cut-off von 0.500 festgelegt werden. Damit stellt der etablierte MBP-ELISA ein sensitives Verfahren dar, welches den speziesspezifischen Nachweis von bovinem Nervengewebe in Fleischerzeugnissen ermöglicht. Für den Verbraucherschutz wird mit dem MBP-ELISA die Möglichkeit eröffnet, das Verwendungsverbot von Rindergehirn zu kontrollieren.

Im Literaturüberblick der vorliegenden Arbeit wird besonders auf die ökonomische und ökologische Bedeutung der Flusskrebse, den derzeitigen Stand der Forschung die Krebspest betreffend und die aktuelle taxonomische Klassifikation des Krebspesterregers, Aphanomyces astaci, eingegangen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine zuverlässige und schnelle Methode zum spezifischen und sensitiven Nachweis von Aphanomyces astaci direkt aus Krebsgewebe zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein kommerzielles Fertigkit (DNeasy® Tissue Kit, Qiagen) als geeignete DNA-Extraktionsmethode ausgewählt. Als Untersuchungsmaterial wurde die Abdominalkutikula von Edelkrebsen (Astacus astacus) eingesetzt. Anhand von Genomanalysen der ITS-Regionen (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen) verschiedener Oomycota wurden Oligonukleotid-Primer konstruiert, optimiert und auf ihre Eignung überprüft. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurden zwei PCR-Protokolle etabliert: eine Semi-Nested und eine Nested PCR. Die Semi-Nested PCR, die sich für die Routinediagnostik von Aphanomyces astaci als wenig geeignet erwiesen hat, bietet das Potential, als Grundlage für weiterführende Studien an anderen Arten der Gattung Aphanomyces zu dienen. Die Nested PCR mit den äußeren Primern NS 166/NS 681 und den inneren Primern BO 525/BO 640 ergab mit allen 20 untersuchten Aphanomyces astaci-Stämmen ein PCR-Produkt von etwa 115 bp, das mit einer anschließenden Restriktionsenzym-Analyse mit der Endonuklease Hph I verifiziert werden konnte. Die Nested PCR zeigte sich hochspezifisch gegenüber Aphanomyces astaci, während die DNA von anderen bei Krebsen und im Wasser vorkommenden Krankheitserregern und die DNA von Wirtsgewebe nicht amplifiziert wurde, was Grundvoraussetzung für den Einsatz dieser PCR als Standardmethode ist. Die Nachweisgrenze der Nested PCR lag bei Verwendung von Plasmid-DNA bei 1,9 genomischen Einheiten und bei Einsatz von genomischer DNA aus Pilzmyzel bei 1 ag. Als Zusammenfassung 172 Aphanomyces astaci-Sporen in die DNA-Extraktion eingesetzt wurden, lag die Nachweisgrenze bei 1 Spore. Zusätzlich wurden Infektionsversuche durchgeführt, bei denen Edelkrebse mit 10, 100 und 1000 Aphanomyces astaci-Zoosporen/ml infiziert wurden. Ein positives PCR-Ergebnis konnte ab Tag 2 post expositionem (entspricht dem Tag der ersten Probenentnahme) mit der beschriebenen Methode bei allen untersuchten Tieren beobachtet werden. Schließlich wurde eine Validierung der entwickelten Nested PCR unter Einsatz von Wirtskutikula anhand 19 diagnostischer Proben unterschiedlicher Herkunft innerhalb Europas (aus Deutschland, der Schweiz, Österreich, Schweden und England) durchgeführt und die Ergebnisse mittels RFLP verifiziert. Mit der in der vorliegenden Arbeit entwickelten molekularbiologischen Nachweismethode steht ein Verfahren zur Verfügung, das eine zuverlässige Diagnose von Aphanomyces astaci bereits im Anfangsstadium der Infektion direkt aus Krebsgewebe ermöglicht und innerhalb von 12 bis 15 Stunden (Sektion, DNA-Extraktion, Nested PCR, Agarosegel-Elektrophorese und bestätigende Restriktionsenzym-Analyse) durchführbar ist. Diese Methode ist somit ein geeignetes und zuverlässiges Mittel, um in Programmen zur Seuchenbekämpfung der Krebspest (Aphanomyces astaci) eingesetzt zu werden.