Podcasts about proteinkomplexe

Die Plasmamembran lebender Zellen stellt die Hauptbarriere für alle Arten von extrazellulären Signalen dar. Viele davon werden ins Innere der Zelle weitergeleitet, hier lösen sie im Kern transkiptionelle Veränderungen und damit die Anpassung der Zelle auf Proteinebene aus. Andere wiederum werden direkt erkannt und in unmittelbare molekulare Antworten umgewandelt, wie zum Beispiel die Sekretion von gespeicherten Stoffen oder Konformations-änderungen von Proteinen. Besonders in Pflanzen, welche durch ihre sesshafte Lebensweise auf die rechtzeitige und spezifische Erkennung von Umweltveränderungen angewiesen sind, hat sich ein höchst diverses Rezeptorsystem entwickelt. In der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana, der in dieser Arbeit verwendeten Modellpflanze, wurden 610 verschiedene Rezeptorproteine identifiziert, welche wiederum von zahlreichen interagierenden, und bis jetzt weitestgehend unerforschten Proteinen reguliert werden. Als entscheidendes Prinzip, dieses Aufgebot an membran-gebundenen Komponenten von Signalkaskaden zu organisieren, gilt inzwischen die zeitliche und lokale Kompartimentierung der Plasmamembran. Durch Akkumulation relevanter Bestandteile von biologischen Prozessen in sogenannten Membrandomänen werden kurze Reaktionszeiten und die unmittelbare Signalweiterleitung garantiert. Besonders wichtig bei solchen Prozessen sind sogenannte Gerüstproteine, welche als Adaptoren zwischen anderen Komponenten fungieren. In dieser Arbeit wurden Remorine, eine Familie pflanzenspezifische Proteinen ohne bisher definierte Funktion, aufgrund ihrer Eigenschaft Membrandomänen zu markieren und ihrer mutmaßlichen Beteiligung an Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, genauer untersucht. Eine systematische Expression von Remorinen als Fluorophor-Fusionen mit anschließender hochauflösender mikroskopischer und quantitativer Untersuchung offenbarte, dass die meisten Remorine sich in deutlich unterschiedlichen Mustern an der Membran verteilen. Untersucht wurden dabei Parameter wie die Größe der erkennbaren Domänen, die Form, die Helligkeit, aus welcher auf die Proteinkonzentration rückgeschlossen werden kann, sowie die Domänendichte an der Membran. Diese Ergebnisse wurden von Kolokalisationsanalysen unterstützt, welche die Lokalisation in unterschiedlichen, koexistierenden Membrankompartimenten erkennen ließen. Ferner wurden die Eigenschaften der von Remorinen markierten Membrandomänen, wie zum Beispiel der Austausch an Proteinen mit der umgebenden Membran, sowie lokale und zeitliche Dynamik und Stabilität untersucht. Dabei konnte eine hohe Fluktuation einzelner Proteine zwischen Domäne und umliegender Membran, jedoch eine klare laterale Immobilität der gesamten Domäne nachgewiesen werden. Zusätzlich zeichneten sich die untersuchten Domänen teilweise durch eine außerordentlich große zeitliche Stabilität aus, andere wiederum scheinen abhängig von bestimmten Stimuli zu entstehen. Weitergehende Arbeiten dienten der Identifizierung der Funktion einzelner Bereiche der Proteine. Hierbei konnte die entscheidende Rolle des äußersten C-terminalen Bereichs, des so- genannten RemCAs (Perraki et al., 2012; Konrad et al., 2014) als Membrananker bestätigt werden. Zusätzlich wurden mit Hilfe eines Hefe-2-Hybrid Ansatzes zahlreiche neue Interaktoren für eine Auswahl von Remorinen identifiziert. Dabei wurde ein essentieller Rezeptor der basalen Immunantwort, BAK1 als Interaktor für Remorin 6.4 gefunden. Zuletzt wurden einige wenige Remorine mit Hilfe von Mutantenlinien in einer genetischen Studie phänotypischen Analysen bezüglich ihrer Funktion bei Pflanzen-Pathogen Interaktionen unterzogen. Remorin 6.4 spielt hiernach eine Rolle bei der Immunantwort nach Befall mit virulenten Bakterien. Die grundlegende Erkenntnis, dass in lebenden Zellen zahlreiche klar unterscheidbare Arten an Membrandomänen koexistieren, ist ein Meilenstein auf dem Weg zur Anerkennung einer neuen Vorstellung vom Aufbau der Zytoplasmamembran. Diese wird häufig noch als undifferenzierte zweidimensionale Flüssigkeit beschrieben, in welcher stellenweise sogenannte Lipidflöße, festere Strukturen aus Cholesterin und Sphingolipiden, die auch bestimmte Proteine beherbergen können, auftreten. Anhand der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse, sowie ähnlicher Studien in Hefe lässt sich nun folgendes Bild zeichnen: Es ist davon auszugehen, dass unterschiedliche Proteine, welche im selben biologischen Prozess involviert sind, in unmittelbarer Nachbarschaft oder sogar im selben Proteinkomplex in der Membran organisiert sind. Die Lipidzusammensetzung in der unmittelbaren Umgebung wird von diesen Proteinen bestimmt, bietet jedoch auch die Grundlage für die Bildung der Domäne, indem sie die Lokalisation der Komponenten in diesem Bereich fördert. Die zahlreichen an der Zellmembran gleichzeitig ablaufenden, unterschiedlichen Prozesse erfordern eine hochkomplexe, zeitlich und räumlich stark regulierte Kompartimentierung der Membran. Es kann vermutet werden, dass Remorine eine Rolle als Gerüstproteine bei der Ausbildung einer Auswahl dieser Domänen bilden. Im Fall von Remorin 6.4 ist das Protein für den Prozess der Flagellin-Erkennung und die unmittelbaren Abwehrantworten, welche nachweislich eine Präformierung der beteiligten Proteinkomplexe voraussetzen, notwendig.

In den zellulären Stoffwechsel- und Signalnetzwerken existiert eine Vielzahl von logischen Abhängigkeiten, die auf Prozesse auf molekularer Ebene zurückzuführen sind. So lässt sich beispielsweise die Effizienz einer biochemischen Reaktion über Enzyme regulieren, deren Aktivitätsgrad von äußeren Parametern abhängt. Kraft stellt eine dieser Einflussgrößen dar. Diese Arbeit befasst sich damit, das Verhalten mehrerer, logisch verknüpfter, molekularer Domänen unter Krafteinwirkung zu studieren und sich deren Eigenschaften für nanotechnologische Verfahren zu Nutze zu machen. Neben der Untersuchung von in der Natur vorkommenden Proteinen mit multiplen Domänen wurden artifizielle DNA- und proteinbasierte Systeme mit verschiedener Bindungsstärke konstruiert. Dies ermöglicht den gerichteten Transport einzelner, molekularer Bausteine mit der Präzision eines Rasterkraftmikroskopes im Nanometer-Bereich. Mithilfe dieser Single-Molecule Cut-and-Paste (SMCP) Technik können auf der Basis gerichteter, molekularer Erkennung räumliche Arrangements funktioneller Bausteine geschaffen werden. Diese lassen sich mittels Fluoreszenzmikroskopie als isoliertes System betrachten. Die Zielsetzung bei der Untersuchung der natürlichen Systeme war es, deren Abhängigkeiten zu verstehen und herauszufinden, wie sich diese mit ihrer Funktion und den an das Protein gestellten Umgebungsbedingungen in Einklang bringen lassen. Die dabei gewonnene Erkenntnis liefert nicht nur wichtige Beiträge zur biologischen und medizinischen Grundlagenforschung, sondern kann, wie am Beispiel der SMCP-Technik ersichtlich, auch hilfreich bei der Entwicklung neuartiger Messmethoden der molekularen Bio- und Nanotechnologie sein. Mittels Einzelmolekülkraftspektroskopie im „Konstante-Kraft“ (engl. Force-Clamp) Modus wurde die Kooperativität der fünf Proteindomänen des Enzyms Titinkinase untersucht. Dieses Muskelprotein wandelt in der Skelett- und Herzmuskulatur mechanische in biochemische Signale um und regelt dadurch den Umsatz weiterer Proteine und die Expression von Genen. Es wird gezeigt, dass sich die einzelnen mechanisch induzierten Entfaltungsschritte gegenseitig bedingen und dass dies inhärent durch die molekulare Faltung des Proteins vorgegeben wird. Da Kraft zum natürlichen Parameterraum dieses Moleküls gehört, muss seine Struktur an kraftinduzierte konformationelle Änderungen angepasst sein. Durch die Abhängigkeit der Energiebarrieren während der Entfaltung wird gewährleistet, dass stabilisierende und enzymatisch wirksame Domänen nicht vor regulatorischen Domänen entfalten. Myosin-Light-Chain Kinase (MLCK) ist ein weiteres Muskelenzym, bei dem es Hinweise auf eine mechanische Aktivierbarkeit gibt. Einzelmolekülexperimente dieser Dissertation zeigen, dass die Entfaltung der Kinase ebenfalls in mehreren Schritten vonstatten geht und dass einer der Zwischenzustände durch ATP-Bindung stabilisiert wird. Die absoluten Entfaltungskräfte liegen dabei unter denen der Titinkinase, was der Hypothese der mechanischen Aktivierbarkeit entgegenkommt. Als weiteres System wurde das Cellulosom des thermophilen Bakteriums Clostridium Thermocellum auf seine mechanische Stabilität überprüft. Cellulosome sind an der Außenseite von Bakterien und Pilzen verankerte Proteinkomplexe, die in der Lage sind Lignozellulose zu zersetzen. Bei der Prozessierung der Cellulose können im Cellulosom hohe Scherkräfte auftreten, da dieses das gesamte Bakterium mit dem makromolekularen Substrat verknüpft. Mittels AFM-basierter Kraftspektroskopie wurde die Wirkung von Kraft auf einen Verbund verschiedener Konstituenten eines Cellulosoms untersucht. Es wird gezeigt, dass sich der Komplex im Vergleich zu anderen Biomolekülen durch eine extrem hohe mechanische Stabilität auszeichnet. Innerhalb der hohen Entfaltungskräfte besteht eine Hierarchie für die verschiedenen Komponenten. Bei vergleichsweise niedrigen Kräften entfalten die enzymatischen Domänen gefolgt von mittleren Kräften für das Entkoppeln der Enzyme mit dem Bindungspartner Cohesin. Sehr hohen Kräften halten die intramolekularen Wechselwirkungen der Cohesine und der Cellulose bindenden Domänen stand. Die Abstufung hoher Stabilitäten stellt eine sehr gute Anpassung an die natürlichen Anforderungen des Proteinkomplexes dar. Für die durchgeführten Messungen wurde ein modulares Kraftmikroskop (AFM) entwickelt, das sich mit einem einzelmolekülsensitiven Fluoreszenzmikroskop kombinieren lässt. Die spezielle Konstruktion weist eine extrem hohe mechanische Stabilität auf. Mittels einer photothermischen Regelung kann das AFM darüber hinaus für sensitive Bildgebung weicher molekularer Oberflächen oder in einen extrem schnellen kraftspektroskopischen Messmodus mit konstanter Zugkraft verwendet werden. Die akkurate Arbeitsweise des Systems wurde in einem internationalen Vergleichsversuch bestätigt.

Etioplasten sind hochspezialisierte pflanzliche Organelle der Plastidenfamilie, die während der Skotomorphogenese von Pflanzen gebildet werden. Die Morphologie der Etioplasten unterscheidet sich grundlegend von Chloroplasten, die während der Photomorphogenese gebildet werden. Durch Belichtung von Pflanzen, die im Dunkeln angezogen worden sind, kommt es zur Induktion der Transformation von Etioplasten zu Chloroplasten. Die unmittelbar vor Induktion des biologischen Systems bestehende Zusammensetzung der Proteine und Proteinkomplexe des Etioplasten ist allerdings bislang kaum untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten mehrere spezifische Analysen von plastidären Subproteomen. Ausgewählte Subproteome der inneren Membranen von Etioplasten der Gerste wurden im Vergleich zum Proteom der Thylakoidmembran von Chloroplasten analysiert. Durch die Kombination verschiedener gelelektrophoretischer Trennmethoden für Einzelproteine und Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysemethoden gelangen sensitivste Nachweise niedrig konzentrierter Untereinheiten von Membranproteinkomplexen. Darüber hinaus gelangen der Nachweis niedermolekularer membranintegraler Proteine und die spezifische Charakterisierung von Einzelproteinen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die N-Termini von NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) A und B durch ein LC-MS basiertes Verfahren bestimmt. Es erfolgte die Entwicklung einer Methode zur selektiven Isolation N-terminaler Peptide mittels Höchstdruckflüssigkeitschromatographie (UPLC). Dazu wurden zwei chemische Reaktionsschritte auf Protein- und Peptidebene durchgeführt, wodurch das N-terminale Peptid nach einem tryptischen Verdau ausschließlich acetyliert vorlag und interne Peptide durch eine weitere Modifikation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure abgetrennt wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die N-Termini von PORA und PORB homolog zueinander sind und eine vergleichbare Erkennungssequenz für die prozessierende(n) Protease(n) vorliegt. Das Transitpeptid von PORA ist somit deutlich kürzer, als bislang vermutet, wodurch neue Rückschlüsse bezüglich einer möglichen Bindestelle von Protochlorophyllid gezogen werden konnten, da eine von Reinbothe et al. 2008 beschriebene Bindestelle nicht im Bereich des Transitpeptids, sondern in Bereich der maturen PORA liegt. Bei PORB konnten neben einem dominierenden N-terminalen Peptid zwei weitere um jeweils ein Alanin verkürzte N-terminale Peptide mit geringerer Signalintensität nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine unpräzise N-terminale Prozessierung hin. Im zweiten Teil der Arbeit gelang die bislang umfassendste massenspektrometrische Charakterisierung des NAD(P)H-Dehydrogenase-Komplexes aus einer C3-Pflanze. In Etioplasten konnten sechs plastidär kodierte und mindestens fünf kernkodierte Untereinheiten des NDH-Komplexes identifiziert werden. Dies gelang durch die Isolation des Komplexes mittels nativer PAGE als 1. Dimension und die anschließende Aufkonzentrierung der Untereinheiten in einer SDS-PAGE als konzentrierende 2. Dimension. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der NDH-Komplex bereits in Etioplasten neben dem membranintegralen Subkomplex aus mindestens zwei löslichen Subkomplexen aufgebaut ist. Aufgrund dieser umfangreichen Assemblierung ist eine physiologische Funktion wahrscheinlich und erste Versuche zur NAD(P)H-Dehydrogenase Aktivität lieferten Hinweise auf eine mögliche enzymatische Aktivität. Im dritten Teil der Arbeit gelang in Etioplasten erstmals der Nachweis aller bekannten membranintegralen, niedermolekularen Untereinheiten von Photosystem II, nicht aber von Photosystem I. Die Untereinheiten von PSI konnten ausschließlich in Chloroplasten nachgewiesen werden. Von PSII konnten 13 niedermolekulare Untereinheiten mit jeweils einer Transmembrandomäne nachgewiesen werden. Diese Untereinheiten konnten im Gegensatz zu Chloroplasten nicht in höhermolekularen Komplexen, sondern ausschließlich nahe der Lauffront einer BN-PAGE im Bereich der freien Proteine nachgewiesen werden. Der Nachweis von PsbN war ausschließlich in Etioplasten möglich. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ausschließlich nicht-chlorophyllbindende Untereinheiten von PSII in Etioplasten akkumuliert werden und die Anreicherung von chlorophyllbindenden Untereinheiten von PSI und PSII von der Anwesenheit von Chlorophyll abhängt. Darüber hinaus konnten die vier niedermolekularen, membranintegralen Untereinheiten des Cytochrom b6f-Komplexes in Etioplasten und in Chloroplasten sowohl in der monomeren, als auch dimeren Assemblierungsstufe nachgewiesen werden. Ermöglicht wurden diese Nachweise durch eine neu entwickelte Methode zur Extraktion von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel mit organischen Lösungsmitteln und der anschließenden massenspektrometrischen Charakterisierung mittels offline ESI-MS.

Die Synthese von Chlorophyll ist in Angiospermen ein streng lichtabhängiger Prozess. Keimlinge, welche im Dunkeln angezogen werden, bilden anstelle der (grünen) Chloroplasten (gelb-orange) Etioplasten. In diesen ist die Thylakoidmembran durch den parakristallinen Prolamellarkörper und einige Prothylakoidmembranen ersetzt. Auf Ebene der Proteine kann zwar bereits im Dunkeln die Translation aller plastidencodierten Chlorophyll-bindenden Proteine nachgewiesen werden, allerdings werden diese mit Ausnahme des D2-Proteins in Abwesenheit von Chlorophyll sofort wieder degradiert. Mit der Belichtung von etioliertem Gewebe setzen der Abbau des Prolamellarkörpers und die Bildung der Thylakoidmembranen ein. Diese Umstrukturierung des inneren Membransystems geht mit der Akkumulation und der Assemblierung der chlorophyll-bindenden Photosystemkomplexe einher. Der genaue Ablauf der de novo Assemblierung der Chlorophyll-bindenden Proteinkomplexe ist bisher nicht vollständig geklärt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Biogenese von Pigment-bindenden Proteinkomplexen der Plastidenmembran während der Ergrünung untersucht. Dabei dienten im Dunkeln angezogene Keimlinge bzw. die daraus isolierten Etioplasten und deren Membranproteinkomplexe als Startpunkt. Zur Identifikation und Charakterisierung der Pigment-bindenden Komplexe wurden verschiedene Methoden (differentielle Gelelektrophorese für Membranproteine, farblose native Polyacrylamidelektrophorese in Kombination mit Absorptionsspektroskopie) weiterentwickelt. Durch die Kombination aller Techniken konnten verschiedene Aussagen zur Situation im Etioplasten und zum Ablauf der de novo Assemblierung während der Ergrünung getroffen werden. Der ATP-Synthase- und der Cytochrom b6f-Komplex liegen bereits im Etioplasten in der aus dem Chloroplasten bekannten hochmolekularen Assemblierungsstufe vor, wobei im dimeren Cytochrom b6f-Komplex im Etioplasten Protochlorophyll a anstelle von Chlorophyll a nachgewiesen werden kann. Somit ist der Cytochrom b6f-Komplex der einzige Chlorophyll-bindende Komplex, der bereits in der Abwesenheit von Chlorophyll unter Ersatz des Chlorophylls durch ein Chlorophyllderivat akkumulieren kann. Unmittelbar nach der Initiation der Chlorophyllbiosynthese ist der Großteil des de novo synthetisierten Chlorophylls in der Membran nicht mit Photosystemkomplexen assoziiert, sondern transient mit dem membranintegralen Lil (Light harvesting like) 3-Protein. Die Identifikation des Lil 3-Proteins als Chlorophyll-bindendes Protein weist erstmals auf eine mögliche Funktion dieses Proteins als temporärer Chlorophyllspeicher hin. Nach einer Stunde Belichtung können sowohl Photosystem I wie auch Photosystem II-Komplexe nachgewiesen werden, wohingegen erste LHC- Komplexe nach zweistündiger Belichtung zu detektieren sind. Während des Assemblierungsvorganges können für beide Photosysteme mehrere Assemblierungsintermediate nachgewiesen werden. Nach vierstündiger Belichtung hat die Assemblierung aller Thylakoidmembrankomplexe die komplexeste Assemblierungsstufe erreicht, welche aus dem Chloroplasten bekannt ist. Daher kann nach einer Belichtungszeit von vier Stunden die Biogenese der vier an der Lichtreaktion beteiligten Thylakoidmembrankomplexe von proteinbiochemischer Seite als abgeschlossen betrachtet werden.

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Monoklonale Antikörper sind unverzichtbare Hilfsmittel, um Proteinkomplexe aus Zellen zu isolieren oder Proteine in Gewebeschnitten zu lokalisieren. Sie dienen auch dazu, Entwicklungsvorgänge aufzuklären. Dabei wird als Modellorganismus für Vertebraten oft der Zebrafisch gewählt, da er sich asaisonal vermehrt, eine zahlreiche Nachkommenschaft hat und sowohl die Befruchtung als auch die Entwicklung außerhalb des Mutterleibs erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper generiert, die spezifisch mit neuronalen Geweben und Organen des Zebrafisches reagieren. Zur Immunisierung wurde Gehirngewebe des Zebrafisches verwendet. Immunisiert wurden Ratten. Antikörperbildende B-Zellen aus der Ratte wurden mit einer Mausmyelom-Zelllinie fusioniert. Proteine von Interesse wurden mit Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des Zebrafisch-Gehirns immunpräzipitiert und durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die durch Antikörper detektierbaren Banden wurden ausgeschnitten und die enthaltenen Proteine mit massenspektrometrischen Techniken identifiziert. In einem weiteren Ansatz diente eine in λ-Phagen einklonierte Genbank der Expression der Proteine. Die Proteine wurden ebenfalls mit monoklonalen Antikörpern identifiziert. Die Phagen, die diese Proteine produzierten, wurden vermehrt und die für das Protein kodierende DNA sequenziert. Wir haben unsere Anstrengungen vor allem auf Proteine neuronalen Ursprungs konzentriert, weil diese Strukturen in den Fischen besonders deutlich markiert wurden. Histologische Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass die Antikörper mit neuronalen Strukturen vieler Spezies reagierten, was auf eine hohe Konservierung der Proteine in der Phylogenese schließen lässt. Aus drei Fusionen mit Milzzellen von immunisierten Ratten wurden 2400 Zellüberstände erzeugt, die auf ihre Immunglobulin-Subklasse getestet wurden. IgG-positive Überstände wurden auf histologischen Schnitten untersucht. Schließlich wurden 17 Klone etabliert, die mit Nervengewebe des Zebrafisches reagierten, und weitere 9 Klone, die sowohl mit neuronalen Zellen des Zebrafisches als auch mit neuronalem Gewebe anderer Spezies reagierten. Die von den einzelnen Antikörpern erkannten Proteine wurden entweder massenspektrometrisch oder mittels einer Expressionsgenbank, die aus drei Tage alten Zebrafischlarven hergestellt wurde, identifiziert. Es wurden Antikörper gegen folgende Proteine gefunden: 1. Tenascin R 2. Plasticin 3. TOPAP 4. VAT-1 Es wurden 16 monoklonale Antikörper, die gegen fünf verschiedene humane Antigene hergestellt worden waren, auf Kreuzreaktivität mit Zebrafischgehirn getestet. Die Antikörper reagierten sowohl mit dem Hirn des Zebrafisches als auch mit dem Hirn acht verschiedener Säugerspezies. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Versuch unternommen, gezielt gegen ein Fusionskonstrukt, das Teile des humanen Parkins enthielt, monoklonale Antikörper herzustellen. Aus vier Fusionen wurden nur drei spezifisch mit dem Antigen reagierende Antikörper selektiert, die auch im Western-Blot mit Parkin reagierten. In vivo wurde das Antigen in histologischen Schnitten jedoch nicht erkannt.

Die Organisation der DNA in Nukleosomen hat einen großen Einfluss auf die Regulation von grundliegenden Prozessen wie Transkription, Replikation oder Reparatur der DNA im Zellkern. Um die hinderliche Natur des Chromatins bei diesen fundamentalen Prozessen zu überwinden, existieren mehrere verschiedene Chromatin modifizierende Proteinkomplexe im Zellkern. Chromatin Remodelling Komplexe nützen die Energie der ATP-Hydrolyse um die Position der Nukleosomen so zu verändern, dass verschiedene Abschnitte der DNA für die Interaktion mit regulierenden Faktoren zugänglich werden. Ein Klasse solcher Remodelling Faktoren beinhalten die ATPase ISWI als katalytische Untereinheit. Das Protein wurde zuerst in Drosophila entdeckt und die drei verschiedenen ISWI enthaltenden Komplexe, nämlich NURF, ACF und CHRAC, wurden ausführlich in diesem Modellorganismus untersucht. Homolog zur Fruchtfliege existieren sehr ähnliche Protein Komplexe beim Menschen. Wir haben das humane ISWI mit den Isoformen Snf2h und Snf2L im Prostatakarzinom untersucht. In einem Tissue Microarray wurden Gewebeproben mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern gegen ISWI gefärbt. Es folgte ein quantitativer Vergleich der Färbungsintensitäten im Karzinomgewebe sowie in gutartigem Gewebe der Prostata durch Anwendung von digitaler Bildanalyse. Das Ergebnis war eine signifikant stärkere Färbung im neoplastischen Gewebe. Eine Anreicherung von ISWI in Krebszellen ist besonders interessant im Kontext der bekannten Funktionen des Proteins für DNA-Replikation, Zellproliferation und Regulation der Chromatinstruktur. In einem zweiten Projekt sind wir zum Modell der Fruchtfliege zurückgekehrt und entwickelten monoklonale Antikörper gegen Toutatis, das zu einer Proteinfamilie gehört, die auch einige bekannte Interaktionspartner von ISWI umfasst. Die Proteine dieser Familie haben vermutlich eine regulatorische Funktion in den Remodelling Komplexen, denn am Beispiel von Acf1 wurde gezeigt, dass sie die nukleosomale Bindung sowie die Effizienz und Richtung der Mobilisierung von Nukleosomen modifizieren. Unsere Antikörper wurden etabliert, um Toutatis enthaltende Komplexe durch Western Blot Analyse von gereinigten Drosophila-Extrakten und Immunfluoreszenz zu charakterisieren. Mit diesen Methoden fanden wir eine Koelution von Toutatis mit der ATPase Brahma und dem Strukturprotein Spectrin alpha sowie eine Lokalisation in der Lamina des Zellkerns. Ein mögliches Zusammenspiel dieser Proteine in einem neuen Chromatin Remodelling Komplex mit einer Beteiligung an der DNA-Reparatur wird diskutiert.

Proteine leisten den entscheidenden Beitrag zur Struktur und Funktion der Zellen aller Lebewesen.Vieles spricht daher für eine Betrachtung des Proteoms oder einer Teilmenge davon (Subproteom), um den Zustand lebender Zellen zu beschreiben. Mit optimierten und neuen Methoden wurde das regulatorische Netzwerk, welches auf der Ebene der Trankription die Expression von Proteinen entscheidend mitbestimmt, genauer betrachtet. Hierzu wurden Zellfraktionierungsprotokolle optimiert, um die Proteine des Zellkerns und des Chromatins anzureichern und in nachfolgenden Analysen verwenden zu können. Es wurden Antikörper gegen verbreitete, funktional relevante Peptidmotive generiert. Aufbauend auf dem Konzept der Motivantikörper wurde eine Färbemethode für Zellkernproteine mit Kernlokalisationssignal entwickelt. Schließlich wurde mit den Methoden der Zellfraktionierung und spezifischeren Antikörpertechniken eine Analyse des humanen Mediator-Komplexes der RNA Polymerase II unternommen, die zur Entdeckung neuer Untereinheiten, potentiell interagierender Proteine und Phosphorylierungen im Komplex führte.

Morphologie und Dynamik der Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Vererbung der Organellen und die korrekte Ausübung ihrer physiologischen Pflichten. Über die molekularen Mechanismen, die der Gestaltgebung und Dynamik der Mitochondrien zugrunde liegen, ist relativ wenig bekannt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus wurden einige Proteine identifiziert – das Verständnis vieler Prozesse, wie z. B. Fusion, Teilung und Bewegung der Mitochondrien, stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung für die zellbiologische Forschung dar. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein innovativer Ansatz verfolgt, um neue mitochondriale Morphologiekomponenten in S. cerevisiae zu identifizieren. Dabei wurde eine Stammsammlung verwendet, die Deletionsmutanten sämtlicher nicht-essentieller Hefegene enthält. Diese Stämme wurden systematisch durch Fluoreszenzmikroskopie nach Mutanten durchsucht, die eine veränderte mitochondriale Morphologie aufweisen. Dadurch konnte die Anzahl der bekannten Proteine, die einen Einfluss auf die mitochondriale Morphogenese besitzen, von bis dato neun auf 24 erhöht werden. Fünf der neuen Komponenten, von denen zehn bislang gänzlich uncharakterisiert waren, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit entdeckt. Für eine eingehende Analyse im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden die beiden neuentdeckten Proteine Mdm31 und Mdm32 ausgewählt. Diese beiden Proteine sind Mitglieder einer neuen Proteinfamilie und liegen als höhermolekulare Proteinkomplexe in der mitochondrialen Innenmembran vor, die transient miteinander interagieren. Die Topologie von Mdm31 und Mdm32, deren Hauptteil im Intermembranraum liegt, ist ein Hinweis auf eine mögliche Kooperation der beiden Proteine mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran. Deletionsmutanten von MDM31 und MDM32 weisen sphärische Riesenmitochondrien auf, deren Motilität drastisch reduziert ist. Durch diesen Motilitätsdefekt kommt es zu einem verringerten Transport der Mitochondrien in die Tochterzellen bei der Zytokinese. Darüber hinaus ist das mitochondriale Genom in Δmdm31- und Δmdm32-Stämmen instabil und geht nach längerem Wachstum auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen in einem Teil der Zellen verloren. Ferner ist die Struktur der Nukleoide, in denen die mitochondriale DNA verpackt ist, in diesen Stämmen verändert. Während man in Wildtyp-Zellen 10-15 Nukleoide beobachtet, weisen die Mitochondrien der Deletionsstämme ein oder zwei riesige diffuse DNA-Stukturen auf. Diese strukturellen Veränderungen der Mitochondrien und das Verhalten des mitochondrialen Genoms in den Δmdm31- und Δmdm32-Deletionsmutanten weisen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen die Außenmembranproteine Mmm1, Mdm10, Mdm12 oder Mmm2 fehlen. Die Deletion von MDM31 oder MDM32 in Kombination mit MMM1, MDM10, MDM12 oder MMM2 ist synthetisch letal, d. h. die Doppelmutanten sind nicht lebensfähig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beteiligten Komponenten eine Funktion in demselben zellulären Prozess spielen. Wahrscheinlich führt die Addition der Effekte, die die Einzeldeletionen auf die Struktur und Motilität der Mitochondrien haben, zur kompletten Hemmung der Vererbung der Organellen. Damit sind Mdm31 und Mdm32 die ersten mitochondrialen Innenmembranproteine, für die ein funktioneller Zusammenhang mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran bei der Vererbung und strukturellen Integrität der Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner sind sie die ersten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die Einfluss auf die Struktur und Stabilität des mitochondrialen Genoms nehmen.

Der Tonus der glatten Muskulatur wird einerseits direkt durch Aktivierung des kontraktilen Apparates und andererseits über Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration gesteuert. NO freisetzende Pharmaka aktivieren die lösliche Guanylylzyklase und führen über den cGMP/cGMP-Kinase abhängigen Signalweg zur Erschlaffung der glatten Muskulatur. Wie die Kinase dieses Signal vermittelt ist noch weitgehend unklar, wobei schon einige Substrate der cGMP-Kinase I bekannt sind. In der Mikrosomenfraktion glatter Muskeln wurde ein stabiler Komplex der cGMP-Kinase I und ihrer Substrate IRAG und IP3-Rezeptor Typ I beschrieben, der für die Steuerung des Calciumausstroms aus Speichern des sarkoplasmatischen Retikulums verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit sollte dieser mikrosomale Komplex genauer untersucht und die beteiligten Proteine gereinigt und charakterisiert werden. Dies geschah vor allem durch Co- Immunpräzipitationen mit spezifischen Antikörpern und Affinitätschromatographie mit cGMP-Agarose. Die Identifizierung der gereinigten Proteine erfolgte durch MALDI-TOF Analyse und Immunoblot, wobei Substrate der Kinase nach cGMP-abhängiger Phosphorylierung mit radioaktiv markiertem ATP detektiert wurden. Der Komplex wurde aus dem glatten Muskel der Trachea von Rindern aufgereinigt und seine Bestandteile isoliert. Dabei ergab sich die Assoziation von Phospholamban, einem Substrat der cGMP-Kinase, das den Calcium Rücktransport durch die Ca2+-ATPase in Speichervesikel des sarkoplasmatischen Retikulums moduliert. Die Interaktion von Phospholamban mit der cGMP-Kinase I β und dem IP3-Rezeptor Typ I konnte nach heterologer Expression der Komponenten in COS 7 Zellen bestätigt werden. Dazu wurde Phospholamban aus cDNA des Herzens der Maus kloniert und mit je einer der beiden Isoformen der cGMP-Kinase I α und β, dem IP3-Rezeptor Typ I und IRAG in COS 7 Zellen exprimiert. Weiterhin konnte die Assoziation des Komplexes an die zytoskelettalen Proteine α-Aktin und Calponin H1 gezeigt werden. Das Zytoskelett kann einerseits zur Stabilisierung des Komplexes im glatten Muskel beitragen. Andererseits kann der Komplex Membranproteine mitdem Zytoskelett verbinden und einen direkten Einfluss auf die Calcium unabhängige Kontraktion der Zelle haben. Als einzige Funktion von Phospholamban ist bisher die Regulation der Ca2+-ATPase beschrieben worden, daher wurde deren Assoziation an den funktionellen Komplex untersucht. Dazu wurde der Komplex an cGMP-Agarose gereinigt und nach Elution eine Co-Immunpräzipitation mit den spezifischen Antikörpern der Komplexbestandteile durchgeführt. Die differenzierte Auftrennung über zwei Säulen deckte die Existenz zweier Proteinkomplexe auf, die über das Zytoskelett miteinander verbunden sind. Einer besteht aus Phospholamban und der Ca2+-ATPase und steuert die Aufnahme von Calcium in intrazelluläre Speicher, der andere enthält einen geringeren Teil Phospholamban, die cGMP-Kinase I β und ihre Substrate IRAG und den IP3-Rezeptor Typ I. Dieser zweite Komplex reguliert wahrscheinlich den Calciumausstrom aus dem sarkoplasmatischen Retikulum.