Podcasts about caspasen

Mon, 3 Oct 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4279/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4279/1/Cikala_Mihai.pdf Cikala, Mihai

Der programmierte Zelltod, oder Apoptose, ist ein physiologischer Vorgang mit zentraler Bedeutung für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Die Auslösung der Apoptose führt zur Aktivierung von Caspasen. Dies sind Cysteinproteasen, die gezielte Substratproteine spalten und so die koordinierte Zerstörung der Zelle herbeiführen. Apoptose wird durch pro- und antiapoptotische Proteine reguliert, die die Aktivierung von Caspasen stimulieren bzw. unterdrücken. Da diese Proteine sich gegenseitig beeinflussen, wird das Schicksal einer Zelle durch die relative Aktivität pro- und antiapoptotischer Faktoren bestimmt. BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi Netzwerks. Seine charakteristischen Merkmale sind eine N-terminale BIR-Domäne und eine C-terminale UBC-Domäne, die dem Molekül Ubiquitin-Konjugationsaktivität verleiht. Diese Arbeit demonstriert, dass BRUCE Zellen vor der Apoptose schützt und als ein inhibitor of apoptosis protein (IAP) wirkt, indem es an aktive Caspasen bindet und diese inhibiert. Die Verwendung von Wildtyp und Mutanten des BRUCE Proteins zeigt, dass diese Aktivitäten von der BIR-Domäne abhängen. Während der Apoptose wird BRUCE durch unterschiedliche Mechanismen blockiert. Zum einen wird BRUCE durch Caspasen und HtrA2 proteolytisch gespalten und dadurch inaktiviert. Zum anderen bindet der mitochondriale IAP-Antagonist Smac an die BIR-Domäne von BRUCE und unterdrückt dessen Caspase-inhibitorische Aktivität, indem es die Bindung von BRUCE an Caspasen verhindert. Aufgrund seiner Lokalisierung an Membranen des trans-Golgi Netzwerks könnte BRUCE ein spezialisiertes, antiapoptotisches Protein mit räumlich begrenzter Aktivität sein. Wie die stark negative Regulation verdeutlicht, scheint außerdem die Entfernung von BRUCE aus der Zelle während der Apoptose wichtig zu sein. Räumlich und zeitlich begrenzte Inhibition von Caspasen während der Apoptose könnte daher für einen geordneten Ablauf apoptotischer Prozesse, wie zum Beispiel den Abbau des Golgi-Apparates und seine Verpackung in apoptotische Vesikel, notwendig sein.

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, auf welchem Wege die beiden Zelltodrezeptoren TNFR1 und Fas Apoptose in den Zelllinien A9 und SV80 ausführen. Ausgangspunkt waren widersprüchliche Erkenntnisse über die Signalwege von TNFR1 und Fas. So war in der Literatur beschrieben, daß TNFR1 und Fas die gleichen intrazellulären Signalmoleküle benutzen um Apoptose auszulösen. Als diese Signalmoleküle wurden FADD, TRADD und FLICE identifiziert. Ergebnisse aus unserem Labor zeigten jedoch, daß in A9 Zellen der durch Fas oder TNFR1 ausgelöste Zelltod unterschiedliche Signalwege beschreiten musste, da sich der durch TNFR1 ausgelöste Zelltod bezüglich der Hemmbarkeit durch verschiedene Inhibitoren der Apoptose deutlich von dem durch Fas ausgelösten Zelltod unterschied. Es sollte untersucht werden, ob in SV80 und A9 Zelllinien FADD als gemeinsames Signalprotein beider Zelltodrezeptoren benutzt wird, oder bereits auf dieser Ebene ein Unterschied festzustellen ist. Dazu wurde FADD kloniert, und die Mutante DFADD von FADD hergestellt, die in der Lage ist, den bisher bekannten Signalweg von FADD in einer dominant negativen Weise zu hemmen. FADD und DFADD wurden in A9 und SV80 Zellen zur Expression gebracht. In SV80 Zellen führte Überexpression von FADD wie erwartet zu Zelltod, Expression von DFADD schützte nach Stimulation des TNFR1 oder Fas wie erwartet vor Zelltod. Expression von FADD in A9 Zellen führte zu Zelltod. Überraschenderweise führte jedoch auch Expression von DFADD in A9 zu Zelltod. Es war unerwartet, daß die Mutante, die den bisher bekannte Signalweg von FADD blockieren sollte, selbst Zelltod auslösen kann. Um die Art der Wirkung dieser Mutante DFADD weiter zu charakterisieren wurde versucht, den durch DFADD vermittelten Zelltod durch verschiedene Klassen von Hemmstoffe der Apoptose zu inhibieren. Zum einen Apoptoseinhibitoren, die über Hemmung der Caspasen wirken, zum anderen solche, die durch Hemmung der Atmungskette Apoptose unterbinden. Des weiteren wurde das Signalmolekül RAIDD und verschiedene dominant negative Mutanten kloniert, um zu untersuchen, ob DFADD in der Lage ist weitere Signalproteine zu aktivieren und so Zelltod auszulösen.

Die Apoptose ist ein genetisch codiertes Suizidprogramm, das es jeder eukaryontischen Zelle erlaubt, auf bestimmte endogene oder äußere Signale mit einem kontrollierten Degradations- und Absterbeprozess zu reagieren. Auf diese Weise werden dem Organismus überzählige oder geschädigte Zellen entzogen, ein Prozess, der z.B. bei Krankheiten wie Krebs zumindest partiell ausser Kraft gesetzt ist. Um neue Einblicke in das erst in Teilen aufgedeckte Netzwerk Apoptose-induzierender Gene zu erhalten, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Expressions-Screeningverfahren zur Identifikation neuer proapoptotischer Gene eingesetzt. Mit diesem Verfahren, das auf der Fähigkeit der Gene dominant Apoptose zu induzieren basiert, wurden mehr als 50 neue Apoptose-induzierende Gene isoliert, von denen einige Ursache bestimmter Krankheiten sein könnten. Aus diesen wurde das Metastasensuppressorgen C33/CD82 für weitere Untersuchungen ausgewählt, da seine Expression in zahlreichen stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist und es bislang nicht als proapoptotisch beschrieben wurde, obwohl es eines der bislang bestcharakterisiertesten Metastasensuppressorgene ist und die Apoptose ein kritischer Faktor bei der Metastasierung ist. C33/CD82-Apoptose erfolgt durch Aktivierung der Mitochondrien. Dadurch kommt es zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials und zur Freisetzung proapoptotischer Faktoren in das Cytoplasma, wo diese Caspasen aktivieren, sodass es zur Ausprägung charakteristischer Merkmale der Apoptose kommt: neben morphologischen Veränderungen, wie der Ausbildung apoptotischer Körperchen, wird Phosphatidylserin exponiert und die DNA und bestimmte Proteine werden degradiert. Ausgelöst wird die C33/CD82-Apoptose durch Superoxidanionen, die anders als bei Standard-Apoptosewegen nicht an der mitochondrialen Elektronentransportkette gebildet werden. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit demonstriert, dass auch einige andere Mitglieder der Tetraspanin-Superfamilie, der C33/CD82 angehört, Apoptose induzieren: hierzu zählen CD9, CD37, CD81 und CD151 und in geringerem Umfang auch CD53 und CD63. Mit Hilfe trunkierter Mutanten wurde der für die Apoptoseinduktion verantwortliche Bereich auf die ersten 119 Aminosäuren von C33/CD82 eingegrenzt. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit ist die C33/CD82-Apoptose eine wesentliche neue Eigenschaft des Proteins: Sie könnte neben der Beeinflussung der Zellmotilität, die durch E-Cadherin und Integrine vermittelt wird, mit denen C33/CD82 interagiert, und der Internalisierung des EGF-Rezeptors, die durch C33/CD82 beschleunigt wird, zur Wirkung des Proteins als Metastasensuppressor beitragen. Die Überexpression von C33/CD82 induziert nicht nur Apoptose in allen getesteten Tumorzelllinien, sondern auch unter hypoxischen Bedingungen. In vivo sind derartige Bedingungen im Inneren nicht vaskularisierter Tumore und Metastasen zu finden. Dort könnten sie, bedingt durch die Hypoxie-aktivierbaren Transkriptionsfaktoren p53 und NF﷓IL﷓6, zu einer Verstärkung der C33/CD82-Expression führen. Die Vermeidung von Hypoxie-induzierter C33/CD82-Apoptose könnte ein Grund dafür sein, dass die Expression von C33/CD82 in vielen untersuchten stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist. Eine Besonderheit von C33/CD82 ist, dass nicht nur seine Überexpression dominant Apoptose induziert, sondern dass bereits das normale Expressionsniveau Zellen für wenigstens einen spezifischen proapoptotischen Stimulus sensitiviert. Im Fall dieser Arbeit war dies Cycloheximid, welches stellvertretend für weitere applizierbare und möglicherweise therapeutisch verwendbare Stimuli stehen könnte. Vielleicht existiert auch ein Cycloheximid entsprechender endogener Stimulus, der wie Cycloheximid ausschließlich in C33/CD82-positiven Zellen Apoptose auslöst. Die in dieser Arbeit entdeckten Fähigkeiten von C33/CD82, dominant Apoptose zu induzieren und Zellen für Apoptoseinduktion zu sensitivieren, sind neue Eigenschaften des Metastasensuppressors C33/CD82, die zu der in vivo beobachteten, in der Literatur vielfach beschriebenen Metastasensuppression beitragen können.

Die vorliegende Arbeit wurde durch den SFB 369 (Teilprojekt B7) unterstützt. Sie sollte auf Basis der bereits vorliegenden Erkenntnisse klären, welcher Mechanismus der Apoptoseinduktion durch Ajoen in HL-60 Zellen zu Grunde liegt. Dirsch et al. 5 zeigten bereits 1998, dass Ajoen Apoptose in humanen akut-myeloischen Leukämiezellen (HL-60) induziert. Weiterhin zeigte sich eine dosis- und zeitabhängige Produktion der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N-Acetylcystein (NAC), ein Antioxidans, verhinderte partiell die Ajoeninduzierte ROS-Produktion und die Apoptose. Auf dieser Grundlage konnten folgende Ergebnisse erarbeitet werden: 1) Ajoen verursacht in HL-60 Zellen die Aktivierung der Caspase-3 sowie der Caspase-8. Eine generelle Aktivierung von Caspasen ist für die Ajoen-induzierte Apoptose nötig, da der Breitbandcaspaseinhibitor z-VAD-fmk die durch Ajoen provozierte DNA-Fragmentation völlig verhindert. 2) Die Ajoen-induzierte Apoptose wird nicht durch den Todesrezeptor CD95 vermittelt. Dafür sprechen folgende Ergebnisse: a) Unsere HL-60 Zellen exprimieren den CD95-Rezeptor, jedoch kann der natürliche CD95-Ligand (CD95L) keine Apoptose hervorrufen. Wahrscheinlich ist der CD95-Rezeptor inaktiv. b) Außerdem kann für die Caspase-8, die für die Signalweiterleitung vom CD95-Rezeptor u.a. mit verantwortlich ist, durch Einsatz eines spezifischen Caspase-8 Inhibitors keine Bedeutung für die Ajoeninduzierten Apoptose gezeigt werden. c) CD95-resistente Jurkat Zellen (JurkatR) sind auf Ajoen genauso empfindlich wie die Kontrollzellen. 3) Es konnte bewiesen werden, dass Ajoen Apoptose über den mitochondrialen Signalweg induziert: a) Ajoen verursacht sowohl den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials der inneren Membran als auch eine Cytochrom c- Freisetzung aus dem intermembranären Spalt. b) Die Ajoen-induzierte Apoptose hängt von der provozierten mitochondrialen Dysfunktion ab: HL-60 Zellen, die das anti-apoptotische Protein Bcl-xL überexprimieren, sind vor Apoptose geschützt. c) Die höhere Sensitivität der HL-60/neo bzw. die niedrigere Sensitivität der HL-60/bcl-xL Zellen auf Ajoen konnte auch morphologisch durch TEM-Untersuchungen untermauert werden. Zusammenfassend konnte also für die Ajoen-induzierte Apoptose eine von Mitochondrien abhängige Signalweiterleitung gezeigt werden. 4) Untersuchungen zur Frage, wie es zur Ajoen-induzierten mitochondrialen Dysfunktion kommt, brachten folgende Erkenntnisse: a) Eine Aktivierung von Caspasen ist für die Auslösung der mitochondrialen Ereignisse nicht notwendig. Die abgeschwächte und verzögerte Caspaseaktivierung in HL-60/bcl-xL Zellen beweist: Caspasen werden „downstream“ der mitochondrialen „Aktivierung“ gespalten. b) Die ROS-Entstehung ist ein Ereignis vor („upstream“) der mitochondrialen Dysfunktion. c) Die folgerichtige Untersuchung der MAPK JNK, p38 und ERK1/2 (die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 war bereits bekannt), ergab deren Aktivierung, jedoch ist diese für die Signalvermittlung nicht nötig. Nur für die ERK1/2 Kinase konnte eine direkte Beteiligung, und zwar als „survival“-Faktor, festgestellt werden, während die Akt als „survival“- Faktor keine Bedeutung hat. Ergebnisübersicht: CD95 Caspase-8 ROS p 38 MAPK ERK1/2 JNK Akt DNA- Fragmentierung Apoptose Caspase-3 Caspase-8 Aktivierung Caspase-3- ähnlicherCaspasen z-VAD-fmk Cytochrom c- Freisetzung z-VAD-fmk AP-1 Extrinsischer intrinsischer Signalweg Signalweg Bcl-xL Ajoen Abb. 61: Ergebnisübersicht Rot:-- Involvierung im Signalweg, blau:-- kein kausaler Zusammenhang gegeben; –I = Hemmung.