Podcasts about elektrophorese

Labordiagnostik ist ein wesentliche Teil der sogenannten "Basisdiagnostik" bei Osteoporose. Das Ziel dieser Untersuchungen ist vor allem andere Erkrankungen, die auch zu einer Osteoporose führen können, auszuschließen. Was dabei zu beachten ist und welche Werte bestimmt werden sollten, besprechen wir in der aktuellen Folge mit dem Endokrinologen Dr. Ulrich Deuss. Die Folge richtet sich vor allem an Experten und Interessierte.

In **Folge 45** unserer Wissensreise starten wir mit einem neuen Kapitel: dem Kapitel Blut. Fragen, die wir beantworten, sind: - Welche Aufgaben hat das Blut? - Wie ist es zusammengesetzt? - Was ist Elektrophorese? - Welche Bluteiweiße sind besonders wichtig? - Wie werden Blutzellen gebildet? Falls du möchtest, dass es weitergeht, unterstütze mich gerne ;-) Hier geht es zu den Paketen: https://steadyhq.com/wissensreise Viel Spaß beim Zuhören und Lernen ;-) Schreib mir gerne Anregung, Kritik, eine Coaching-Anfrage oder einfach nur ein "Hallo", auch an die Adresse: tanjaloiblhp@gmail.com. Das Preismodell für das Coaching findest du unter: www.tanjas-naturheilkunde.com. Social media: https://linktr.ee/tanjas_naturheilkunde

Die genetischen Grundlagen der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen M. Crohn und Colitis ulcerosa sind komplex und noch nicht in allen Einzelheiten aufgeklärt. Hitzeschockproteine (Hsp72) haben eine protektive Wirkung in entzündeter Darmmukosa. Daher könnte ein Mangel dieser Proteine den Verlauf inflammatorischer Darmerkrankungen beeinflussen. Zur Verifikation dieser Hypothese wurde die genomische DNA aus Leukozyten von 61 kaukasischen Patienten mit M. Crohn und 25 Patienten mit Colitis ulcerosa isoliert. Anschliessend wurde durch Polymerase-Kettenreaktion ein Segment des Hsp70-2 Gens amplifiziert, das einen A/G-Transitionspolymorphismus trägt (Allel B), der mit einer geringeren Hsp72-Expression assoziiert ist. Durch eine Restriktionsanalyse (Enzym: PstI) und konsekutiver Elektrophorese konnte das Vorliegen der Transition überprüft werden. Die aus den Krankenakten erhobenen Krankheitsverläufe (Alter bei Erstdiagnose, Ausdehnung und Lokalisation der Erkrankung, extraintestinale Manifestationen, Operationen, Komplikationen, Medikation) wurden mit den Ergebnissen der Genanalyse korreliert. Das Allel B kam bei Patienten mit M. Crohn nicht signifikant häufiger vor als bei gesunden Personen (44 % bei Patienten vs. 42 % bei Gesunden). Die Resultate zeigten jedoch eine signifikante Assoziation (p

In der vorliegenden Arbeit wurden die diffusiven und elektrophoretischen Eigenschaften von Desoxyribonuklein-säure (DNA) und die Selbstassemblierung von DNA-Chromophor-Hybridmolekülen untersucht. Hierzu wurden, neben Gelelektrophorese und temperaturabhängigen Absorptionsmessungen, vor allem Fluoreszenz-Korre-lationsmethoden angewandt. Um quantitative Aussagen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) über die freie Diffusion von doppelsträngigen (ds) DNA-Fragmenten (75 bp - 1019 bp) in wässrigen Lösungen zu treffen, wurden laserleis-tungsabhängige Messungen durchgeführt. Diese Experimente ergaben, dass photophysikalische Effekte wie Triplettrelaxation, Isomerisations- oder Bleichprozesse die Autokorrelation entscheidend beeinflussen. Die Län-genabhängigkeit der gemessenen Diffusionskonstanten kann mit einem Stabmodell beschrieben werden, das für alle verwendeten dsDNA-Fragmente, die Konturlängen von bis zu 7 Persistenzlängen aufweisen, Gültigkeit besitzt. In diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass kleinere Diffusionskonstanten lediglich bei der Zuga-be von zweiwertigen Salzen und bei hohen Salzstärken (> 0,1 M) beobachtet werden. Durch eine Komplexierung der dsDNA-Fragmente mit kationischen und neutralen Lipiden war es möglich, dsDNA in ein unpolares Lösungs-mittel (n-Alkan) zu überführen. Durch Messung der freien Diffusion konnte die Monodispersität von Lipid-dekorierten dsDNA-Fragmenten festgestellt werden. In der unpolaren Phase wurde eine kritische DNA-Konzentration (≈ 10 nM) festgestellt, die für die Stabilität der DNA-Lipid-Komplexe notwendig ist. In der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Müllen am Max-Planck-Institut für Polymerforschung in Mainz wurde ein DNA-Chromophor-Hybrid synthetisiert, bei dem an ein zentrales Farbstoffmolekül (Perylen) beidseitig jeweils ein kurzes ca. 20 Basen langes Oligonukleotid (ODN) kovalent angebunden wurde. FCS-Messungen, die die intrinsi-schen Fluoreszenzeigenschaften des Hybrids ausnutzten, konnten die Löslichkeit und Monodispersität der Hybride bzw. der Lipid-Hybrid-Komplexe sowohl in wässriger Phase als auch in Alkanen nachweisen. Durch eine geeigne-te Wahl der ODN-Sequenzen und der Anknüpfungsstelle der ODN an den Farbstoffkern entstanden durch Basen-paarung unterschiedliche, supramolekulare Strukturen, die in Gelelektrophorese-Experimenten nachgewiesen wur-den. Symmetrische DNA-Chromophor-Hybride können neben beliebig langen, linearen Ketten bei entsprechender Modifikation der Bausteine sandwichartige Dimere ausbilden. Asymmetrische Hybride ermöglichen den Aufbau linearer Strukturen definierter Länge (z. B. Dimere). Die thermodynamischen Eigenschaften der unterschiedlichen, supramolekularen Konstrukte wurden durch tempe-raturabhängige Absorptionsexperimente untersucht. Die Denaturierung der linearen kettenartigen Strukturen kann durch ein Zwei-Zustands-Modell beschrieben werden, dessen energetische Eigenschaften sehr gut mit denen der verwendeten ODN übereinstimmen. Im Fall der sandwichartigen Strukturen musste für den Schmelzübergang ein Drei-Zustands-Modell angenommen werden, wobei die eingebauten Farbstoffkerne eine energetische Wechselwir-kung vermittelten. Neben der freien Diffusion von dsDNA wurde deren elektrophoretische Drift untersucht. Dazu wurde ein Mikroe-lektrophorese-System entwickelt, bei dem die Drift im elektrischen Feld mittels zweier Laserfoki detektiert wird, die einen Abstand von ca. 5 µm aufweisen. Hierbei wirken die beiden Foki wie eine mikroskopische „Lichtschran-ke“; die Driftzeit wird dabei durch eine Orts-Orts-Kreuzkorrelation der beiden Fluoreszenzsignale zugänglich ge-macht. Auf Grund der methodisch bedingten sehr hohen Ortsauflösung ist es möglich, detaillierte Aussagen über die elektrophoretischen und elektroosmotischen Anteile an der Drift zu treffen. Experimente mit unterschiedlichen Feldstärken zeigen, dass eine Temperaturänderung durch den Eintrag von Joulscher Wärme nicht vernachlässigbar ist. Die elektrophoretische Mobilität ist in freier Lösung bei der verwendeten dsDNA unabhängig von der Frag-mentlänge und beträgt im Mittel 4,5∙10-4 cm2/Vs. Durch die gleichzeitige Messung von Drift und Diffusion konnte neben der elektrophoretischen Mobilität der dsDNA-Fragmente auch der Einfluss der hydrodynamischen Reibung ermittelt werden. Dadurch zeigt sich, dass neben der elektrostatischen Kraft und der Reibungskraft auch hydrody-namische Abschirmeffekte berücksichtigt werden müssen, um mit einem entsprechenden Kraftbild die Elektropho-rese-Experimente zu erklären. Im Gegensatz zu den Messungen in freier Lösung zeigt die elektrophoretische Drift der dsDNA-Fragmente in ei-nem physikalischen Polyethylenoxid-Netzwerk eine Längenabhängigkeit, die einem Potenzgesetz folgt (exp=-0,3). Berechnet man das Auflösungspotential der Elektrophorese-Experimente und vergleicht dies mit theoretischen Vorhersagen, so ergibt sich, dass die Diffusion im Vergleich zur Detektorausdehnung den deutlich stärker limitie-renden Faktor bezüglich des Auftrennpotentials unterschiedlich langer DNA darstellt. Die Auftrennung unter-schiedlich langer dsDNA-Fragmente in der Lösung konnte experimentell nachgewiesen werden, wobei die Auflö-sungsgrenze ungefähr 400 bp betrug. Die vorgestellten Ergebnisse belegen, dass FCS zur quantitativen Charakterisierung der Diffusion eingesetzt wer-den kann. Darüber hinaus erlaubt die simultane Messung von elektrophoretischer Drift und Diffusion mit Hilfe von Doppelfokus-FCS, die Bildung von supramolekularen Konstrukten im Bezug auf Ladung und Geometrie mit einer Zeitauflösung im Minutenbereich zu verfolgen.

Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit und vaskuloproliferativer Erkrankungen des Menschen. Das Bakterium wurde erstmals 1989 korrekt klassifiziert und den oben genannten Krankheitsbildern zugeordnet. Es ist ein langsam wachsendes, nicht in Flüssigmedien kultivierbares Bakterium. Genetische Untersuchungen sind deswegen schwierig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die zweidimensionale Elektrophorese zur Untersuchung möglicher Pathogenitätsfaktoren von B. henselae etabliert. Mithilfe dieser Methode sollte es möglich sein, das gesamte Proteom von B. henselae unter verschiedenen Kulturbedingungen aufzutrennen und so Rückschlüsse auf Pathomechanismen dieses Erregers zu ziehen. Die vorliegende Dissertation lieferte folgende Ergebnisse: 1. Etablierung eines geeigneten Protokolls zum Aufschluss von B. henselae für die zweidimensionale Elektrophorese. 2. Erstellung einer Proteomkarte von auf Agarplatten kultivierten B. henselae. Hierdurch wurde die Grundvoraussetzung für weitere Proteom-basierte Studien geschaffen. Zudem wurden drei Proteine (Malatdehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase und DnaK)erstmals bei B. henselae beschrieben. 3. Charakterisierung von vier monoklonalen anti-B. henselae-Antikörpern mithilfe von zweidimensionalen Proteom-Western-Blots. Dadurch wurden vier neue B. henselae–Proteine, unter anderem das Phagenprotein Pap31, als immunogen in der Maus beschrieben. Zudem wurde hier erstmalig die zweidimensionale Elektrophorese als schnelle und akkurate Methode zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper eingesetzt. 4. Durch den Proteomvergleich hitzegestresster und nicht-hitzegestresster B. henselae wurde gezeigt, dass mit der hier etablierten Methodik regulative Vorgänge der Proteinsynthese von B. henselae erfasst werden können. Von den drei identifizierten Hitzestressproteinen (GroEL, GroES und DnaK) wurde DnaK für B. henselae zum ersten Mal beschrieben. 5. Zwei pilusassoziierte Proteine (220 kD und 43 kD) wurden durch Proteomvergleich gefunden. Bei dem in den zweidimensionalen Auftrennungen sichtbaren 43kD-Protein handelt es sich um die Phophoserinaminotransferase, ein bakterielles Stoffwechselenzym. Der Zusammenhang mit der Pilusexpression ist bis dato unklar. Die Identität dieses Proteins wurde mithilfe reverser Genetik verifiziert. Das zweite Protein erscheint aufgrund unterschiedlicher Gelsysteme nur in den eindimensionalen Auftrennungen und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht. 6. Durch die in dieser Arbeit etablierte radioaktive Markierung von B. henselae-Proteinen mittels 35S-Pulse-Chase wurde die Untersuchung neu synthetisierter Proteine nach Kokultur mit humanen Zelllinien ermöglicht. 7. Untersuchung neu synthetisierter B. henselae-Proteine nach Kokultur des Erregers mit humanen Endothelzellen mittels 35S-Pulse-Chase. Durch Vergleich mit der Proteomkarte konnten folgende in der Kokultur neu synthetisierte Proteine identifiziert werden: die Hitzestressproteine GroES, GroEL und DnaK, die Stoffwechselenzyme Malatdehydrogenase und Pyruvatdehydrogenase, der Elongationsfaktor EF-Tu und das Phagenprotein Pap31. Die Expression von Pap31 bei B. henselae in Endothelzellkultur wurde hier erstmals gezeigt. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine neue Methode für die weitergehende Erforschung von B. henselae etabliert, die in Zukunft die Untersuchung dieses genetisch schwer zugänglichen Organismus erleichtern wird. Eine Reihe von Proteinen wurde hier für B. henselae erstmals beschrieben bzw. wurde deren Expression unter bestimmten Lebensbedingungen zum ersten Mal beobachtet. Die Breite des methodischen Ansatzes dieser Arbeit legt den Grundstein für vielfältige weitere Untersuchungen. So konnte zwischenzeitlich die membranassoziierte Lage von Pap31 mithilfe eines in dieser Arbeit charakterisierten monoklonalen Antikörper aufgedeckt und Fibronektin als Bindungspartner von B. henselae–Pili identifiziert werden.

Monoklonale Antikörper sind unverzichtbare Hilfsmittel, um Proteinkomplexe aus Zellen zu isolieren oder Proteine in Gewebeschnitten zu lokalisieren. Sie dienen auch dazu, Entwicklungsvorgänge aufzuklären. Dabei wird als Modellorganismus für Vertebraten oft der Zebrafisch gewählt, da er sich asaisonal vermehrt, eine zahlreiche Nachkommenschaft hat und sowohl die Befruchtung als auch die Entwicklung außerhalb des Mutterleibs erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper generiert, die spezifisch mit neuronalen Geweben und Organen des Zebrafisches reagieren. Zur Immunisierung wurde Gehirngewebe des Zebrafisches verwendet. Immunisiert wurden Ratten. Antikörperbildende B-Zellen aus der Ratte wurden mit einer Mausmyelom-Zelllinie fusioniert. Proteine von Interesse wurden mit Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des Zebrafisch-Gehirns immunpräzipitiert und durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die durch Antikörper detektierbaren Banden wurden ausgeschnitten und die enthaltenen Proteine mit massenspektrometrischen Techniken identifiziert. In einem weiteren Ansatz diente eine in λ-Phagen einklonierte Genbank der Expression der Proteine. Die Proteine wurden ebenfalls mit monoklonalen Antikörpern identifiziert. Die Phagen, die diese Proteine produzierten, wurden vermehrt und die für das Protein kodierende DNA sequenziert. Wir haben unsere Anstrengungen vor allem auf Proteine neuronalen Ursprungs konzentriert, weil diese Strukturen in den Fischen besonders deutlich markiert wurden. Histologische Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass die Antikörper mit neuronalen Strukturen vieler Spezies reagierten, was auf eine hohe Konservierung der Proteine in der Phylogenese schließen lässt. Aus drei Fusionen mit Milzzellen von immunisierten Ratten wurden 2400 Zellüberstände erzeugt, die auf ihre Immunglobulin-Subklasse getestet wurden. IgG-positive Überstände wurden auf histologischen Schnitten untersucht. Schließlich wurden 17 Klone etabliert, die mit Nervengewebe des Zebrafisches reagierten, und weitere 9 Klone, die sowohl mit neuronalen Zellen des Zebrafisches als auch mit neuronalem Gewebe anderer Spezies reagierten. Die von den einzelnen Antikörpern erkannten Proteine wurden entweder massenspektrometrisch oder mittels einer Expressionsgenbank, die aus drei Tage alten Zebrafischlarven hergestellt wurde, identifiziert. Es wurden Antikörper gegen folgende Proteine gefunden: 1. Tenascin R 2. Plasticin 3. TOPAP 4. VAT-1 Es wurden 16 monoklonale Antikörper, die gegen fünf verschiedene humane Antigene hergestellt worden waren, auf Kreuzreaktivität mit Zebrafischgehirn getestet. Die Antikörper reagierten sowohl mit dem Hirn des Zebrafisches als auch mit dem Hirn acht verschiedener Säugerspezies. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Versuch unternommen, gezielt gegen ein Fusionskonstrukt, das Teile des humanen Parkins enthielt, monoklonale Antikörper herzustellen. Aus vier Fusionen wurden nur drei spezifisch mit dem Antigen reagierende Antikörper selektiert, die auch im Western-Blot mit Parkin reagierten. In vivo wurde das Antigen in histologischen Schnitten jedoch nicht erkannt.

Seit Jahrzehnten wird versucht, spezifische Proteine oder Peptide zu bestimmen, deren Konzentrationsänderungen im Liquor und oder im Blut eine diagnostische Aussage über den Zustand des ZNS bzw. über das quantitative Ausmaß des Schadens im Gehirn und Rückenmark zulassen. Der Wert eines biochemischen Markers insbesondere bei akuten Ereignissen, ähnlich wie die Herzenzymdiagnostik in der Kardiologie, erscheint hoch. GFAP wurde 1971 von Eng erstmalig aus Multiple Sklerose Plaques isoliert. GFAP ist ein 50 ± 1 kDa großes Protein, welches in einer wasserlöslichen und wasserunlöslichen Form existiert. GFAP gehört zu der Gruppe der Intermediärfilament-Proteine, die am Aufbau des Zytoskeletts beteiligt sind. GFAP konnte bisher nur in Gliazellen und Zellen glialen Ursprungs gefunden werden. Fast jede Reaktion von Astrozyten geht mit einer morphologisch sichtbaren Veränderung einher. Die Zellform verändert sich von einer runden protoplasmatischen Zelle mit wenigen Zellfortsätzen in eine verzweigte Zelle mit zahlreichen Zellfortsätzen. Diese Vorgänge sind immer mit einer Vermehrung zytoplasmatischer Filamente und einer Veränderung des GFAP Gehaltes verknüpft. Deshalb ist GFAP ein wichtiger Funktionsmarker. Bisher konnte GFAP in wäßrigen Gewebsextrakten mittels Immundiffusion und Elektrophorese, Immunradiometrie, Immunelektrophorese und Radioimmunoassays nachgewiesen werden. Die hauptsächlich angewendeten Nachweise beruhen auf immunhistochemischen Verfahren. Es gelang auch GFAP im Liquor mittels Radioimmunoassay und Enzyme Linked Immunosorbent Assay nachzuweisen und bei Erkrankungen, die mit einer Gliose einhergehen, erhöhte GFAP-Konzentrationen nachzuweisen. Der in dieser Arbeit vorgestellte Nachweis von GFAP in humanem Serum basiert auf der Messung von GFAP in humanem Blut mit Hilfe eines zerfallsunterstützten Lanthanide Immunfluoresenzassays (Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorescence Immunoassay = DELFIA). Die Messung beruht auf der Bindung von in Standardlösungen und Proben enthaltenem GFAP an Festphasen-Anti-GFAP. Anschließend wird das gebundene GFAP in mehreren Schritten mittels eines anti-GFAP Antikörpers und Europium detektiert. Die Fluoreszenz des gebundenen Europiums wird nach Anregung durch einen Lichtimpuls gemessen und so die in der Probe enthaltene Menge GFAP quantifiziert, die der Menge des gebundenen GFAP proportional ist. In dieser Arbeit konnte erstmalig GFAP zuverlässig, empfindlich und quantitativ bestimmt werden. Damit wird es erstmalig möglich ein für das Zentralnervensystem spezifisches Protein im Blut zu messen. Uns gelang es mit einem Kollektiv von Schädel-Hirn-Trauma Patienten eine Korrelation zwischen klinisch gesicherten Affektionen des Zentralnervensystems und dem Ansteigen des GFAP-Spiegels im Blut nachzuweisen.

Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte, dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der 4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde, während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an 6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der 3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und 28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte, enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen. Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann.