Podcasts about modellorganismus

Die Themen: So schadet die Feldmaus der Landwirtschaft | Wie der Mensch die Entwicklung der Maus vorantreibt | So funktioniert die geheime Sprache der Mäuse | Wie die Mäuse als Modellorganismus der Forschung dienen

Die Labormaus ist das wichtigste Versuchsstier der Welt. Allein in Deutschland werden jedes Jahr rund zwei Millionen Mäuse bei Versuchen eingesetzt. Inzwischen sucht die Wissenschaft nach alternativen Forschungsmethoden.

Staffelfinale! Zum letzten mal in Staffel 1 sprechen wir über Themen, die mit dem Anfangsbuchstaben des Folgentitels beginnen. Dazu haben wir uns Becci eingeladen, die sonst bei den Kulturpessimisten oder den Geschichtenkapseln spricht. - Den Einstieg wagt Adrian mit dem Thema /*/Zebrafisch/*/. Der eigentlich Zebrabärbling genannte Fisch vereint alle Eigenschaften, die ein Modellorganismus braucht. Dadurch hat er Einzug in tausende Labore gefunden und dient dort in der Entwicklungsbiologie und Alzheimerforschung. Außerdem gibt es ihn als selbstleuchtende Aquariumsdekoration, den GloFish. - Jeder war schon mal in einer Situation in der /*/Zivilcourage/*/ angebracht gewesen wäre. Es ist jedoch nict immer so leicht sie auch zu zeigen, und Becci zählt auf, was für Faktoren uns davon abhalten. Und (und das icht vielleicht wichtiger) wie wir uns trainieren können selbst die Furcht davor zu verlieren um im richtigen Moment eingreifen zu können. Ein Tip sind Zivilcourage-Kurse, die z.B. von der Polizei angeboten werden. - Wusstet ihr, dass das fordern von Zinseszinsen verboten ist? Theroetisch. Max zeigt und wie /*/Zins/*/ funktioniert und wo er überall vorkommt. Die Gebühr auf Geld kommt praktisch im gesamten Finanzsektor vor - und das eigentlich schon, seit es Geld an sich gibt. Selbst unsere Miete ist eigentlich ein Zins. Zum Staffelfinale möchten wir uns außerdem bedanken. Bei euch Hörern und Hörerinnen, allen Menschen, die uns Stunden Arbeit erspart haben indem ihr uns Themen vorgeschlagen habt und natürlich bei allen Gästen: Jakob, Dominic, Stefan, Lars, Daniel, Emma, Roland, Matthias und jetzt auch Becci Kontaktmöglichkeiten: ABCoholics (.at.) Posteo.de @ABCoholics (Twitter) ABCoholics.xyz PS: In der Staffelpause wird es eine spannende Crossover-Folge gemeinsam mit den Jungs vom Random Scientist Podcast geben! Da könnt ihr auch richtig gespannt drauf sein :D

Zuwachs im Sonnensystem? - Haben Forscher einen neuen Planeten entdeckt? / Deep Learning - Revolution in der Künstlichen Intelligenz? / Kampf gegen die Tigermücke - Brasilien und das Zika-Virus / Ewig junge Tabakpflanzen - Die schwierige Arbeit mit einem Modellorganismus

Der Paläontologe Andreas Kroh vom Naturhistorischen Museum der Stadt Wien spricht über Seeigel, die zu den Stachelhäuter gezählt werden und eine alte Klasse wirbelloser Tiere darstellen, die schon im Erdaltertum vor über 400 Millionen Jahren lebten. Sie stehen entwicklungsgeschichtlich an der Grenze zwischen wirbellosen Tieren und Wirbeltieren. Biologen, Paläontologen, Zellbiologen, Ökologen und Meeresforscher. Viele Wissenschafsgruppen beschäftigen sich mit Seeigel, die für sie einen Modellorganismus bilden. Ihre Eizellen sind sehr transparent und dadurch neugierigen Blicken in frühen Stadien der Zellteilung zugänglich. Die meisten Arten sind bereits Ende der Permzeit vor 250 Millionen Jahren ausgestorben, sie waren sehr unterschiedlich in ihren Erscheinungen. Aus den wenigen überlebenden Arten sind dann die heutigen Formen entstanden, die daher sehr einheitlich in ihrer Körperform sind. Die meisten heute lebenden Stachelhäuter haben eine fünfstrahlige Symmetrie, die es außerhalb des Stamms der Stachelhäuter in der Natur nur noch bei Pflanzen gibt. Das machte sie zu begehrten Objekten schon in der Jungsteinzeige für kultische Zwecke. In den marinen Ökosystemen halten sie auf Riffen das Algenwachstum unter Kontrolle, sie ermöglichen dadurch den Riffen zu wachseln. Zusätzlich produzieren sie kalkhaltige Ausscheidungen die die Riffe festigen. Foto-Credit: NHM Wien, A. Kroh / A. Schumacher Interviewpartner: Dr. Andreas Kroh Natural History Museum Vienna

Der Paläontologe Andreas Kroh vom Naturhistorischen Museum der Stadt Wien spricht über Seeigel. Sie werden zu den Stachelhäuter gezählt und stellen eine alte Klasse wirbelloser Tiere dar, die schon im Erdaltertum vor über 400 Millionen Jahren lebten. Seeigel stehen entwicklungsgeschichtlich an der Grenze zwischen wirbellosen Tieren und Wirbeltieren. Biologen, Paläontologen, Zellbiologen, Ökologen und Meeresforscher. Viele Wissenschafsgruppen beschäftigen sich mit Seeigel, die für sie einen Modellorganismus bilden. Ihre Eizellen sind sehr transparent und dadurch neugierigen Blicken in frühen Stadien der Zellteilung zugänglich. Die meisten Arten sind bereits Ende der Permzeit vor 250 Millionen Jahren ausgestorben, sie waren sehr unterschiedlich in ihren Erscheinungen. Aus den wenigen überlebenden Arten sind dann die heutigen Formen entstanden, die daher sehr einheitlich in ihrer Körperform sind. Die meisten heute lebenden Stachelhäuter haben eine fünfstrahlige Symmetrie, die es außerhalb des Stamms der Stachelhäuter in der Natur nur noch bei Pflanzen gibt. Das machte sie zu begehrten Objekten schon in der Jungsteinzeige für kultische Zwecke. In den marinen Ökosystemen halten sie auf Riffen das Algenwachstum unter Kontrolle, sie ermöglichen dadurch den Riffen zu wachseln. Zusätzlich produzieren sie kalkhaltige Ausscheidungen die die Riffe festigen.

Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse tragen aus dem Blickwinkel der Evolutionsbiologie zu unserem Verständnis der Regulation von Genexpression bei. Ich verwende einen bestens bekannten Modellorganismus, die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, nicht nur als Objekt der Beobachtung, sondern auch als ein genetisches Manipulationswerkzeug, und untersuche drei verschiedene Aspekte des Prozesses, durch den die in der DNA gespeicherte Information förmlich „entfesselt“ oder umgesetzt wird zu biologischem Sinn, letztlich also zu Form und Funktion. In Kapitel 1 zeige ich zunächst, dass eine Inaktivierung des X-Chromosomes (und somit Genregulation auf chromosomaler Ebene) in der männlichen Keimbahn von D. melanogaster stattfindet. Im Gegensatz zur X-Inaktivierung in weiblichen Säugetieren, wo dies in den somatischen Zellen als Mechanismus zur Dosiskompensation auftritt, ist diese Art der Inaktivierung auf die Spermatogenese beschränkt und wurde wahrscheinlich während der Genomevolution als eine Möglichkeit etabliert, schädliche Auswirkungen in Zusammenhang mit Sexualantagonismus zu umgehen. Durch P-Element-vermittelte Keimbahntransformation erhielt ich fast 50 unabhängige Insertionen eines testisspezifischen Reportergenkonstrukts und untersuchte die dazugehörigen Reportergenaktivitäten durch Messung der Enzymaktivität und durch quantitative RT-PCR. Autosomale Insertionen dieses Konstrukts zeigten das erwartete Muster hoher männchen- und testisspezifischer Expression. Insertionen auf dem X-Chromosom zeigten dagegen wenig bzw. gar keine Expression des Transgens. Da die X-chromosomalen Insertionen die euchromatischen Abschnitte des Chromosoms abdeckten (bestimmt durch inverse PCR), konnte eine systematische Bevorzugung bestimmter Regionen bei Insertionen, die ein Fehlen von Expression auf dem X-Chromosom hätte erklären können, ausgeschlossen werden. Der Effekt scheint eine globale Eigenschaft des X-Chromosomes zu sein. Lediglich die Testisspezifität des transgenen Konstrukts ist für das Erscheinen des Effekts erforderlich, was somit eine Selektionshypothese für die X-Inaktivierung erhärtet sowie einige Beobachtungen erklären könnte, die im Zusammenhang mit der Verteilung von im Männchen und Testis exprimierten Genen im Drosophila-Genom gemacht wurden. In Kapitel 2 untersuche ich dann mutmaßliche cis-regulatorische Sequenzen und ihr Vermögen, allelspezifische Genexpression zu steuern. Nachdem Microarray-Studien umfangreiche Variabilität im Primärmerkmal Genexpression in unterschiedlichsten Taxa aufgedeckt haben, ist eine naheliegende Frage, mit der sich Evolutionsbiologen konfrontiert sehen, die nach der dieser Variabilität zugrunde liegenden genetischen Quelle. Neben epigenetischen Mechanismen gibt es einen Disput darüber, ob regulatorische Sequenzen nahe des exprimierten Gens (cis-Faktoren) und anderswo im Genom kodierte Faktoren (trans-Faktoren) einen qualitativ und quantitativ unterschiedlichen Beitrag zur Variabilität der Genexpression liefern. Hierzu wählte ich ein Gen von D. melanogaster, das nachweislich konsistente Expressionsunterschiede zwischen afrikanischen und nicht-afrikanischen („kosmopolitischen“) Stämmen zeigt, und klonierte die entsprechenden stromaufwärts flankierend gelegenen Teile jeweils in ein bakterielles Reportergenkonstrukt, um – nach erfolgreicher Integration ins Fruchtfliegengenom – direkt die von ihnen gesteuerte Auswirkung auf die Genexpression zu vergleichen. Der beobachtete Effekt war klein, jedoch signifikant, und zeigte sich nur in transgenen Fliegen, die ein X-Chromosom des afrikanischen Ausgangsstammes besaßen. Dies legt den Schluss nahe, dass zusätzlich zu den cis-regulatorischen Faktoren auch noch trans-Faktoren (vor allem auf dem X-Chromosom) zu dem zwischen den Stämmen beobachteten Expressionsunterschied beitragen. Letztendlich untersuche ich in Kapitel 3 das Phänomen des Codon bias durch seinen Zusammenhang mit Genexpression. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes werden viele der proteinogenen Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert. Dies ermöglicht es, synonyme Codons in einer kodierenden Gensequenz auszutauschen, ohne dabei die Aminosäurensequenz des kodierten Polypeptids zu verändern. Ob dies Konsequenzen für die produzierte Proteinmenge hat (Translationseffizienz) ist Gegenstand dieses Kapitels. Ich verglich dabei die von zwei Allelen des Gens Alkoholdehydogenase (Adh) (von D. melanogaster) vermittelte Enzymaktivität direkt miteinander, welche sich in sieben Leucin-Codons unterschieden. Es ergab sich nahezu kein Unterschied in der ADH-Enzymaktivität, obwohl eines der Allele aus gänzlich optimalen Leucin-Codons bestand und das andere sieben suboptimale Leucin-Codons enthielt. Da Letzteres die Wildtypform von Adh war, legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass das Adh-Gen in seiner Leucin-Codonzusammensetzung (und vielleicht auch in seiner Codonzusammensetzung allgemein) bereits ausreichend optimiert ist. Weitere Versuche, die Zahl der optimalen Leucin-Codons zu erhöhen, können sogar einen Negativeffekt hinsichtlich der Enzymproduktion haben; dies möglicherweise aufgrund einer Sättigung des tRNA-Pools und/oder der Konsequenzen veränderter mRNA-Sekundärstrukturen.

Mon, 14 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9572/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9572/1/Ziemer_Petra.pdf Ziemer, Petra

Der Aufbau des Zellkerns und die höheren Organisationsmuster von Chromosomen gehorchen Regeln, die bisher in menschlichen Zellen und Zellen einiger Primaten bestätigt werden konnten. In dieser Arbeit sollte an einem anderen Säuger, der Maus, untersucht werden, in wie weit sich die bisher gewonnenen Erkenntnisse auch auf den molekularbiologisch intensiv studierten Modellorganismus der modernen Genomforschung übertragen lassen. Besonders interessant ist die Frage, weil der Karyotyp der Maus nur akrozentrische Chromosomen enthält und viel homogener in Bezug auf Chromosomengröße und Gendichte ist, als der Karyotyp des Menschen oder verschiedener Primaten. Die letzten gemeinsamen Vorfahren von Mäusen und Menschen lebten vor über 80 Mio. Jahren, in dieser Zeitspanne fanden die zahlreichen Veränderungen am Genom der Maus statt. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob Gemeinsamkeiten in Bezug auf die Organisation des Chromatins nachzuweisen sind und ob evolutionär konservierte Organisationsmuster zu finden sind. Die quantitative Untersuchung der Topologie von Chromosomenterritorien und Zentromerregionen erfolgte mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf Zellkernen von vier Zelltypen der Maus. Auf Kerne von Lymphozyten, Fibroblasten, ES-Zellen und Makrophagen wurden die Territorien von sechs Chromosomen mittels Chromosomen-Paint-Sonden hybridisiert. Das ausgewählte Chromosomenset enthielt genreiche, genarme, große und kleine Chromosomen in verschiedenen Kombinationen. Bilddaten wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen und einer digitalen quantitativen Bildanalyse unterzogen. In allen Mauszelltypen zeigten sich klare Korrelationen zwischen sowohl Gengehalt als auch Größe und radialer Verteilung von Chromosomenterritorien. Bei kugeligen Lymphozytenkernen korreliert die Gendichte stärker mit der radialen Verteilung als es die Chromosomengrößen tun. In Fibroblasten sind beide Korrelationen schwächer, aber nachweisbar, in ES-Zellen sind die Korrelationskoeffizienten wieder etwas höher und für beide Verteilungsmodelle gleich, in Makrophagen überwiegt die größenabhängige Verteilung der Chromosomenterritorien. Das genreichste Chromosom MMU 11 zeigt in den Lymphozyten die meisten Unterschiede zu anderen Chromosomenterritorien, während sich das genarme MMU X in den untersuchten männlichen ES Zellen durch seine extreme Randlage von den anderen unterscheidet. Innerhalb der Fibroblasten und Makrophagen gibt es vergleichsweise wenig signifikante Unterschiede zwischen den radialen Positionen der untersuchten Chromosomenterritorien. Zelltypspezifische Verlagerungen von Chromosomenterritorien zeigten sich auch nach einem Differenzierungsschritt von ES-Zellen zu Makrophagen. Die Lage der Chromozentren ist zelltypspezifisch. Im Gegensatz zu den untersuchten Chromosomenterritorien liegen die Chromozentren in Fibroblasten und Makrophagen in relativ zentralen Positionen. In Lymphozyten sind die Chromozentren am weitesten nach außen zum Zellkernrand gelangt, gefolgt von den ES-Zellen. Die Anzahl der Chromozentren ist ebenfalls zelltypspezifisch. Ausgehend von der Chromozentrenzahl in ES Zellen nimmt die Zahl der Chromozentren in differenzierteren Zellen zu (Lymphozyten, Fibroblasten) oder bleibt gleich (Makrophagen). Aufgrund der Ergebnisse lässt sich ausschließen, dass die äußere Form des Zellkerns alleine für die beobachteten Verteilungsunterschiede verantwortlich ist. Allerdings waren die beobachteten Unterschiede kleiner als bei vergleichbaren menschlichen Zelltypen. Mit ein Grund dafür ist sicher die geringere Variabilität der Chromosomengröße und Gendichte im Genom der Maus. Zellkernvolumina lagen zwischen 470 und 650 µm3. Lymphozyten besitzen im Durchschnitt die kleinsten Kerne der zyklierenden Zelltypen, ES-Zellen die größten. Makrophagen befanden sich in der G0-Phase, ihre Zellkerne waren am kleinsten und wiesen die geringste Standardabweichung auf. Die Analyse der Winkel und Abstände innerhalb der Chromosomenterritorien zeigte eine sehr flexible Positionierung innerhalb der Grenzen radialer Ordnungsprinzipien. Diese Resultate sind unvereinbar mit einem früher vorgeschlagenen Modell der Trennung des parentalen Genoms. Es gibt keine Hinweise für eine Abweichung von einer zufälligen Verteilung, von einer Häufung nahe beieinanderliegender MMU 1 Homologen in Makrophagen abgesehen. Zur Untersuchung der Struktur von Chromosomenterritorien wurden Programme angewandt, bei denen steigende Schwellwerte zu Zerfällen von Objekten führten, die analysiert wurden. Zwei unabgängige Methoden zur Berechnung von Objektzahlen in Bildstapeln führten zu gleichen Ergebnissen. Mit dem Programm OC-2 konnten Unterschiede in der Textur von Chromosomenterritorien bei der Maus innerhalb eines Zelltyps, als auch zwischen Zelltypen festgestellt werden. Dabei wurden die individuellen Chromosomengrößen mit berücksichtigt. Es konnte kein allgemeiner Zusammenhang zwischen den durchschnittlichen maximalen Objektzahlen und dem Gengehalt der entsprechenden Chromosomen festgestellt werden, vielmehr scheint die Textur des Chromatins von noch unbekannten, zelltypspezifischen Faktoren beeinflusst zu sein. Die Analyse der Chromatinstruktur in normalen menschlichen Zelltypen und in Tumorzelllinien mit dem Objektzählprogramm OC-2 ergab allgemein erhöhte Objektzahlen in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zelltypen. Davon unabhängig waren auch immer die genreichen HSA 19 durch höhere Objektzahlen charakterisiert als die etwas größeren genarmen HSA 18 in den selben Zell-typen. Vergleiche zwischen den Objektzahlen eines Chromosoms in normalen Zelltypen und Tumorzelllinien ergaben mehr Unterschiede, als Vergleiche nur innerhalb der normalen Zelltypen. Die hier untersuchten Tumorzelllinien weisen eine objektreichere Chromatinstruktur auf, als die ihnen gegenübergestellten normalen Zelltypen.

In der vorliegenden Dissertation untersuchten wir mit Hilfe des psychopathologischen Tiermodells der HAB- und LAB-Ratten, welche sich nicht nur bezüglich ihrer genetisch determinierten Emotionalität und ihrer Stressbewältigungsstrategien, sondern auch hinsichtlich der Reaktivität der HPA-Achse unterscheiden, Effekte des Serotonin-Wiederaufnahmehemmers Paroxetin und von rTMS auf Verhalten und die neuroendokrine Regulation. Mit Hilfe des kombinierten DEX/CRH-Tests gelang es uns nachzuweisen, dass sich ein hohes Maß an angeborenem Angstverhalten in einer profunden Fehlregulation des Stresshormonsystems widerspiegelt. HAB-Tiere zeigten nach Verabreichung von Dexamethason einen verminderten Suppressionseffekt und die periphere Injektion von CRH führte zu einem deutlichen Anstieg der Plasmakonzentrationen von ACTH und Kortikosteron. Hierfür scheint intrahypothalamisch überexprimiertes und sezerniertes AVP verantwortlich zu sein, folglich führte auch die periphere Verabreichung eines V1-Rezeptorantagonisten zu einer Normalisierung des bei HAB-Tieren dysregulierten HPA-Systems im DEX/CRH-Test. Bindungskapazität und Bindungsaffinität von Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren unterschieden sich nicht zwischen den Zuchtlinien, so dass die durch Kortikosteron vermittelte Feedbackregulation des HPA-Systems auf der Ebene der intrazellulären Signalkaskade gestört zu sein scheint. Die mehrwöchige Behandlung mit dem selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Paroxetin induzierte bei HAB-Tieren nicht nur eine durch die Verminderung der intrahypothalamischen AVP-Genexpression vermittelte Normalisierung des dysregulierten Hormonfreisetzungsprofiles im DEX/CRH-Test, sondern auch profunde Verhaltensänderungen im Forced Swim-Test, der als guter Prädiktor für die klinische Wirksamkeit einer antidepressiven Therapie angesehen wird. HAB-Tiere, welche eine passive Stressbewältigungsstrategie im Forced Swim-Test zeigen, struggelten nach Behandlung mit Paroxetin signifikant länger und verbrachten signifikant weniger Zeit mit Floating als unbehandelte HAB-Kontrolltiere. Sie waren in ihrem Verhalten von LAB-Tieren, auf die die Behandlung mit Paroxetin keinen Einfluss hatte, nicht mehr zu unterscheiden. Mit Hilfe von in vivo Mikrodialyse untersuchten wir den Einfluss von chronisch verabreichtem Paroxetin auf die stressinduzierte Freisetzung von Serotonin im dorsalen Hippocampus. Bei HAB-Tieren, welche eine angeborene verminderte Empfindlichkeit der raphé-hippocampalen Neurotransmission zeigen und den bei LAB-Tieren zu beobachtenden stressinduzierten Anstieg der Serotoninfreisetzung vermissen lassen, führte die Behandlung zu einer Normalisierung der serotonergen Neurotransmission. Dieser Effekt könnte mit der gezeigten Verminderung von SERT-Bindungsstellen im Hippocampus bei HAB- im Vergleich zu LAB-Tieren zusammenhängen, während die Expression von 5-HT1A-Rezeptoren in dieser Hirnregion unbeeinflusst blieb. Somit konnten wir erstmals zeigen, dass eine Normalisierung der Stresshormonregulation durch Paroxetin mit einem Anstieg der stressinduzierten Freisetzung von Serotonin im Hippocampus assoziiert ist. Dass rTMS der linken frontalen Hirnregionen antidepressive Effekte hat, konnte bereits in mehreren klinischen Untersuchungen an Patienten, die an Major Depression leiden, beobachtet werden. Unsere im psychopathologischen Modellorganismus der HAB/LAB-Tiere nach Langzeitbehandlung mit rTMS erzielten Ergebnisse gewähren neue Einblicke in die der antidepressiven Wirkung zugrundeliegenden neurobiologischen Mechanismen. Wie auch die Behandlung mit Paroxetin, wandelte rTMS die angeborene passive Stressbewältigungsstrategie der HAB-Tiere in eine signifikant aktivere Stressbewältigungsstragie im Forced Swim-Test um und dämpfte die endokrine Stressantwort der HPA-Achse. Die frontalen Hirnregionen partizipieren durch efferente Projektionen zum perinukleären Bereich des PVN an der Regulation der neuroendokrinen Reaktion auf Stressstimuli und kann die Synthese und Freisetzung von CRH und somit die Antwort des HPA-Systems hemmen. Wir konnten ebenfalls zeigen, dass rTMS auch während chronischem psychosozialem Stress eine dämpfende Wirkung auf die basale Aktivität der HPA-Achse hat. Allerdings ließ sich kein anregender Effekt auf die Neurogenese im Hippocampus nachweisen: rTMS erhöhte zwar leicht die Proliferationsrate hippocampaler Vorläuferzellen, verminderte jedoch die Überlebensrate BrDU-markierter Neurone. Daher scheinen andere Faktoren, neben den Glukokortikoiden, eine mindestens genauso große Rolle bei der Regulation der Anzahl und der Ausreifung der Vorläuferzellen im Hippocampus zu spielen. Wir folgern daraus, dass die Dämpfung des HPA-System wahrscheinlich ein wichtiger, der klinisch beobachteten antidepressiven Wirkung von rTMS zugrundeliegender Mechanismus ist, es mit unserem experimentellen Design jedoch nicht gelang, einen stimulierenden Effekt von rTMS auf die Neurogenese im adulten Hippocampus nachzuweisen.

Monoklonale Antikörper sind unverzichtbare Hilfsmittel, um Proteinkomplexe aus Zellen zu isolieren oder Proteine in Gewebeschnitten zu lokalisieren. Sie dienen auch dazu, Entwicklungsvorgänge aufzuklären. Dabei wird als Modellorganismus für Vertebraten oft der Zebrafisch gewählt, da er sich asaisonal vermehrt, eine zahlreiche Nachkommenschaft hat und sowohl die Befruchtung als auch die Entwicklung außerhalb des Mutterleibs erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper generiert, die spezifisch mit neuronalen Geweben und Organen des Zebrafisches reagieren. Zur Immunisierung wurde Gehirngewebe des Zebrafisches verwendet. Immunisiert wurden Ratten. Antikörperbildende B-Zellen aus der Ratte wurden mit einer Mausmyelom-Zelllinie fusioniert. Proteine von Interesse wurden mit Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des Zebrafisch-Gehirns immunpräzipitiert und durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die durch Antikörper detektierbaren Banden wurden ausgeschnitten und die enthaltenen Proteine mit massenspektrometrischen Techniken identifiziert. In einem weiteren Ansatz diente eine in λ-Phagen einklonierte Genbank der Expression der Proteine. Die Proteine wurden ebenfalls mit monoklonalen Antikörpern identifiziert. Die Phagen, die diese Proteine produzierten, wurden vermehrt und die für das Protein kodierende DNA sequenziert. Wir haben unsere Anstrengungen vor allem auf Proteine neuronalen Ursprungs konzentriert, weil diese Strukturen in den Fischen besonders deutlich markiert wurden. Histologische Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass die Antikörper mit neuronalen Strukturen vieler Spezies reagierten, was auf eine hohe Konservierung der Proteine in der Phylogenese schließen lässt. Aus drei Fusionen mit Milzzellen von immunisierten Ratten wurden 2400 Zellüberstände erzeugt, die auf ihre Immunglobulin-Subklasse getestet wurden. IgG-positive Überstände wurden auf histologischen Schnitten untersucht. Schließlich wurden 17 Klone etabliert, die mit Nervengewebe des Zebrafisches reagierten, und weitere 9 Klone, die sowohl mit neuronalen Zellen des Zebrafisches als auch mit neuronalem Gewebe anderer Spezies reagierten. Die von den einzelnen Antikörpern erkannten Proteine wurden entweder massenspektrometrisch oder mittels einer Expressionsgenbank, die aus drei Tage alten Zebrafischlarven hergestellt wurde, identifiziert. Es wurden Antikörper gegen folgende Proteine gefunden: 1. Tenascin R 2. Plasticin 3. TOPAP 4. VAT-1 Es wurden 16 monoklonale Antikörper, die gegen fünf verschiedene humane Antigene hergestellt worden waren, auf Kreuzreaktivität mit Zebrafischgehirn getestet. Die Antikörper reagierten sowohl mit dem Hirn des Zebrafisches als auch mit dem Hirn acht verschiedener Säugerspezies. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Versuch unternommen, gezielt gegen ein Fusionskonstrukt, das Teile des humanen Parkins enthielt, monoklonale Antikörper herzustellen. Aus vier Fusionen wurden nur drei spezifisch mit dem Antigen reagierende Antikörper selektiert, die auch im Western-Blot mit Parkin reagierten. In vivo wurde das Antigen in histologischen Schnitten jedoch nicht erkannt.

BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi-Netzwerks und ein strukturell neuartiges Ubiquitin-Konjugationsenzym (UBC) der Maus. Zusätzlich zu der am C-Terminus befindlichen UBC-Domäne enthält BRUCE im N-terminalen Bereich ein BIR (baculovirus inhibitor of apoptosis repeat)-Motiv, die charakteristische Domäne aller BIRPs (BIR-domain containing proteins). Die meisten dieser Proteine haben anti-apoptotische Eigenschaften und werden deshalb in der IAP (inhibitor of apoptosis proteins)-Familie zusammengefasst. Auch BRUCE konnte in vitro als Inhibitor apoptotischer Prozesse beschrieben werden. Um die Funktion von BRUCE in vivo zu untersuchen, wurde eine BRUCE-defiziente Mauslinie etabliert und im Rahmen dieser Arbeit phänotypisch charakterisiert. Die vollständige Inaktivierung des BRUCE-Gens führte zu einer Verzögerung des embryonalen Wachstums sowie zum perinatalen Tod der Knockout-Organismen. BRUCE wird in fast allen embryonalen Geweben exprimiert, deutlich sichtbare morphologische Veränderungen in Folge seiner Deletion traten jedoch hauptsächlich im extra-embryonalen Gewebe der Plazenta auf. Nach störungs-freier Initiierung der Organogenese zeigte sich mit zunehmender Reifung der Plazenta eine Verzögerung der Ausbildung des Labyrinthsystems sowie eine deutliche Reduktion der Spongiotrophoblast-Schicht. Dieses Entwicklungsdefizit kann Ursache einer stark eingeschränkten Effizienz der Nähr- und Sauerstoffversorgung des Embryos sein und sowohl zu Wachstumsretardierung als auch zu perinataler Letalität der transgenen Organismen führen. Die morphologischen Veränderungen im Gewebe wurden nicht, wie ursprünglich angenommen, durch eine erhöhte Apoptoserate der Zellen hervorgerufen. Stattdessen konnten in den defekten plazentalen Geweben drastische Veränderungen in Proliferationsverhalten und Differenzierungsstatus der Trophoblast-Zellen beobachtet werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Auswirkungen des BRUCE-Verlusts auf den Modellorganismus zeigen einerseits die essentielle Bedeutung von BRUCE für die Entwicklung sowie den funktionellen Erhalt der Plazenta und damit für die gesamte Embryonalentwicklung der Maus. Andererseits geben die Ergebnisse Hinweise darauf, dass dieses ungewöhnliche Enzym möglicherweise eine überlebensnotwendige regulative Funktion der Inhibition Apoptose-induzierter oder nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität bei Proliferations- und/oder Differenzierungs-ereignissen bestimmter Zelltypen besitzt.

Die Organisation der DNA in Nukleosomen hat einen großen Einfluss auf die Regulation von grundliegenden Prozessen wie Transkription, Replikation oder Reparatur der DNA im Zellkern. Um die hinderliche Natur des Chromatins bei diesen fundamentalen Prozessen zu überwinden, existieren mehrere verschiedene Chromatin modifizierende Proteinkomplexe im Zellkern. Chromatin Remodelling Komplexe nützen die Energie der ATP-Hydrolyse um die Position der Nukleosomen so zu verändern, dass verschiedene Abschnitte der DNA für die Interaktion mit regulierenden Faktoren zugänglich werden. Ein Klasse solcher Remodelling Faktoren beinhalten die ATPase ISWI als katalytische Untereinheit. Das Protein wurde zuerst in Drosophila entdeckt und die drei verschiedenen ISWI enthaltenden Komplexe, nämlich NURF, ACF und CHRAC, wurden ausführlich in diesem Modellorganismus untersucht. Homolog zur Fruchtfliege existieren sehr ähnliche Protein Komplexe beim Menschen. Wir haben das humane ISWI mit den Isoformen Snf2h und Snf2L im Prostatakarzinom untersucht. In einem Tissue Microarray wurden Gewebeproben mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern gegen ISWI gefärbt. Es folgte ein quantitativer Vergleich der Färbungsintensitäten im Karzinomgewebe sowie in gutartigem Gewebe der Prostata durch Anwendung von digitaler Bildanalyse. Das Ergebnis war eine signifikant stärkere Färbung im neoplastischen Gewebe. Eine Anreicherung von ISWI in Krebszellen ist besonders interessant im Kontext der bekannten Funktionen des Proteins für DNA-Replikation, Zellproliferation und Regulation der Chromatinstruktur. In einem zweiten Projekt sind wir zum Modell der Fruchtfliege zurückgekehrt und entwickelten monoklonale Antikörper gegen Toutatis, das zu einer Proteinfamilie gehört, die auch einige bekannte Interaktionspartner von ISWI umfasst. Die Proteine dieser Familie haben vermutlich eine regulatorische Funktion in den Remodelling Komplexen, denn am Beispiel von Acf1 wurde gezeigt, dass sie die nukleosomale Bindung sowie die Effizienz und Richtung der Mobilisierung von Nukleosomen modifizieren. Unsere Antikörper wurden etabliert, um Toutatis enthaltende Komplexe durch Western Blot Analyse von gereinigten Drosophila-Extrakten und Immunfluoreszenz zu charakterisieren. Mit diesen Methoden fanden wir eine Koelution von Toutatis mit der ATPase Brahma und dem Strukturprotein Spectrin alpha sowie eine Lokalisation in der Lamina des Zellkerns. Ein mögliches Zusammenspiel dieser Proteine in einem neuen Chromatin Remodelling Komplex mit einer Beteiligung an der DNA-Reparatur wird diskutiert.

Mitochondrien sind sehr dynamische Organellen, die sich fortwährend teilen und miteinander fusionieren. Fusion und Teilung spielen eine wichtige Rolle für den Aufbau der mitochondrialen Struktur und den Erhalt mitochondrialer Funktionen. Darüber hinaus sind diese Prozesse bedeutsam bei der zellulären Alterung, Apoptose und Zelldifferenzierung. Die ersten molekularen Komponenten der Fusions- und Teilungsmaschinerie wurden in den letzten Jahren in der Bäckerhefe S. cerevisiae als Modellorganismus identifiziert. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung neuer Komponenten und deren funktionelle Charakterisierung in Hefe.

Morphologie und Dynamik der Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Vererbung der Organellen und die korrekte Ausübung ihrer physiologischen Pflichten. Über die molekularen Mechanismen, die der Gestaltgebung und Dynamik der Mitochondrien zugrunde liegen, ist relativ wenig bekannt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus wurden einige Proteine identifiziert – das Verständnis vieler Prozesse, wie z. B. Fusion, Teilung und Bewegung der Mitochondrien, stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung für die zellbiologische Forschung dar. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein innovativer Ansatz verfolgt, um neue mitochondriale Morphologiekomponenten in S. cerevisiae zu identifizieren. Dabei wurde eine Stammsammlung verwendet, die Deletionsmutanten sämtlicher nicht-essentieller Hefegene enthält. Diese Stämme wurden systematisch durch Fluoreszenzmikroskopie nach Mutanten durchsucht, die eine veränderte mitochondriale Morphologie aufweisen. Dadurch konnte die Anzahl der bekannten Proteine, die einen Einfluss auf die mitochondriale Morphogenese besitzen, von bis dato neun auf 24 erhöht werden. Fünf der neuen Komponenten, von denen zehn bislang gänzlich uncharakterisiert waren, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit entdeckt. Für eine eingehende Analyse im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden die beiden neuentdeckten Proteine Mdm31 und Mdm32 ausgewählt. Diese beiden Proteine sind Mitglieder einer neuen Proteinfamilie und liegen als höhermolekulare Proteinkomplexe in der mitochondrialen Innenmembran vor, die transient miteinander interagieren. Die Topologie von Mdm31 und Mdm32, deren Hauptteil im Intermembranraum liegt, ist ein Hinweis auf eine mögliche Kooperation der beiden Proteine mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran. Deletionsmutanten von MDM31 und MDM32 weisen sphärische Riesenmitochondrien auf, deren Motilität drastisch reduziert ist. Durch diesen Motilitätsdefekt kommt es zu einem verringerten Transport der Mitochondrien in die Tochterzellen bei der Zytokinese. Darüber hinaus ist das mitochondriale Genom in Δmdm31- und Δmdm32-Stämmen instabil und geht nach längerem Wachstum auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen in einem Teil der Zellen verloren. Ferner ist die Struktur der Nukleoide, in denen die mitochondriale DNA verpackt ist, in diesen Stämmen verändert. Während man in Wildtyp-Zellen 10-15 Nukleoide beobachtet, weisen die Mitochondrien der Deletionsstämme ein oder zwei riesige diffuse DNA-Stukturen auf. Diese strukturellen Veränderungen der Mitochondrien und das Verhalten des mitochondrialen Genoms in den Δmdm31- und Δmdm32-Deletionsmutanten weisen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen die Außenmembranproteine Mmm1, Mdm10, Mdm12 oder Mmm2 fehlen. Die Deletion von MDM31 oder MDM32 in Kombination mit MMM1, MDM10, MDM12 oder MMM2 ist synthetisch letal, d. h. die Doppelmutanten sind nicht lebensfähig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beteiligten Komponenten eine Funktion in demselben zellulären Prozess spielen. Wahrscheinlich führt die Addition der Effekte, die die Einzeldeletionen auf die Struktur und Motilität der Mitochondrien haben, zur kompletten Hemmung der Vererbung der Organellen. Damit sind Mdm31 und Mdm32 die ersten mitochondrialen Innenmembranproteine, für die ein funktioneller Zusammenhang mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran bei der Vererbung und strukturellen Integrität der Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner sind sie die ersten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die Einfluss auf die Struktur und Stabilität des mitochondrialen Genoms nehmen.

Die Entstehung struktureller Chromosomenaberrationen in somatischen Zellen ist von besonderem biologischem Interesse, da Aberrationen mit Tumorgenese in Verbindung gebracht werden. Wie wir heute wissen, sind strukturelle Chromosomenaberrationen die Folge fehlerhafter Doppelstrangbruch (DSB)-Reparatur, wobei im einfachsten Fall die Enden von zwei (oder mehr) Bruchstellen durch so genannte nichthomologe Endverknüpfung in falscher Kombination verknüpft werden. Bis heute ist jedoch unklar, inwieweit die Kernarchitektur - das heißt die Positionierung der Chromosomen im Zellkern - die Wahrscheinlichkeit einer Aberrationsentstehung beeinflusst. Um Hinweise über den Einfluss der Kernarchitektur auf die Entstehung von Austausch-aberrationen zu gewinnen, bietet es sich an, Untersuchungen in einem Modellorganismus mit vergleichbar geringer Komplexität durchzuführen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist dazu sehr geeignet, da die Kernarchitektur in diesem Organismus recht gut charakterisiert ist. Die Interphasechromosomen der Hefe nehmen eine Rabl-ähnliche Konfiguration ein, bei der alle Zentromere in der Nähe der Zellkernperipherie in einer Rosettenstruktur als cluster angeordnet sind, und die in mehreren clustern vorliegenden Telomere präferentiell am gegenüberliegenden Pol an der Kernmembran verankert sind. Die Wahrscheinlichkeit interchromosomaler Interaktionen sollte daher im Bereich der Zentromere und Telomere am höchsten sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Zellkernarchitektur auf die Aberrations-entstehung in zwei unterschiedlichen experimentellen Ansätzen in Hefe untersucht. Im ersten Ansatz wurde eine Kartierung von Translokations-Bruchpunkten durchgeführt, um anhand des Verteilungsmusters Aussagen über die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Austausch-aberrationen machen zu können. Dazu stand aus Vorarbeiten eine Kollektion von 16 Klonen Rekombinations-defizienter Hefestämme (rad52- bzw. rad54-Mutanten) zur Verfügung, die strahleninduzierte strukturelle Chromosomenaberrationen tragen (mit insgesamt 35 beteiligten Chromosomen). Die Chromosomen V und VIII waren bei diesen Klonen an der Ausbildung strahleninduzierter Aberrationen häufiger beteiligt, als aufgrund ihrer Länge zu erwarten war, ohne dass hierfür ein Grund ausgemacht werden konnte. Die Bruchpunkte auf den Chromosomen V und VIII, sowie ihren jeweiligen Translokationspartnern, wurden mit Hilfe zwei verschiedener Methoden kartiert, die jeweils auf den Nachweis der An- und Abwesenheit spezifischer Sequenzbereiche (Sonden) auf den aberranten chromosomalen Banden abzielten. Dabei zeigte sich, dass von den insgesamt 17 kartierten Bruchpunkten sieben Zentromer-nah (bis zu 100 kb vom Zentromer entfernt), drei Telomer-nah (bis zu 12 kb vom Telomer entfernt) und sieben in der interstitiellen Region liegen. Bruchpunkte in der interstitiellen Region zeigten sich also signifikant unterrepräsentiert, so dass hier auf einen Einfluss der Zellkernarchitektur auf die Aberrationsentstehung zu schließen ist. Im zweiten experimentellen Ansatz wurde ein Modellsystem in Hefe entwickelt, mit dem sich der Einfluss der initialen Position von DSB auf die Entstehungswahrscheinlichkeit inter-chromosomaler Fehlverknüpfung systematisch untersuchen lässt. Dazu wurde eine Serie von Hefestämmen hergestellt, in denen gleichzeitig jeweils zwei DSB enzymatisch mittels HO-Endonuklease induziert werden können. Die entsprechenden Enzymschnittstellen (HOcs) wurden dabei an verschiedenen chromosomalen Positionen eingesetzt, die aufgrund ihrer Entfernung zu Zentromer und/oder Telomer im Falle eines Kernarchitektureinflusses unterschiedliche Interaktionswahrscheinlichkeiten haben sollten. Nach DSB-Induktion sowie Reparatur wurde mittels PCR-Analyse untersucht, wie häufig es in den einzelnen Stämme im Zuge der Reparatur zu einer Fehlverknüpfung der Enden gekommen war. Dabei konnte gezeigt werden, dass die intra- und intermolekulare Verknüpfung bei der Reparatur in allen getesteten Bruchort-Konstellationen etwa gleich häufig war, d.h. es wurde kein Einfluss der Kernarchitektur auf die Aberrationsentstehung festgestellt. Dieses Ergebnis passt gut zu Befunden einer neueren Arbeit, in der gezeigt werden konnte, dass sich nach Induktion multipler DSB nur wenige RAD52-Foci im Zellkern bilden, die als Reparaturzentren/ „-fabriken“ erklärt werden. Entsprechend diesem Modell können damit auch initial weiter voneinander entfernte DSB zu Austauschaberrationen führen, da die jeweiligen Enden in den wenigen „Fabriken“ zusammentreffen können. Als Ursache für die in beiden Systemen erzielten unterschiedlichen Ergebnisse könnten also entweder die unterschiedlichen genetischen Hintergründe (Rekombinations-defizient im Vergleich zu Rekombinations-profizient) oder die unterschiedliche Struktur der Bruchenden (strahlen-induziert im Vergleich zu Endonuklease-induziert) in Betracht kommen.