Podcasts about kardiomyozyten

Die miR-30-Familie gehört zu den am stärksten exprimierten microRNAs im Herzen. Expressionsanalysen zeigten, dass alle Mitglieder der miR-30-Familie bei humaner Herzinsuffizienz und bei Mäusen im Rahmen einer post-Infarkt- Herzinsuffizienz herunterreguliert werden. Überraschenderweise fanden wir auch bei physiologischer Hypertrophie nach Lauftraining eine Herunterregulation von miR-30. Dies könnte ein Indiz für eine kardioprotektive Funktion der Herunterregulation der miR-30-Familie im Rahmen von pathologischem Stress sein könnte. Im Einklang mit dieser Hypothese entwickelten transgene Mäuse mit Kardiomyozyten-spezifischer Überexpression einzelner miR-30-Familienmitglieder eine dilatative Kardiomyopathie und starben deutlich verfrüht. Anhand von Gen-Array-Analysen mit Herzen von transgenen miR-30-Mäusen sowie bioinformatischer Zielgensuche mit TargetScan konnten wir RGS2, DDAH1, EDNRA und ADRA2A als mögliche Ziel-Gene identifizieren, über die miR-30 potentielle kardioprotektive Effekte ausüben könnte. Durch weitere Analysen mit Luciferase-Assays konnten wir zeigen, dass die miR-30-Familie diese Gene tatsächlich direkt über ihre 3’-UTRs regulieren kann. Zusammenfassend lässt sich folgern, dass die Herunterregulation von miR-30 im Rahmen von kardialem remodeling einen kardioprotektiven Effekt haben könnte.

Thu, 6 Dec 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15201/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15201/1/Schmidt_Maximilian.pdf Schmidt, Maximilian ddc:610,

Sat, 21 Jul 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14782/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14782/1/Schuster_Katharina.pdf Schuster, Katharina dd

Der akute Myokardinfarkt stellt in den Industrienationen immer noch eine der häufigsten Todesursachen dar. Auch nach Wiedereröffnen des Gefäßes führt eine prolongierte myokardiale Ischämie zur Ausbildung eines Infarktareals. Neben der irreversiblen Schädigung der Myozyten während der Ischämie kommt es auch zu dem so genannten Reperfusionsschaden, dieser kann aber, zumindest tierexperimentell, durch eine entsprechende Therapie verringert werden. Wir konnten bereits zeigen, dass die retrograde Applikation von embryonalen endothelialen Vorläuferzellen, von murinen Embryonen Tag 7,5 (Tie-2+, c-Kit+, Sca-1+, flk-1 low, MHC-1-) eine Kardioprotektion über lösliche Faktoren vermittelt. Diese Reduktion der Infarktgöße war über einen PI3K-AKT Signaltransduktionsweg vermittet. In der hier vorliegenden Studie haben wir uns mit dem Einfluss von Thymosin β4 auf die eEPC vermittelte Kardioprotektion beschäftigt. Methoden: In vitro wurden neonatale ventrikuläre Myozyten der Ratte einer Hypoxie (4 h) und Reoxygenation (1 h) ausgesetzt. Die überlebenden Zellen wurden mittels Trypan-Blau-Exklusion identifiziert. Des Weiteren wurden neonatale ventrikuläre Endothelzellen der Ratte auch einer Hypoxie (18 h) und Reoxygenation (4 h) ausgesetzt und die Apoptoserate mittles TUNEL-Färbung analysiert. Embryonale EPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion wurden während Hypoxie kokultiviert oder Thymosin β4 Protein wurde dem Medium zugesetzt. In Schweinen (n= 9 pro Gruppe) wurde am Tag 1 mittels LAD-Verschluß (1 h) ein Infarkt induziert. 5x106 eEPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion oder Thymosin β4 Protein wurden nach 55 min Ischämie in die anteriore interventrikulare Herzvene retroinfundiert. Nach 24 h Reperfusion wurden die globale und regionale Myokardfunktion (Sonomikrometrie) sowie die Infarktgröße bestimmt. Darüber hinaus wurde die Inflammation mittels Myeloperoxidase Analyse im Gewebe untersucht. Ergebnisse: Die „short hairpin“ Ribonukleinsäure (shRNA) Transfektion führte zu einer verringerten Thymosin „messanger“ RNA Expression in „real time“ Polimerase Kettenreaktions-Untersuchungen (rt-PCR). In Zellkultur war der Anteil überlebender neonataler Kardiomyozyten in Anwesenheit von eEPCs signifikant erhöht, wenn diese Zellen Thymosin β4 exprimierten. Die Analyse der TUNEL-Färbung zeigte eine deutlich geringere Apoptoserate der neonatalen Endothelzellen, die mit eEPCs kokultiviert wurden, es sei denn die Thymosin β4 Expression wurde durch Transfektion der shRNA reduziert. Die Applikation von Thymosin β4 Protein zeigte bei beiden Zellarten ein ähnliches Ergebnis wie die Kokultivierung mit den eEPCs. In vivo waren nach 24 h zahlreiche Zellen im ischämischen Areal nachweisbar. Die Anzahl der Zellen war durch die Reduktion der Thymosin β4 Expression nicht beeinträchtigt. Die regionale Applikation der eEPCs reduzierte die Infarktgröße signifikant gegenüber der Kontrollgruppe, wohingegen die Thymosin β4 shRNA Transfektion der eEPCs diesen Effekt inhibierte. Auch hier zeigte die retrograde Applikation des Thymosin β4 Proteins eine kardioprotektive Wirkung, die ähnlich ausgeprägt war wie die der eEPCs. Die Analyse der TUNEL-positiven Zellen zeigte eine deutliche Reduktion der Apoptoserate nach Retroinfusion der eEPCs oder des Thymosin β4 Protein, auch hier verloren die eEPCs ihre protektiven Eigenschaften nach der Transfektion mit Thymosin β4 shRNA. Die Inflammation im Ischämieareal, ein wichtiges Kennzeichen für die Ausprägung des Ischämie/Reperfusionsschadens, konnte durch die Verabreichung von eEPCs und auch Thymosin β4 Protein signifikant reduziert werden. Die Reduktion der Thymosin β4 Expression verhinderte wiederum diesen kardioprotektiven Effekt. Diese Untersuchungen zeigen, dass embryonale endotheliale Vorläuferzellen den Ischämie/Reperfusionsschaden zu einem frühen postischämischen Zeitpunkt verringern. Der kardioprotektive Effekt dieser Zellen ist zumindest teilweise Thymosin β4 abhängig, da eine analoge Protektion durch die lokale Applikation von Thymosin β4 Protein erreicht werden kann. Generell zeigt diese Arbeit, dass neben dem direkten Einsatz von Vorläuferzellen und Stammzellen zur Behandlung des Reperfusionsschadens diese Zellen auch genutzt werden können, um mögliche Kandidatenproteine zur Kardioprotektion nach akutem Myokardinfarkt zu identifizieren und somit eine effektive Therapie des Reperfusions-schadens beim Menschen zu ermöglichen.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen heute in der westlichen Welt die häufigste Todesursache überhaupt dar. In der Vergangenheit wurde deshalb zu deren Therapie bereits eine Vielzahl an medikamentösen und chirurgischen Behandlungsmöglichkeiten entwickelt, die jedoch insbesondere in schweren Erkrankungsfällen keine langfristig zufrieden stellenden Optionen bieten konnten. Von Embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) erhofft man sich deshalb ganz neue, zelltherapeutische Möglichkeiten. Durch das Potential, vitales Herzmuskelgewebe aus diesen pluripotenten Zellen in vitro generieren zu können, eröffnen sich dabei für die kausale Behandlung der Herzinsuffizienz bisher ungeahnte Perspektiven. Zwei der Hauptprobleme bei der Gewinnung von Kardiomyozyten aus der differenzierten ES-Zell-Kultur stellen jedoch zum einen der geringe Anteil von Herzmuskelzellen an der Mischkultur und zum anderen deren schwierige hochselektive Aufreinigung dar. Durch Entschlüsselung der Stammzellentwicklung und der daran beteiligten Faktoren und Signalkaskaden könnte es jedoch in Zukunft möglich werden, die Steuerung für diese Differenzierung zu übernehmen, um so aus den hoch proliferativen, pluripotenten Vorläuferzellen Kardiomyozytenreinkulturen gewinnen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde der früh während der Embryonalentwicklung exprimierte Transkriptionsfaktor mesoderm posterior 1 (MesP1) als mögliche Schlüsselkomponente der kardiovaskulären Entwicklung detailliert untersucht. Mithilfe eines dafür konstruierten Vektors konnte der Faktor MesP1 in stabil-transfizierten, murinen embryonalen Stammzellen überexprimiert – und so dessen induktive Wirkung auf die Entwicklung von Herz- und Endothelzellen während der ES Zell-Differenzierung auf molekularer wie auch zellulärer Ebene nachgewiesen werden. So zeigte sich in den transgenen Zellen bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung eine verstärkte Expression u. a. der frühen kardialen Transkriptionsfaktoren Nkx2.5 und GATA-4, die sich später während der Differenzierung in einer mehrfach erhöhten Ausbeute an Kardiomyozyten und Endothelzellen in der Zellkultur widerspiegelte. Die Funktionalität der amplifizierten Kardiomyozyten bezüglich Kontraktionsfrequenz und Reagibiliät auf vegetative Reize blieb dabei unverändert erhalten. Bei der Analyse der Keimblattentwicklung fiel auf, dass durch Überexpression des mesoderm posterior 1 in den transgenen Zellen die Menge an Gesamtmesoderm unverändert blieb, jedoch innerhalb dieses Keimblattes die Differenzierung deutlich in Richtung kardiovaskulär und zu Lasten der Skelettmuskelentwicklung verschoben war. Im Ektoderm zeigte sich eine verstärkte neurale Entwicklung, induziert durch die vermehrt vorhandenen kardiogenen Zellen. Die Bildung des Endoderms war unbeeinträchtigt. Im Folgenden konnte schließlich in Untersuchungen zur Signaltransduktion der Mechanismus der MesP1-vermittelten kardiovaskulären Induktion aufgeklärt werden, indem der Faktor Dickkopf-1, ein Inhibitor des Wnt-Signalweges, als Zielgen des Transkriptionsfaktors MesP1 identifiziert und in Folgeversuchen mittels Bandshift auch bestätigt werden konnte. Die Blockade des Wnt-Signalweges ist verantwortlich für die Initiierung der kardiovaskulären Differenzierung während der Embryonalentwicklung. MesP1 stellt damit einen besonderen Faktor während der Embryogenese dar und einen wichtigen Startpunkt für die weitere Entzifferung der komplexen Signaltransduktionskaskaden der Herz- und Gefäßentwicklung. Das vollständige Verständnis dieses komplexen Netzwerkes sowie die Übertragung auf das humane ES-Zell-System könnte es einmal ermöglichen, Herzmuskelerkrankungen des Menschen mit embryonalen Stammzellen therapieren zu können.

Da die Magnetresonanztomographie (MRT) in der Forschung und Diagnostik immer mehr an Bedeutung gewinnt, war es das Ziel dieser Arbeit, die MRT an verschiedenen Herzinsuffizienzmodellen einer Maus mittels klinischem Scanner zu etablieren und Referenzwerte zu erstellen. Es wurden gesunde Wildtyp-Mäuse untersucht und solche, bei denen zuvor ein Myokardinfarkt durch ein Ischämie/Reperfusionsmodell bzw. Dauerokklusionsmodell erzeugt wurde. Durch Ligierung der linken Koronararterie wurde der Myokardinfarkt hervorgerufen. Bei einer Gruppe schloss sich der Ischämie von 30 Minuten eine Reperfusionsphase von neun Tagen an, bei der anderen Gruppe wurde eine Dauerokklusion vorgenommen, die über einen Zeitraum von neun Tagen bestehen blieb. Vor und nach dem chirurgischen Eingriff wurden alle Tiere mittels Ultraschall untersucht. Ein 1,5 Tesla Scanner diente nachfolgend zur Untersuchung der Mäuse. Abschließend wurden die Herzen der Mäuse entnommen, mit 2,3,5-Triphenyltertrazolium-Chlorid (TTC) gefärbt, in ca 1 mm dicke Scheiben geschnitten und fotografiert. Die Infarktgröße wurde durch ein Computerprogramm ermittelt. Ein anderer Teil dieser Arbeit bestand in der Untersuchung von Mäusen, bei denen das Muscle LIM Protein (MLP) ausgeknockt war. MLP spielt eine wichtige Rolle bei der Organisation der Kardiomyozyten. Homozygote Knockouts entwickeln bei Geburt eine dilatative Kardiomyopathie, die mittels Ultraschall und MRT untersucht werden sollte. Sowohl die Werte der Echokardiographie, als auch die der MRT waren post operationem deutlich herabgesetzt, und korrelierten miteinander. Die Kontrollgruppe zeigte eine Verkürzungsfraktion (FS) von 38 ± 1,10 % und eine Auswurffraktion (EF) von 56,86 ± 8,62 %. Die Gruppe der reperfundierten Mäuse zeigte eine FS von 38,89 ± 1,15 % vor und 17,39 ± 6,28 % nach der Operation. Im MRT ergab sich für diese Gruppe eine Auswurffraktion von 54,06 ± 3,09 %. Für die Gruppe der Mäuse, bei der eine Dauerokklusion vorgenommen wurde, ergab sich bei der FS ein Wert von 38,67 ± 1,24 % vor und 11,31 ± 2,60 % nach der Operation und eine EF von 23,3 ± 9,86 %. Für die Mäuse des MLP-Stammes ergaben sich eine FS von 16,22 ± 2,90 % und eine EF von 29,95 ± 5,28 %. Sie wiesen vergrößerte Herzkammern bei gleichzeitiger Ausdünnung der Kammerwände auf. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine 30-minütige-Ischämiezeit einen zu kleinen Infarkt erzeugt, als dass dieser von einem 1,5 Tesla MRT erkannt werden könnte. Veränderungen am Herzen, die durch eine Dauerokklusion hervorgerufen werden oder bei MLP-Knockouts bestehen, sind hingegen durch die MRT deutlich darstellbar. Diese beiden Modelle bieten sind demnach für weitere Forschungen an.

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt näher bringen.

Es wurden die hämodynamischen, biochemischen und morphologischen Effekte einer Angiotensin-II-Rezeptorblockade mit dem AT1-Blocker Losartan auf eine hypoxie-induzierte rechtsventrikuläre Hypertrophie an der Ratte untersucht. In weiblichen „Sprague Dawley“ Ratten wurde eine isolierte rechtsventrikuläre Hypertrophie durch intermittierende Hypoxie hervorgerufen. Die intermittierende Hypoxie bewirkte einen Anstieg des rechtsventrikulären Drucks und eine Erhöhung des Verhältnisses von Ventrikelgewicht zu Körpergewicht im rechten Ventrikel, die Hypoxiebehandlung hatte keinen Einfluss auf die linksventrikulären Kreislaufparameter oder das Herzzeitvolumen. Die Aktivitäten der Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase und der 6-Phosphoglukonat-Dehydrogenase waren nach der Hypoxiebehandlung im rechten Ventrikel erhöht, jedoch nicht im linken Ventrikel. In der Hypoxiegruppe ohne Losartan war das Zellvolumen der isolierten Kardiomyozyten erhöht, die Kardiomyozytenzellänge unverändert, so dass man von einer hypoxieinduzierten rechtsventrikulären Hypertrophie vom primär konzentrischen Typ ausgehen muss. Losartan verringerte den hypoxie-induzierten Anstieg des rechtsventrikulären systolischen Druckes, die Zunahme des Verhältnisses von rechtsventrikulärem Gewicht zu Körpergewicht und die Enzymaktivitätserhöhung signifikant, wenn auch nicht vollständig. Die Zunahme des Volumens und der Querschnittsfläche der isolierten Kardiomyozyten wurde durch Losartan jedoch vollkommen verhindert.

In ischämisch geschädigten Regionen des Herzens, konnte mit Hilfe der Positronen Emissions Tomographie (PET) eine erhöhte Aufnahme des Glukoseanalogs Fluor-18-Deoxyglukose (18FDG) bei gleichzeitig verminderter Durchblutung festgestellt werden. Diese Beobachtung weist auf noch vitales Gewebe mit verändertem Glukosemetabolismus hin und ist Ausdruck einer Stoffwechseladaption an diese besondere Situation. Ziel der Studie war es festzustellen, inwieweit eine erhöhte Expression der Glukosetransporter GLUT1, 3, 4, bzw. der Hexokinase (HK) ursächlicher (Teil-) Mechanismus für die beobachtete Steigerung der Glukoseaufnahme in die Herzmuskelzelle sein kann. Methoden: Zur Überprüfung der Existenz einer natürlichen regionalen Variabilität der Untersuchungsparameter, wurde eine molekularbiologische Analyse zuerst am nicht-ischämischen Schweinemyokard durchgeführt. Die Herzen von geschlachteten Tieren (n=6) wurden in definierte epi- und endokardiale Regionen des linken und rechten Ventrikels, sowie den Atrien unterteilt. Der zweite Teil der Studie untersuchte die Veränderungen in chronisch ischämischen Herzen (n=6). Im tierexperimentellen Versuchsaufbau wurde dafür bei jungen Schweinen ein modifizierter Stent in die linke Koronararterie (LAD) implantiert, der zu einer initialen Stenose von 75% führte. Ziel war ein langsamer Fortschritt des Verschlusses mit kompletter Stenose nach Ende des Versuchzeitraums von 28 Tagen. Anschließend wurden klinische Untersuchungen mit Hilfe des PETs durchgeführt, die Tiere euthanasiert und die Herzen entnommen. Myokardiale Biopsien wurden aus Regionen gewonnen, in denen im PET eine erhöhte Glukoseaufnahme bei gleichzeitig reduzierter Perfusion festgestellt worden war („mismatch“), aus Arealen mit reduzierter Perfusion und normalem bzw. vermindertem Glukosestoffwechsel („match“), sowie aus Regionen ohne jegliche Veränderung (REMOTE). Die Gewebeproben wurden auf ihren Protein- und mRNA-Gehalt an GLUT1, 3, 4, sowie der Hexokinase II untersucht. Die Quantifizierung der Proteine erfolgte nach Anreicherung der Membranfraktionen, durch Immunoblotting mit spezifischen Antikörpern und wurde bezogen auf einen intern mitgeführten Standard ausgewertet. mRNA wurde aus dem Gewebe extrahiert und die Kopienanzahl nach RT-PCR mit Hilfe der LightCycler Technik und spezifischen, fluoreszierenden Hybridisationsproben bestimmt. Ergebnisse: Die Ergebnisse der nicht-ischämischen Herzen zeigen, dass innerhalb des linken Ventrikels keine regionalen Unterschiede der untersuchten Parameter nachzuweisen waren. Interessanterweise konnte dagegen im Bereich der Atrien eine deutliche Reduktion der GLUT1 Expression festgestellt werden. In den ischämischen Herzen wurde innerhalb des Versorgungsgebietes der linken Koronararterie (LAD) eine signifikante Steigerung (p

Fragestellung: Die klinische Herz-Xenotransplantation scheint aufgrund vielfältiger wissenschaftlicher Fort-schritte wahrscheinlicher zu werden, jedoch könnten präformierte natürliche Antikörper, die ohne vorausgegangene Sensibilisierung im Blut vorhanden sind und Antigene fremder Spezies erkennen, auch bei therapeutischer Bewältigung der initialen hyperakuten Abstoßungsreaktion zur anhaltenden Transplantatdysfunktion führen. Tage bis Wochen nach Antigenerstkontakt käme es im xenogenen System zusätzlich zur Bildung induzierter Antikörper, die gegen das Fremdgewebe gerichtet sind. Ziel der vorliegenden Arbeit ist, an spontan kontrahierenden Kardiomyozyten das Wirkungs-profil präformierter natürlicher Antikörpern im Vergleich mit induzierten Antikörpern (durch Verimpfung von Rattenherzgewebe oder Rattenherzzellen in Kaninchen gewonnen) zu unter-suchen. Methodik: Zu Kulturen spontan kontrahierender, neonataler Rattenkardiomyozyten werden Seren zuge-geben, die präformierte oder induzierte Antikörper enthalten (dialysierte, Elektrolyt-, pH-, thermoäquilibrierte, mit Medium verdünnte Seren). Im Vergleich zu den nativen Seren wer-den dieselben Seren nach Entfernung der xenoreaktiven Antikörper aus den Seren (messbar durch den Hämagglutinationstiter gegen Rattenerythrozyten) und/oder Inaktivierung der Komplementkomponenten untersucht. Zum Einsatz kommt einerseits humanes Serum mit ei-nem hohen Gehalt an präformierten xenoreaktiven Antikörpern; Spenderserum wird hierbei im Vergleich mit kommerziell erhältlichen Humanimmunglobulinpräparationen eingesetzt. Andererseits wird Serum mit einem hohen Gehalt an spezifischen induzierten Antikörpern gegen Rattenherzepitope in den Inkubationsexperimenten verwandt. Das Serum wurde nach Verimpfung von Rattenherzgewebe oder Rattenherzzellen in Kaninchen gewonnen. Die Kontraktionen werden über ein Phasenkontrastmikroskop mittels eines photoelektrischen Systems registriert und videotechnisch dokumentiert. Als Parameter der Kontraktilität dienen die Frequenz, Amplitude und Kontraktions-/Relaxationsgeschwindigkeit. Das Ausmaß der synzytialen Kopplung im Zellverband wird als Streuung der Kontraktionsfrequenzen (Variati-onskoeffizienten, Tests nach Hartley, Mann-Whitney und Cochran, Scatterdiagramme) ermit-telt. Als Zytotoxizitätsparameter werden der zelluläre Gehalt an Kalium und Protein sowie an energiereichen Phosphaten, die Trypanblauaufnahme und die elektronenmikroskopisch er-fassbare Ultrastruktur bestimmt. Der Nitritgehalt des Kulturüberstands als Endprodukt des Stickoxidmetabolismus fungiert als ein Maß für die Zellaktivierung. Ergebnisse: (1) Spontane Zellkontraktionen neonataler Rattenkardiomyozyten kommen nach Gabe von Seren mit präformierten natürlichen Antikörpern - einem stereotypen, reproduzierbaren Mus-ter eines geänderten Schlagverhaltens folgend - zu einem passageren Stillstand, der über eini-ge Minuten anhält und spontan reversibel ist. Die Kontraktionen bleiben anschließend über Stunden desynchronisiert in Gegenwart der präformierten natürlichen Antikörper im Sinne einer Entkopplung des funktionellen Synzytiums der Zellmonolayer; dabei bleiben die Kardi-omyozyten vital, jedoch kommt es zu einer Zellaktivierung, kenntlich an einer vermehrter zel-lulären Nitritproduktion. Absorption der spezifisch gegen Rattenepitope gerichteten xenoreak-tiven Antikörper, nicht aber Dekomplementierung der Seren verhindert die Desynchronisati-on. (2) Seren mit induzierten Antikörpern führen dagegen zeit- und konzentrationsabhängig zur Zytotoxizität bis zum Zelltod der neonatalen Rattenkardiomyozyten. Hierfür sind sowohl Komplementkomponenten als auch induzierte xenoreaktive Antikörper erforderlich. Schlussfolgerungen: Präformierte natürliche Antikörper könnten in vivo eine Dysfunktion xenogener Herztrans-plantate im Sinne einer fehlenden synzytialen Koordination der Kardiomyozyten auslösen. Induzierte Antikörper haben eine zytotoxische Wirkung, die die Zellintegrität gefährdet.

Seit der ersten Charakterisierung des Ih-Stroms wird dessen Funktion im Herzen, insbesondere während der langsamen spontanen Depolarisation im Sinusknoten kontrovers diskutiert. 1998 gelang es mehreren Arbeitsgruppen unabhängig voneinander, die entsprechenden Gene zu identifizieren, die für die Ih-Kanäle kodieren. Diese HCN-Genfamilie umfasst 4 Isoformen, wobei jede Isoform ein spezifisches Expressionsmuster besitzt. Im Säugetiersinusknoten konnte auf Transkriptebene gezeigt werden, dass HCN4 die dominante HCN Isoform darstellt. Um die physiologische Funktion von HCN4 aufzuklären wurden in der vorliegenden Arbeit Mäuse generiert und analysiert, die für diese HCN Isoform defizient sind. Es konnte gezeigt werden, dass HCN4 für die Funktion des sich entwickelnden kardialen Reizleitungssystems essentiell ist. Im Wildtyp Embryo wird HCN4 Transkript und Protein in der Region exprimiert, in der sich der Sinusknoten entwickelt. Mäuse die für den HCN4-Kanal ubiquitär oder herzspezifisch defizient sind, sterben zwischen ET 10,0 und 11,5. Histologische Untersuchungen an den HCN4-defizienten Tieren zeigten keine offensichtlichen morphologischen Defekte. Im Durchschnitt ist Ih in den Knock-out Kardiomyozyten um 85% reduziert. Die Herzen der HCN4-defizienten Mäuse schlagen signifikant langsamer als die von Wildtypen und können durch cAMP nicht stimuliert werden. Sowohl in Wildtypen als auch in HCN4-/--Mäusen konnten Kardiomyozyten mit einem "primitiven" Schrittmacherpotential detektiert werden. Hingegen sind Zellen mit einem ausgereiften Schrittmacherpotential, die im Wildtyp ab ET 9,0 auftreten, nicht im Knock-out zu finden. Deshalb ist der HCN4-Kanal für die Bildung von Schrittmacherpotentialen im sich entwickelndem Sinusknoten essentiell. Im adulten Tier wird HCN4 ausschließlich in Herzregionen exprimiert die spontane Aktivität aufweisen. Proteinexpression wurde sowohl im ganzen Sinusknoten als auch in isolierten Sinusknotenzellen, im AV Knoten und auf den Herzklappen nachgewiesen. Wegen der embryonalen Letalität des globalen HCN4 Knock-outs wurden mit Hilfe des Cre loxP Systems herzspezifische HCN4-defiziente Tiere hergestellt. Nach genauer Analyse von fünf verschiedenen Cre Transgenen konnte schließlich mit Hilfe der induzierbaren MerCreMer Maus die HCN4 Expression im Sinusknoten um etwa 90% reduziert werden. Mit diesen Tieren sollte es möglich sein, die Rolle von Ih im Herz zu untersuchen. Vorläufige in-vivo EKG Messungen ergaben aber Bemerkenswerterweise bisher noch keine Unterschiede zwischen Wildtyp und der herzspezifischen HCN4-MerCreMer-KO Maus.

Development of an expression cloning system in primary cardiomyocytes - Validation of Translin as a new target for heart failure Congestive heart failure continues to represent a life threatening disease with unmet medical need. Functional impairment of the insufficient heart is reflected in altered geometry of the left ventricle. On the cellular level, cardiac myocytes respond to the increased biomechanical stress by different processes including sarcomeric remodelling and changes in cell shape. In order to identify new regulator genes for sarcomeric rearrangement, we developed an expression cloning system in primary cardiomyocytes. A normalized human heart library was integrated in an inducible adenoviral vector system. After transduction of cardiomyocytes and induction of the transgenes, cells were analyzed for morphological changes reflecting the hypertrophic process. A new system based on laser scanning cytometry was developed as read out. We managed to screen hundreds of cDNAs leading to the discovery of the new target protein Translin. Its overexpression caused the hypertrophic elongation of cardiomyocytes in vitro and could be involved in the pathologic regulation of posttranscriptional RNA processes. These data correlated with the upregulation of Translin in the diseased state of the human heart in vivo. In conclusion, this cell based screen led to the functional characterization of a novel regulator of heart disease providing a basis for the development of innovative drugs for the causative treatment of the insufficient human heart.

Das gasf?xF6;rmige Signalmolek?xFC;l Stickstoffmonoxid (NO) ist an der Steuerung vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Zahlreiche Studien weisen darauf hin, dass NO die Synthese des "second Messengers" cGMP bewirkt, welcher die cGMP-abh?xE4;ngige Proteinkinase Typ I (cGKI) aktiviert. Um die in vivo-Funktion der cGKI aufzukl?xE4;ren, wurden bereits konventionelle cGKI Knockout M?xE4;use generiert und analysiert. Da diese Nullmutanten einen multiplen Ph?xE4;notyp und eine stark verminderte Lebenserwartung aufweisen, k?xF6;nnen bestimmte Fragestellungen mit diesen Tieren nicht untersucht werden. Die Probleme, die sich aus der Deletion des cGKI Gens im gesamten Organismus ergeben, konnten durch die Methode der konditionalen somatischen Mutagenese mit Hilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems umgangen werden. Diese Technik erm?xF6;glicht es, ein Gen Zeit- und Gewebe-spezifisch auszuschalten und damit den schwerwiegenden Ph?xE4;notyp der konventionellen cGKI Mutanten zu umgehen. Ziel der Arbeit war es, konditional cGKI-defiziente M?xE4;use zu generieren, die cGKI Expression in diesen Tieren zu analysieren und deren Ph?xE4;notyp zu charakteriesieren. In dieser Arbeit sind vier konditional cGKI-defiziente Mausmutanten beschrieben, welche einen selektiven Verlust der cGKI im jeweils gew?xFC;nschten Gewebe (Hippocampus, Purkinje Zellen des Kleinhirns, Kardiomyozyten oder viszerale und vaskul?xE4;re glatte Muskelzellen) zeigten. Dadurch konnten erstmals Gewebe-spezifische Funktionen der cGKI in erwachsenen M?xE4;usen untersucht werden