Podcasts about endozytose

Folge 012 - Was sind Endocytose und Exocytose? Show Notes: Bitte unterstützt den Biologie Passion Podcast finanziell ➤ paypal.me/biologiepassionpdcst Hier gehts zum zugehörigen Blogartikel auf meiner Webseite. Wenn dir die Podcastfolge gefallen hat, würde mich eine kurze Bewertung auf iTunes freuen. Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst. Vielen Dank fürs Zuhören!

Die Familie A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und vielfältigste aller Transmembranrezeptorfamilien. Ihre Mitglieder spielen eine wesentliche Rolle in fast allen (patho)physiologischen Prozessen. Nach Agonistenbindung aktivieren GPCRs, wie ihr Name andeutet, heterotrimere G-Proteine aber auch G-Protein-unabhängige Signalwege. Die verschiedenen aktiven G-Proteinuntereinheiten (Gα-GTP und βγ) induzieren nach Dissoziation vom Rezeptor entsprechende Signalkaskaden z.B. über Phospholipase A und Cβ. Um eine Fehlregulation zellulärer Prozesse z.B. durch „Überstimulation“ zu verhindern, unterliegen GPCRs strengen Regulationsmechanismen, die ihre Fähigkeit zur Signaltransduktion und ihre Verfügbarkeit an der Zelloberfläche bestimmen. Die Bradykininrezeptoren B1 und B2 (B1R, B2R) gehören zur Familie A der GPCRs, also zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, und werden durch die pro-inflammatorischen Peptide desArg9-Bradykinin/desArg10-Kallidin (DABK/DAK) bzw. Bradykinin (BK)/Kallidin aktiviert. Im Gegensatz zum konstitutiv exprimierten B2R, der nach Stimulation schnell desensitisiert und internalisiert wird, erfolgt eine B1R-Expression fast ausschließlich unter pathophysiologischen Bedingungen über Induktion durch Zytokine. Nach Stimulation wird der B1R nicht internalisiert, sondern verbleibt an der Zelloberfläche. Beide Rezeptoren koppeln sowohl an Gαq/11 als auch an Gαi und aktivieren somit weitgehend identische Signalwege [vor allem Phospholipase Cβ (PLCβ) und „mitogen activated protein kinase“ (MAPK)-Kaskaden]. Durch ihre - besonders im Hinblick auf ihre Internalisierungs-eigenschaften - konträre Regulation, stellen die Bradykininrezeptoren ein interessantes Modell zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen und deren Einflüsse auf die Signalübertragung von GPCRs dar. Beide Bradykininrezeptoren spielen bei inflammatorischen Prozessen eine Rolle. Sie fördern die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine und rekrutieren Immunzellen. Während entzündlicher Ereignisse kommt es zu erhöhter Zytokinfreisetzung z.B. von Interleukin-1β (IL-1β) und dadurch zur de novo Synthese von B1R. Pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, die zur B1R-Expression führen, induzieren unter anderem aber auch einen Anstieg der Körpertemperatur (Fieber), eine häufige Begleiterscheinung inflammatorischer Vorgänge. Trotz des bekannten Zusammenhangs zwischen Inflammation und erhöhter Temperatur war über den Einfluss eines Temperaturanstiegs auf Membranrezeptoren und ihre Signalvermittlung auf zellulärer Ebene bisher nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde - unseres Wissens nach - erstmals auf die Temperatur als regulatorische Komponente für GPCR-vermittelte Signalübertragung eingegangen. Am Beispiel der Bradykininrezeptoren wurde gezeigt, dass die Stärke der Signalübertragung von GPCRs signifikant durch eine Temperaturerhöhung von 37°C auf 41°C beeinflusst werden kann. Hierbei war jedoch zwischen einer Temperaturabhängigkeit des Signalwegs selbst und einer rezeptorspezifischen Temperatursensitivität zu unterscheiden. So wurde die Aktivierung von ERK1/2 unter pathophysiologisch erhöhter Temperatur (41°C; normale Körpertemperatur: 37°C) signifikant gesteigert, unabhängig davon ob sie durch B1 oder B2 Rezeptoren stimuliert wurde. Die gesteigerte Aktivität PLCβ-vermittelter Signalkaskaden bei 41°C konnte hingegen auf eine nur für den B1R spezifische Temperaturabhängigkeit zurückgeführt werden. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass die B1R-Expression unter pathophysiologischen Bedingungen besonders induziert wird, deutet darauf hin, dass der B1R in Kombination mit Fieber eine verstärkte Wirkung im Organismus haben könnte. Ob diese Heilungs-fördernd oder -abträglich wirkt, müsste noch genauer untersucht werden. Neben dem Einfluss der Temperatur wird die Signalübertragung der GPCRs durch die jeweiligen Rezeptorkonformationen und die sich daraus ergebenden Funktionsunterschiede bestimmt. Die Familie A der GPCRs wird durch einige hoch konservierte Strukturmerkmale wie die E/DRY-Sequenz mit R3.50 in der dritten Transmembrandomäne (TM) oder die NPXXY-Sequenz am Ende der siebten TM charakterisiert. Publizierte Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovines Rhodopsin durch eine Salzbrücke zwischen R3.50135 (TM3) und E6.30247 (TM6), auch „ionic lock“ genannt, im inaktiven Zustand gehalten wird. Der B2R ist einer der wenigen Peptid-GPCRs, der ein Glutamat an Position 6.30 (E6.30238) trägt, und eignete sich daher zur Untersuchung der Anwesenheit und Funktion eines möglichen „ionic lock“ auch in „nicht-Rhodopsin“-GPCRs. Für alle bisher entsprechend untersuchten GPCRs ist bekannt, dass R3.50 für eine effiziente G-Protein-Aktivierung unabdingbar ist (selbiges wurde in der vorliegenden Arbeit auch für den B2R bestätigt). Die funktionelle Analyse eines „ionic lock“ anhand einer R3.50 Mutation und G-Protein-abhängiger Kaskaden ist deshalb nicht möglich. Die Rolle eines „ionic lock“ im Hinblick auf G-Protein-unabhängige Mechanismen wie die Rezeptorinternalisierung, einem wichtigen Regulationsschritt für die meisten GPCRs, wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass die Rezeptorendozytose durch Mutation von R3.50128 zu Alanin (R3.50128A), im Gegensatz zur G-Protein-Aktivierung, nicht zum Erliegen kommt. Die mutierten Rezeptorkonstrukte wiesen sogar ein konstitutives Internalisierungsverhalten auf. Dies verwies auf unterschiedliche Funktionen dieser Aminosäure bei der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und bei der Rezeptorinternalisierung. Ein Aufbrechen des möglichen „ionic lock“ durch Mutation von E6.30238 zu Alanin oder Arginin resultierte ebenfalls in konstitutiv internalisierenden Rezeptorkonstrukten. Im Gegensatz zur Endozytose zeigten diese Mutanten zwar keine konstitutive Signalübertragung, wurden aber auch durch prinzipiell als Antagonisten klassifizierte Verbindungen effizient aktiviert. Diese Ergebnisse legen einen mehrstufigen Aktivierungsprozess nahe, dessen Stufen sich durch verschiedene Rezeptorkonformationen mit unterschiedlichen Interaktionsmöglichkeiten für die G-Protein-Rekrutierung/Aktivierung oder mit der Internalisierungsmaschinerie [GPCR-Kinasen (GRKs), Arrestine] auszeichnen. Der wechselseitige Austausch der beiden hoch konservierten Aminosäuren R3.50128 und E6.30238 ermöglichte wahrscheinlich die Bildung eines inversen „ionic lock“, wodurch normales B2R-Verhalten wieder hergestellt wurde. Diese Arbeit zeigt somit erstmals, dass ein Aufbrechen eines möglichen „ionic lock“ in einem Peptidrezeptor unterschiedliche Auswirkungen für die Prozesse der G-Protein-Aktivierung und der Rezeptorendozytose haben kann. Dadurch wird die Annahme bestärkt, dass es bei einem GPCR mehrere aktive Konformationen geben kann, die unterschiedliche Affinitäten gegenüber regulatorischen Proteinen (GRKs, Arrestinen) oder Effektoren (G-Proteinen, Arrestinen) aufweisen und dadurch differenziert zelluläre Signale auslösen können. Die Aufklärung der unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von GPCRs in Kombination mit der Herstellung von Verbindungen z.B. sogenannten „small molecule compounds“, die bestimmte Rezeptorkonformationen mit ihren signalspezifischen Eigenschaften stabilisieren können, wäre möglicherweise für die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten, die nur ganz bestimmte Signalwege modulieren und so eine optimierte therapeutische Anwendung erlauben, hilfreich.

Eine Glomerulonephritis kann durch eine virale Infektion verschlechtert werden, sie kann aber auch erst durch diese entstehen. Die Erkennung der viralen Bestandteile erfolgt über Pathogenerkennungsrezeptoren, wie beispielweise Toll-like Rezeptoren und RIG-like Rezeptoren. Die Hypothese der vorliegenden experimentellen Arbeit war, dass die nierenspezifischen Podozyten Pathogenerkennungsrezeptoren besitzen, die pathogen-assoziierte molekulare Muster erkennen und daraus Zytokine und antivirale Typ-I Interferone produzieren. Hierbei könnten Podozyten zu der Entstehung bzw. Veschlechterung einer virusassoziierten Glomerulonephritis beitragen. Murine Podozyten exprimieren, mit Ausnahme des Toll-like Rezeptors 8, alle bis dato bekannten Toll-like Rezeptoren (TLR-1 bis -11) in verschiedener Ausprägung. Sie exprimieren außerdem die zytosolische Rezeptoren RIG-1, MDA-5, DAI sowie deren Adaptermolekül IPS-1. Die Aktivierung dieser Rezeptoren verursacht die Produktion von Zytokinen und Typ-I Interferonen. Um die intrazelluläre Aufnahme der Nukleinsäuren zu gewährleisten, wurden diese mit kationischen Lipiden komplexiert. Dieser Vorgang wurde durch Cytochalasin D, Chlorpromazin und Methyl-β-Cyclodextrin unterbrochen. Daraufhin ergeben sich die Phagozytose, die Clathrin-abhängige Endozytose und die Caveolae-vermittelte Endozytose als mögliche Transportmechanismen. Das Adaptorprotein MyD88 zeigte bei Podozyten keine Bedeutung für die Nukleinsäureaufnahme in die Zelle zu besitzen. Die Stimulation von Podozyten mit Typ-I Interferonen veranlasste die Produktion von großen Mengen an Interleukin-6 und führte zu einer starken Expression von Pathogenerkennungsrezeptoren sowie proinflammatorischen Zytokinen auf Transkriptionsebene. Eine autokrin-parakrine Aktivierung der Podozyten durch ausgeschüttete Typ-I Interferone konnten wir ausschließen. Weder die Durchlässigkeit für Albumin noch die Viabilität der Zellen wurde durch die Aktivierung von Pathogenerkennungsrezeptoren beeinflusst. Eine Funktionseinschränkung der Podozyten nach Stimulation der TLRs oder RLRs im Sinne eines direkten Einflusses auf die Permeabilität oder die Fußfortsatzzahl fand sich nicht, jedoch zeigten Podozyten eine vermehrte Zytokinproduktion, was zur glomerulären Entzündung bei viraler Glomerulonephritis beitragen könnte.

Tue, 4 Nov 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9596/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9596/1/Neumann_Stephanie.pdf Neumann, Stephanie ddc:570, ddc:500, Fa

Die Familie der Sorting Nexine (SNX) umfasst 33 bekannte Mitglieder, jedoch ist der Funktionsmechanismus vieler Sorting Nexine bislang nicht aufgeklärt. Auf der Suche neuer Modulatoren der βAPP-Proteolyse konnte im Rahmen eines Expressionsklonierungs-Screens (Schobel et al., 2006) ein bislang nicht beschriebenes Protein, Sorting Nexin 33 (SNX33), als Aktivator der βAPP-Proteolyse identifiziert werden. SNX33 ist ein phosphoryliertes Protein, das ubiquitär exprimiert wird und zudem eine hohe Homologie zu den Proteinen SNX9 und SNX18 aufweist. SNX33 ist im Zytosol lokalisiert, kann jedoch auch Membran-assoziiert vorliegen. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von SNX33 zu einer Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose und in Folge dessen zu einer etwa 50% -igen Reduktion der βAPP-Endozytose führt. Die von SNX33 induzierte Endozytosehemmung wird durch die SH3-Domäne des Proteins vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführte Koimmunpräzipitationsstudien zeigten, dass SNX33 mittels seiner SH3-Domäne mit Dynamin interagiert und auf diese Weise möglicherweise dessen Funktion moduliert. In Übereinstimmung mit den durchgeführten Zellkultur-Experimenten führte eine Überexpression von SNX33 im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ebenfalls zu einem Dynamin-Funktionsverlust. Da SNX33 Expression zu einer generellen Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose führt, handelt es sich dabei nicht um einen spezifischen βAPP-Modulator. Konsequenz einer reduzierten βAPP-Internalisierung ist eine starke Zunahme der neurotrophen sAPPα-Bildung sowie - je nach verwendeter Zelllinie - ein leichter Anstieg bzw. eine geringe Reduktion der pathogenen sAPPβ-Generierung. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression der homologen Proteine SNX9 und SNX18 ebenfalls zu einer Zunahme der βAPP-Spaltung führt. Es handelt sich also um einen Effekt, der von der ganzen Sorting Nexin-Subgruppe (SNX33/SNX9/SNX18) vermittelt wird. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass diese Funktion innerhalb dieser Subgruppe konserviert ist. Transfektion von SNX1 führte zu keiner Änderung der βAPP-Proteolyse, was bedeutet, dass dieser Effekt nicht von der gesamten Sorting Nexin-Familie vermittelt wird. Interessanterweise ist die Spaltung von βAPP besonders sensitiv bezüglich einer veränderten Endozytose-Rate, da die Proteolyse der Transmembranproteine L-Selektin und des Tumornekrosisfaktor-Rezeptors 2 (TNFR2) unter SNX33 Überexpressionsbedingungen nicht signifikant verändert war. Ein siRNA-vermittelter Knock-Down von SNX33 führte zu keiner generellen Endozytoseinhibition in HEK293 Zellen, es konnte keine veränderte βAPP-Endozytoserate beobachtet werden. Die Bildung von sAPPα- und sAPPβ war in Folge dessen unverändert. Auch ein lst-4/SNX33-Knock-Down in C. elegans führte überraschenderweise zu keiner Inhibition der Dynamin-Funktion, äußerte sich jedoch in einer Fehlfunktion der Insulin-Signaltransduktion. SNX33-Knock-Down in humanen Zellen brachte keine nachweisbare Beeinträchtigung des Insulinsignalweges mit sich, jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Homologen SNX9 und SNX18 einen Verlust von SNX33 kompensieren können. Dabei gilt zu beachten, dass eine Funktionsübernahme durch homologe Proteine in C. elegans nicht möglich ist, da dieser Organismus nur ein einziges homologes Protein der SNX33/SNX9/SNX18-Subgruppe besitzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit präsentierten sowie diskutierten Daten zeigen, dass SNX33 in unterschiedliche zellulärer Prozesse involviert ist. SNX33 ist ein neu identifizierter Modulator der Zelle, der für zentrale Signalwege und Vorgänge, wie zum Beispiel der Insulinrezeptor-Signaltransduktion und Endozytose, von Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Modellorganismus C. elegans kann im humanen Zellkultursystem ein durch siRNA induzierter Funktionsverlust von SNX33 durch die homologen Proteine SNX9 und SNX18 kompensiert werden.

Epilepsien zählen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen bei Hund, Katze und Mensch. Sie sind mit einer fortschreitenden Schädigung des zentralen Nervensystems und mit erheblichen Einschränkungen im täglichen Leben verbunden. Trotz Entwicklung zahlreicher neuer Antiepileptika über die letzten Jahrzehnte spricht etwa ein Drittel der Veterinär- und Humanpatienten nicht auf eine Pharmakotherapie an. Diese Pharmakoresistenz von Epilepsien stellt ein schwerwiegendes und bisher ungelöstes Problem für die betroffenen Patienten dar und macht neue Therapiestrategien dringend erforderlich. Eine Ursache der Pharmakoresistenz bei Epilepsien stellt die Überexpression von Multidrug-Transportern in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke dar. Die physiologische Funktion dieser Efflux-Transporter besteht darin, den Eintritt von Xenobiotika in das Gewebe bestimmter Körperregionen zu verhindern. Eine Überexpression bei pharmakoresistenten Patienten führt zu einem vermehrten Efflux-Transport von Antiepileptika in die Blutbahn, so dass trotz therapeutischer Plasma-Konzentrationen keine ausreichenden Wirkstoffspiegel im Bereich des epileptischen Fokus erreicht werden können. Auf der Basis der Multidrug-Transporter-Hypothese wurden im Rahmen dieser Dissertation zwei mögliche neue Behandlungsstrategien zur Überwindung der Pharmakoresistenz von Epilepsien im Tiermodell untersucht. In den letzten Jahrzehnten wurde ein direkter intra- oder extraneuronaler Transport von Substanzen nach intranasaler (i.n.) Applikation aus der Nasenhöhle in das Gehirn wiederholt beschrieben. Diese Möglichkeit zur Umgehung der Blut-Hirn-Schranke und der dort lokalisierten Efflux-Transporter wurde im Rahmen dieser Arbeit mittels Untersuchungen zur Gehirngängigkeit von Antiepileptika nach i.n.-Applikation im Rattenmodell näher überprüft. Mikrodialyse-Untersuchungen zur Bestimmung der Extrazellulär-Konzentration von Phenobarbital, Lamotrigin und Carbamazepin im Bereich des frontalen Cortex ergaben keine Hinweise auf einen effektiveren Substanztransport nach i.n.-Applikation im Vergleich zur intravenösen (i.v.) Applikationsform. Die Bestimmung der Phenobarbital-Konzentration im Gesamtgehirngewebe nach i.n.- und i.v.-Verabreichung resultierte ebenfalls in gleichwertigen Konzentrationen. Die Untersuchung einzelner Gehirnregionen 10 min nach i.n. Applikation ergab für den Bulbus olfactorius eine signifikant höhere Gehirn-Plasma-Ratio im Vergleich zur i.v.-Applikation. Im Amygdala-Kindling-Modell der Temporallappen-Epilepsie konnte eine dosisabhängige antikonvulsive Wirkung nach i.n.-Applikation von Phenobarbital beobachtet werden, die in vergleichbarem Maße auch nach i.v.-Applikation zu beobachten war. Insgesamt geben die Untersuchungsergebnisse keinen Hinweis darauf, dass ein direkter Transport von Antiepileptika aus der Nasenhöhle in das Gehirn in therapeutisch relevantem Ausmaß stattfindet und eine Umgehung der Blut-Hirn-Schranke auf diese Weise möglich ist. Eine besondere Eignung der i.n.-Applikation zur Therapie pharmakoresistenter Patienten erscheint daher unwahrscheinlich, kann jedoch endgültig erst durch Untersuchungen in einem Tiermodell für pharmakoresistente Epilepsie beurteilt werden. Die nach i.n.-Applikation von Phenobarbital erreichten Plasma-Konzentrationen in Kombination mit der gezeigten antikonvulsiven Wirksamkeit lassen diesen Applikationsweg jedoch zur nicht invasiven Behandlung eines Status epilepticus oder von Anfalls-Clustern Erfolg versprechend erscheinen. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (P-gp) wird in Zusammenhang mit transporter-basierter Pharmakoresistenz bei Epilepsie besondere Bedeutung beigemessen. Durch pharmakologische Inhibition der P-gp-Funktion gelang im Tiermodell bereits die Überwindung von Pharmakoresistenz. Die Anwendung von Hemmstoffen bringt jedoch den Nachteil einer P-gp-Inhibition in allen Körperregionen mit sich. Eine auf die Blut-Hirn-Schranke begrenzte Reduktion der P-gp-Expression wäre durch den Mechanismus der RNA-Interferenz zu erreichen. Für in vivo-Untersuchungen an Ratten wurde gegen P-gp-mRNA gerichtete „small interfering RNA“ (siRNA) zum Schutz vor endogenen Nukleasen in Liposomen eingeschlossen. Zudem wurde für ein Targeting das Peptid ApoE4 an die Oberfläche der Liposomen gebunden, welches eine Endozytose an Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke vermittelt. Das Ziel einer P-gp-Reduktion auf Protein-Ebene nach i.v.-Applikation derart geschützter und zielgesteuerter siRNA konnte jedoch nicht erreicht werden. Die Quantifizierung der P-gp-Expression in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke anhand immunhistochemisch gefärbter Gehirnschnitte ergab 24 h nach Applikation keine Verminderung der P-gp-Expression. Die Ursachen für die ausgebliebene P-gp-Reduktion sind in weiterführenden Untersuchungen zu klären.

Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankungen, die sporadischen, hereditären oder infektiösen Ursprungs sein können. Die Missfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrPC) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei verschiedene Themenbereiche bearbeitet: zum einen die Analyse der Faltung und Maturierung krankheitsassoziierter Mutanten und zum anderen die Wirkung einer Anti-Prion-Substanz auf die Biogenese von PrPC und die Propagierung von infektiösem PrPSc. Hierfür wurden verschiedene humanpathogene Mutanten, sowie andere Punkt- und Deletionsmutanten in Maus-Neuroblastomzellen untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei Mutationen, die Prion-Erkrankungen beim Menschen hervorrufen (T183A und F198S), die Faltung und Biogenese von PrP beeinträchtigen. Im Gegensatz zu PrPC, nehmen diese Mutanten im ER spontan eine missgefaltete Konformation an und erhalten weder eine komplexe Glykosilierung noch einen GPI-Anker. Die missgefalteten Mutanten werden nicht durch eine ER-assoziierte Degradierung eliminiert, sondern in ihrer High Mannose Form sekretiert. Darüber hinaus können die sekretierten Formen von benachbarten Zellen wieder aufgenommen werden. Diese Studie leistet einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Missfaltung von T183A und F198S, welche offenbar mit einer Destabilisierung des hydrophoben Cores von PrP assoziiert ist und verdeutlicht außerdem, dass ein Zusammenhang zwischen der Faltung und den posttranslationalen Modifikationen von PrP besteht. Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich auf den Wirkungsmechanismus der Anti-Prion-Substanz Suramin. Es konnte gezeigt werden, dass der Effekt von Suramin auf einer Entfernung von PrPC von der Zelloberfläche beruht. So induziert Suramin eine Missfaltung von PrPC an der Plasmamembran, was eine anschließende Internalisierung und rasche Degradierung zur Folge hat. Dabei sind Missfaltung und Internalisierung zwei aufeinander folgende Prozesse, die von unterschiedlichen Domänen von PrPC vermittelt werden. Während die Suramin-induzierte Missfaltung vom proximalen Bereich des C-Terminus abhängt, ist der N-Terminus für die Endozytose verantwortlich. Diese Analyse verdeutlicht, dass in neuronalen Zellen eine Qualitätskontrolle zur Entfernung missgefalteter PrP-Formen von der Zelloberfläche besteht und liefert außerdem einen entscheidenden Ansatz für die Entwicklung effizienterer Anti-Prion-Strategien.

Myosine sind molekulare Motoren, die an einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Bewegung, Zellteilung oder Polarität beteiligt sind. Ihr Grundaufbau gliedert sich in Motordomäne, Hals- und Schwanzdomäne. Der Motor interagiert ATP-abhängig mit dem Aktinzytoskelett und ist die krafterzeugende Komponente. Vergleicht man die verschiedenen Myosine miteinander, zeigt der Kopfbereich die höchste Konservierung. An den Motor schliesst sich der Halsbereich an, der die Bindestellen für regulatorische Untereinheiten wie z.B. Calmodulin beinhaltet. Der Schwanzbereich dient zum einem der Interaktion mit der transportierten Fracht und zum anderen der Dimerisierung oder Organisation in Filamente. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae findet man fünf Myosine aus drei verschiedenen Klassen. Myo1p ist das einzige Klasse II Myosinund gehört zu den muskelähnlichen Myosinen, die sich in Filamenten organisieren. Myo2p und Myo4p gehören zu den Klasse V Myosinen und vermitteln Prozesse wie Vesikel-Transport, mRNALokalisation und Vererbung von Organellen und Endoplasmatischen Retikulum. Es wird vermutet, dass sie Dimere bilden, die als prozessive Motoren, also eigenständig, durch die Zelle wandern und so ihre Fracht an den Ort ihrer Bestimmung bringen. Myo3p und Myo5p sind in ihrer Funktion redundant und vermitteln als Klasse I Myosine die Endozytose, sowie die Integrität und Polarität des kortikalen Aktinzytoskeletts. Sie liegen als Monomere vor und interagieren über spezifische Domänen in ihren Schwanzbereich mit einer Vielzahl von Proteinen wie z.B. Verprolin oder Komponenten des Arp2/3-Komplexes. Die rekombinante Expression von Myosinen stellt sich als sehr problematisch dar, da sich die Motordomäne nicht spontan in eine funktionelle Konformation falten kann. Verschiedene Publikationen deuten daraufhin, dass für die Faltung dieser Multidomänenstruktur die UCS-Proteine notwendig sind. UCS leitet sich von den Namen der zuerst identifizierten Mitglieder ab (UNC-45 aus C. elegans, Cro1p aus P. anserina und She4p aus S. cerevisiae), welche lediglich die C-terminale UCS-Domäne gemeinsam haben. Für UNC-45 konnte bereits gezeigt werden, das es über die UCS-Domäne mit der Motordomäne von Muskelmyosin interagiert und als Chaperon dessen thermale Aggregation verhindert. Ausserdem interagiert UNC-45 über eine N-terminale TPR-Domäne mit Hsp90 und über den zentralen Bereich mit Hsp70. Im Rahmen meiner Arbeit wurde der Einfluss von She4p auf die Funktion der Myosine untersucht. Es wurde gezeigt, dass She4p über die UCS-Domäne mit der Motordomäne von Klasse I und Klasse V Myosinen interagiertund somit die Lokalisation von Myo3p, Myo4p und Myo5p ermöglicht. Mit Hilfe eines Aktin Pelleting Assays konnte gezeigt werden, dass die Misslokalisation der Klasse I Myosine im she4! Hintergrund durch einen Defekt in der Aktinbindedomäne im Motorbereich verursacht wird. Die Spezifität von She4p für verschiedene Myosinklassen spiegelt sich in der zellulären Verteilung des Proteins wieder. Das UCS-Protein wird Myo2p-abhängig in die Knospenspitze transportiert, um dort die Interaktion zwischen Klasse I Myosinen und dem Aktinzytoskelett zu vermitteln. Im Gegensatz dazu benötigt Myo4p lediglich funktionelles She4p innerhalb der Zelle, da dieses Myosin durch Mutter- und Tochterzelle wandert und somit seinen Regulator überall benötigt. Die Tatsache, ob She4p wie UNC-45 als Chaperon an der Faltung der Motordomäne beteiligt ist, ist weiterhin unklar. Es konnte jedoch in einem Pulldown Experiment und einer Immunpräzipitation eine Interaktion zwischen She4p und Hsp90 festgestellt werden. Es ist daher durchaus möglich, dass She4p als Kochaperon das Hsp90 System zum Myosin rekrutiert, damit die Motordomäne in eine funktionelle Konformation gefaltet wird. Neben der zytoplasmatischen Funktion von She4p scheint es noch eine nukleäre zu geben, da im Pulldown Experiment zahlreiche Proteine gefunden wurden, die Teil des Processosomes der kleinen ribosomalen Untereinheit sind und im Nucleolus lokalisieren. Die Funktion von She4p in diesem Prozess ist noch unbekannt.

Vor einigen Jahren wurde in der entzündlichen Haut neben den Langerhans-Zellen die Existenz einer weiteren Art dendritischer Zellen, der sogenannten Inflammatorischen Dendritischen Epidermalen Zellen (IDEC) herausgearbeitet. Über Herkunft, Verwandtschaft zu anderen Zellarten und Funktion der IDEC ist bislang wenig bekannt. Um die Abstammung der IDEC zu erforschen und ihre Rolle in der entzündlichen Haut neben jener der Langerhans-Zellen besser zu verstehen, sollte der Mannoserezeptor auf diesen beiden dendritischen Zellen in der Haut gesucht und die ihnen zur Verfügung stehenden Endozytose-Mechanismen ermittelt werden. In gesonderten Experimenten sollte die Phagozytosefähigkeit der Langerhans-Zellen und der IDEC geprüft werden. Als Kontrollzellen dienten Monozyten und MoDC´s, von welchen bereits Daten bekannt sind. Es wurden APAAP-Färbungen an histologischen Schnitten gesunder und entzündlicher Haut unter Verwendung des spezifischen Antikörpers D547 zur Identifizierung des Mannoserezeptors auf den Langerhans-Zellen und den IDEC vorgenommen. In der durchflußzytometrischen Immunphänotypisierung wurden die jeweiligen Zellen mit dem rezeptorspezifischen Antikörper D547 gefärbt. In durchflußzytometrischen Versuchen wurde die Pinozytose mittels Lucifer Yellow nachgewiesen. Zur Untersuchung der Rezeptor-vermittelten Endozytose wurden die Zellen mit Dextran-FITC inkubiert. Durch Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels Mannan wurde die Rezeptor-vermittelte Endozytose von der Pinozytose abgegrenzt. Die Phagozytose der Zellen wurde unter Verwendung von opsonisierten E.coli untersucht. Durch die immunhistologische Färbung und die Phänotypisierung jeweils mit dem Antikörper D547 konnte gezeigt werden, daß sich der Mannoserezeptor nicht auf den Langerhans-Zellen der normalen und der entzündlichen Haut befindet und nur auf den IDEC nachgewiesen werden kann. Er war in der Phänotypisierung der Monozyten nicht, auf den MoDC´s dagegen deutlich zur Darstellung zu bringen. Die Pinozytose konnte bei allen Zelltypen dargestellt werden. Weiterhin konnte unter Verwendung von Dextran-FITC und Hemmung des Mannoserezeptors durch Mannan gezeigt werden, daß Monozyten keine, MoDC´s dagegen eine deutliche Rezeptorvermittelte Endozytose aufweisen. Langerhans-Zellen besitzen die Fähigkeit zur Rezeptor-vermittelten Endozytose nicht, MoDC´s hingegen nehmen mannosylierte Antigene rezeptorgebunden in sich auf. Die Ergebnisse ergeben mit denjenigen der Phänotypisierung ein Konzept, welches sagt, daß Langerhans-Zellen keinen Mannoserezeptor tragen, IDEC jedoch ebenso wie die MoDC´s den Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche exprimieren und ihn zur Endozytose benutzen. Ferner konnte gezeigt werden, daß Blutmonozyten opsonisierte E.coli phagozytieren. MoDC´s nahmen keine E.coli in sich auf. Ebenso konnte gezeigt werden, daß Langerhans-Zellen aus normaler und entzündlicher Haut keine Phagozytose-Aktivität entfalten. Auch IDEC phagozytierten E.coli nicht. Langerhans-Zellen und IDEC konnten weiter voneinander abgegrenzt werden. Die Expression des Mannoserezeptors auf den IDEC und ihre Präsenz ausschließlich in entzündlichen Hautläsionen läßt vermuten, daß sie den in der Antigenpräsentation äußerst effizienten unreifen dendritischen Zellen zuzuordnen sind und ihnen eine Rolle in der Genese des atopischen Ekzems und in der Abwehr pathogener Organismen von entzündeter Haut zukommt. Die Ähnlichkeit der IDEC mit den MoDC´s nicht nur in der Rezeptor-vermittelten Endozytose legt die Abstammung dieser Zellen von Blutmonozyten und die Verwandtschaft mit MoDC´s und nicht mit den Langerhans-Zellen nahe. Die Expression des Mannoserezeptors und die Phagozytose-Fähigkeit der Zellen erwiesen sich als voneinander unabhängig. Dies erscheint wesentlich, da eine Funktion des Mannoserezeptors bei der Phagozytose bekannt ist.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen polaren Wachstums im phytopathogenen Basidiomycet Ustilago maydis. Zunächst wurde die zelluläre Rolle des t-SNAREs Yup1 analysiert. Ein temperatursensitiver Defekt im yup1-Gen hatte zu Störungen in der Zelltrennung und im polaren Wachstum von Sporidien geführt. Mutante Zellen bildeten dabei lange verzweigte Ketten aus verdickten Zellen. Die Lokalisation eines Yup1-GFPFusionsproteins auf beweglichen Organellen hatte zum Aufstellen eines spekulativen Modells geführt, bei dem Yup1 auf Endosomen die Fusion mit ankommenden endozytotischen Vesikeln vermittelt. Eine erstmalige Charakterisierung der Endozytose von U. maydis in dieser Arbeit zeigte, dass es sich bei den mit Yup1-GFP markierten, schnellen Organellen tatsächlich um frühe Endosomen handelte. Diese akkumulierten Zellzyklus-abhängig an Regionen aktiven Wachstums in BSDs. Die Akkumulation früher Endosomen im Apex von Hyphen war für das Spitzenwachstum erforderlich. In yup1ts-Zellen war bei restriktiver Temperatur eine gestörte Endozytose zu beobachten. Dieser Zusammenhang zwischen Zellmorphologie und polarer Sekretion einerseits und Endozytose andererseits deutete darauf hin, dass Membranrecycling über frühe Endosomen entscheidend am polaren Wachstum von U. maydis-Zellen im Speziellen und pilzlichen Hyphen im Allgemeinen mitwirkt. Mittels des Yup1-GFP-Fusionsproteins konnten die molekularen Grundlagen der beobachteten Bewegung von Endosomen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass sich frühe Endosomen entlang von MT bewegen. Für diese Bewegung war in erster Linie das Kinesin Kin3 verantwortlich. Dieses Molekül ist ein neues Mitglied der Unc104/KIF1-Familie von Kinesin-ähnlichen molekularen Motoren und bewegt als solches vermutlich in Richtung der plus-Enden von MT. Gelfiltrationsexperimente legten nahe, dass Kin3 in der Zelle als Monomer vorliegt. Die N-terminale Motordomäne zeigte in vitro eine MTstimulierte ATPase Aktivität. Ein Kin3-GFP-Fusionsprotein lokalisierte in schnell beweglichen Flecken, die im Bewegungsverhalten den frühen Endosomen glichen. Ein Kin3-YFP-Fusionsprotein bewegte entlang von MT und kolokalisierte zudem mit einem Yup1-CFP-Fusionsprotein auf Endosomen. Die Deletion von kin3 führte zu einer starken Reduzierung der Endosomenbewegung. Die in vivo-Untersuchung der MT-Dynamik im Δkin3-Stamm ergab, dass der Großteil der Endosomen in Akkumulationen an den minus-Enden der MT konzentriert war. Entsprechend führte die Überexpression von kin3 zu einer verstärkten Konzentration der Endosomen an den plus-Enden von MT. Die Zellform einzelner Sporidien war im kin3-Deletionsstamm nicht verändert. Allerdings trennten sich die Zellen nach der Teilung wie in der yup1ts-Mutante nicht voneinander. Dieser Trennungsdefekt und ein verändertes Knospungsmuster führten zur Bildung von großen Baum-ähnlichen Zellaggregaten. Im Hyphenstadium führte die Deletion von kin3 außerdem zu einer deutlichen Störung des polaren Wachstums. Die nach Deletion von kin3 beobachtete Restbewegung der Endosomen beruhte fast ausschließlich auf der Aktivität des zytoplasmatischen Dyneins von U. maydis. Das konventionelle Kinesin von U. maydis, Kin2, zeigte ebenfalls einen Einfluss auf die Organisation und Position endosomaler Akkumulationen, obwohl es vermutlich nicht direkt am Transport einzelner Endosomen beteiligt ist. Die präsentierten Daten zeigen, dass Endosomen MT- und Zellzyklus-abhängig organisiert sind. Die Position der BSDs korrelierte dabei mit Funktionen der Endosomen bei der Zelltrennung, in der Bestimmung des Knospungsmusters und beim polaren Wachstum. Da die MT während des Knospenwachstums unipolar ausgerichtet sind, nutzt die U. maydis-Zelle das Wechselspiel des plus-Motors Kin3 und des minus-Motors Dynein, um die Endosomen Zellzyklus-abhängig an den plus- oder minus-Enden der MT zu akkumulieren.