Podcasts about histologische untersuchungen

Monoklonale Antikörper sind unverzichtbare Hilfsmittel, um Proteinkomplexe aus Zellen zu isolieren oder Proteine in Gewebeschnitten zu lokalisieren. Sie dienen auch dazu, Entwicklungsvorgänge aufzuklären. Dabei wird als Modellorganismus für Vertebraten oft der Zebrafisch gewählt, da er sich asaisonal vermehrt, eine zahlreiche Nachkommenschaft hat und sowohl die Befruchtung als auch die Entwicklung außerhalb des Mutterleibs erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper generiert, die spezifisch mit neuronalen Geweben und Organen des Zebrafisches reagieren. Zur Immunisierung wurde Gehirngewebe des Zebrafisches verwendet. Immunisiert wurden Ratten. Antikörperbildende B-Zellen aus der Ratte wurden mit einer Mausmyelom-Zelllinie fusioniert. Proteine von Interesse wurden mit Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des Zebrafisch-Gehirns immunpräzipitiert und durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die durch Antikörper detektierbaren Banden wurden ausgeschnitten und die enthaltenen Proteine mit massenspektrometrischen Techniken identifiziert. In einem weiteren Ansatz diente eine in λ-Phagen einklonierte Genbank der Expression der Proteine. Die Proteine wurden ebenfalls mit monoklonalen Antikörpern identifiziert. Die Phagen, die diese Proteine produzierten, wurden vermehrt und die für das Protein kodierende DNA sequenziert. Wir haben unsere Anstrengungen vor allem auf Proteine neuronalen Ursprungs konzentriert, weil diese Strukturen in den Fischen besonders deutlich markiert wurden. Histologische Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass die Antikörper mit neuronalen Strukturen vieler Spezies reagierten, was auf eine hohe Konservierung der Proteine in der Phylogenese schließen lässt. Aus drei Fusionen mit Milzzellen von immunisierten Ratten wurden 2400 Zellüberstände erzeugt, die auf ihre Immunglobulin-Subklasse getestet wurden. IgG-positive Überstände wurden auf histologischen Schnitten untersucht. Schließlich wurden 17 Klone etabliert, die mit Nervengewebe des Zebrafisches reagierten, und weitere 9 Klone, die sowohl mit neuronalen Zellen des Zebrafisches als auch mit neuronalem Gewebe anderer Spezies reagierten. Die von den einzelnen Antikörpern erkannten Proteine wurden entweder massenspektrometrisch oder mittels einer Expressionsgenbank, die aus drei Tage alten Zebrafischlarven hergestellt wurde, identifiziert. Es wurden Antikörper gegen folgende Proteine gefunden: 1. Tenascin R 2. Plasticin 3. TOPAP 4. VAT-1 Es wurden 16 monoklonale Antikörper, die gegen fünf verschiedene humane Antigene hergestellt worden waren, auf Kreuzreaktivität mit Zebrafischgehirn getestet. Die Antikörper reagierten sowohl mit dem Hirn des Zebrafisches als auch mit dem Hirn acht verschiedener Säugerspezies. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Versuch unternommen, gezielt gegen ein Fusionskonstrukt, das Teile des humanen Parkins enthielt, monoklonale Antikörper herzustellen. Aus vier Fusionen wurden nur drei spezifisch mit dem Antigen reagierende Antikörper selektiert, die auch im Western-Blot mit Parkin reagierten. In vivo wurde das Antigen in histologischen Schnitten jedoch nicht erkannt.

Seit der ersten Charakterisierung des Ih-Stroms wird dessen Funktion im Herzen, insbesondere während der langsamen spontanen Depolarisation im Sinusknoten kontrovers diskutiert. 1998 gelang es mehreren Arbeitsgruppen unabhängig voneinander, die entsprechenden Gene zu identifizieren, die für die Ih-Kanäle kodieren. Diese HCN-Genfamilie umfasst 4 Isoformen, wobei jede Isoform ein spezifisches Expressionsmuster besitzt. Im Säugetiersinusknoten konnte auf Transkriptebene gezeigt werden, dass HCN4 die dominante HCN Isoform darstellt. Um die physiologische Funktion von HCN4 aufzuklären wurden in der vorliegenden Arbeit Mäuse generiert und analysiert, die für diese HCN Isoform defizient sind. Es konnte gezeigt werden, dass HCN4 für die Funktion des sich entwickelnden kardialen Reizleitungssystems essentiell ist. Im Wildtyp Embryo wird HCN4 Transkript und Protein in der Region exprimiert, in der sich der Sinusknoten entwickelt. Mäuse die für den HCN4-Kanal ubiquitär oder herzspezifisch defizient sind, sterben zwischen ET 10,0 und 11,5. Histologische Untersuchungen an den HCN4-defizienten Tieren zeigten keine offensichtlichen morphologischen Defekte. Im Durchschnitt ist Ih in den Knock-out Kardiomyozyten um 85% reduziert. Die Herzen der HCN4-defizienten Mäuse schlagen signifikant langsamer als die von Wildtypen und können durch cAMP nicht stimuliert werden. Sowohl in Wildtypen als auch in HCN4-/--Mäusen konnten Kardiomyozyten mit einem "primitiven" Schrittmacherpotential detektiert werden. Hingegen sind Zellen mit einem ausgereiften Schrittmacherpotential, die im Wildtyp ab ET 9,0 auftreten, nicht im Knock-out zu finden. Deshalb ist der HCN4-Kanal für die Bildung von Schrittmacherpotentialen im sich entwickelndem Sinusknoten essentiell. Im adulten Tier wird HCN4 ausschließlich in Herzregionen exprimiert die spontane Aktivität aufweisen. Proteinexpression wurde sowohl im ganzen Sinusknoten als auch in isolierten Sinusknotenzellen, im AV Knoten und auf den Herzklappen nachgewiesen. Wegen der embryonalen Letalität des globalen HCN4 Knock-outs wurden mit Hilfe des Cre loxP Systems herzspezifische HCN4-defiziente Tiere hergestellt. Nach genauer Analyse von fünf verschiedenen Cre Transgenen konnte schließlich mit Hilfe der induzierbaren MerCreMer Maus die HCN4 Expression im Sinusknoten um etwa 90% reduziert werden. Mit diesen Tieren sollte es möglich sein, die Rolle von Ih im Herz zu untersuchen. Vorläufige in-vivo EKG Messungen ergaben aber Bemerkenswerterweise bisher noch keine Unterschiede zwischen Wildtyp und der herzspezifischen HCN4-MerCreMer-KO Maus.

1.) Die weltweit als Bioindikator für den Luftschadstoff Ozon eingesetzte Tabaksorte Bel W3 reagiert mit typischen pergamentartigen Läsionen auf sommerliche Ozonwerte in Mitteleuropa. Es konnte demonstriert werden, dass eine Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), vor allem H2O2, der Ozoninduktion von Zelltod vorausgeht, wobei die Orte der H2O2-Akkumulation („Burst initiation sites“) mit denen der späteren Läsionen sehr gut korrelierten. Histologische Untersuchungen zeigten, dass dieser „oxidative Burst“ zunächst in den Zellen des Palisadenparenchyms, und zwar in Clustern in der Nähe von Blattadern, erfolgte. 2.) Bei einem Vergleich Ozon-empfindlicher Arten, Sorten und Ökotypen von Nutz- und Wildpflanzen zeigten sich deutliche Unterschiede in der Art der vorwiegend akkumulierten ROS. In neun Tomatensorten wurde H2O2-Akkumulation detektiert, wobei die Intensität mit der Ozonempfindlichkeit der Sorten korrelierte. In zehn Ökotypen von Arabidopsis thaliana L. ließ sich neben H2O2 vor allem O2 -. detektieren, wobei O2 -. mit dem Muster und der Quantität der Schäden korrelierte. Bei den Ozon-empfindlichen Wildpflanzen Rumex crispus L., R. obtusifolius L. und Malva sylvestris L. konnte ausschließlich O2 -. nachgewiesen werden. Blattquerschnitte der letztgenannten Pflanzenart erbrachten deutliche Unterschiede zu der Tabaksorte Bel W3: Obwohl beide Pflanzenarten amphistomatäre Blätter besitzen, konnte O2 -. zuerst in den Zellen des Schwammparenchyms detektiert werden. In allen Fällen erfolgte das Auftreten von Ozon-induziertem Zelltod verstärkt entlang der Blattadern; Bereiche des Zelltodes korrelierten jeweils mit vorheriger Akkumulation von ROS. 3.) In Freilandversuchen konnte zum ersten Mal die Ozon-induzierte Akkumulation von ROS vor dem Auftreten von Blattsymptomen in Wild- und Kulturpflanzen gezeigt werden. Berechnungen der kritischen Grenzwerte für Ozon (AOT40) ergaben, dass der zur Zeit für Kulturpflanzen und natürliche Vegetationen vorgegebene Wert von 3000 nl l -1 h für empfindliche Pflanzen wie die Tabaksorte Bel W3 zu hoch angesetzt ist. 4.) Täglich wiederkehrende Ozonexposition in Freiland- und Kammerversuchen führten in der Tabaksorte Bel W3 zu einer Akkumulation von H2O2 um schon bestehende Läsionen herum und daraus resultierend zu deren Vergrößerung. Es ist anzunehmen, dass existierende Bereiche pflanzlichen Zelltods die Nachbarzellen für ROS-Akkumulation und Zelltod empfindlicher machen. Als Verstärkungsfaktoren kommen erhöhte Produktionsraten von Ethylen, NO und Salicylsäure in Betracht. Entsprechend korrelierten die Gehalte der Ethylenvorstufe 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure und Salicylsäure mit Ozon-induziertem Zelltod. Erstmalig konnte eine Ozon-induzierte Akkumulation des pflanzlichen Signalstoffs NO nachgewiesen werden. Dessen Produktion erfolgte in Ozon-behandelten Blättern der Tabaksorte Bel W3 zum gleichen Zeitpunkt und mit sehr ähnlichem Muster, nämlich besonders in Palisadenparenchymzellen entlang Blattadern, wie H2O2, so dass beide Signalmoleküle bei der Ausprägung pflanzlichen Zelltods kooperieren könnten. 5.) Das Auftreten erhöhter ROS-Gehalte nach Ende der Ozonexposition sowie die Hemmung der ROS-Akkumulation und Ozon-induzierten Zelltods durch Enzym-Inhibitoren weisen auf eine aktive in planta Bildung von ROS in Ozon-empfindlichen Pflanzen hin. Als ROS-produzierende Enzyme kommen dabei verschiedene Oxidasen und Peroxidasen in Betracht. Zunächst wurde eine Beteiligung von Oxalatoxidase-Aktivität an dem Ozon-induzierten „oxidativen Burst“ für Tabak ausgeschlossen. 6.) Erstmals gelang der Nachweis zweier homologer Gene in Tabak zu der O2 -. -produzierenden NADPH-Oxidase (gp91phox) aus Makrophagen von Säugern. Beide Isoformen wurden kloniert; sie wurden in Anlehnung an die entsprechenden Isoformen in A. thaliana als Ntrboh (N. tabacum respiratory burst oxidase homologue) D und F bezeichnet. Die Sequenzen enthielten die für die Aktivität der NADPH-Oxidase wichtigen FAD-, NADPH Adenin- und NADPH Ribose-Bindungsstellen sowie konservierte Histidin-Reste für die Häm-Bindung. Wie die bisher veröffentlichten pflanzlichen NADPH-Oxidasen fanden sich in Ntrboh D und F N-terminale Verlängerungen mit zwei EF-Hand-Motiven, die als putative Ca 2+ -Bindungsstellen gelten. 7.) Während Ntrboh F in allen Geweben konstitutiv exprimiert wurde, zeigte sich die Isoform Ntrboh D in ihrer Expression abhängig vom Gewebe. Ozonbehandlung führte zu einer biphasischen Induktion der Expression von Ntrboh D in Blättern der Sorte Bel W3 mit Maxima nach 2 und 6 h nach Beginn der Exposition. Maximale Transkriptgehalte wurden durch einmalige Exposition mit 200 nl l -1 Ozon induziert, höhere Ozondosen brachten keine weitere Steigerung. Auch in der Ozon-toleranten Sorte Bel B ergab sich ein zu Bel W3 sehr ähnlicher biphasischer Verlauf der Transkript-Akkumulation. Die Isoform Ntrboh F zeigte in einigen Versuchen eine leicht erhöhte Expression gegen Ende und nach der Ozonexposition, also zeitlich zusammen mit dem Auftreten des zweiten Peaks der ROS-Bildung. Infiltration mit einem avirulenten Pathogen-Stamm (Pseudomonas syringae pv. syringae) bewirkte eine der Ozoninduktion vergleichbare Transkriptakkumulation von Ntrboh D. In der Apoplastenflüssigkeit von Tabakblättern fanden sich Isoformen von Superoxiddismutase (SOD), die durch Ozon in ihrer Aktivität induziert waren. 8.) Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Ozoneffekte in empfindlichen Pflanzen durch die pflanzeneigene Produktion von ROS verstärkt werden. ROS sind dabei an der Induktion eines Zelltodprogramms beteiligt. Es wird postuliert, dass die Ozoninduktion von Homologen der NADPH-Oxidase aus Säugern zusammen mit SOD für die Ozon-induzierte H2O2-Akkumulation und die extrem hohe Empfindlichkeit der Tabaksorte Bel W3 verantwortlich ist. Weitere Untersuchungen auf Protein- und Enzymaktivitätsebene müssen zeigen, welche Mechanismen für die Auslösung dieser Induktion in Bel W3, nicht aber in Ozon-toleranten Nutz- und Wildpflanzen, verantwortlich sind.