Podcasts about glykoproteine

Über die Histomorphologie der bovinen Euterhaut liegen in der aktuellen Literatur bisher nur sehr wenige Ergebnisse vor (LUDEWIG et al., 1996). Zudem gibt es noch keine Informationen über die Ultrastruktur sowie die Herkunft, Art und Kohlenhydratzusammensetzung der Glykoproteine der Euterhaut. Um weitere Erkenntnisse zu ihrem Aufbau und ihrer Funktion zu erhalten, wurden in dieser Arbeit verschiedene ultrastrukturelle, lichtmikroskopische, immun- und glykohistochemische Methoden angewandt. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf augenscheinlichen histologische Unterschiede der Euterhaut von juvenilen nicht-laktierenden und adulten laktierenden Rindern gelegt.

In der vorliegenden Untersuchung wurde das Gewebe der Zahnpulpa des Schweines im Vergleich mit der Pulpa von Zähnen des Menschen mit verschiedenen histologischen, histochemischen, immunhistochemischen und elektronenmikroskopischen Methoden untersucht. Zahnpulpa von Mensch und Schwein sind sehr ähnlich aufgebaut und bestehen aus verzweigten Fibroblasten und reich entwickelter Matrix, in der erstaunlich viele Blutgefäße und auch Nerven vorkommen. Kleine Unterschiede zwischen den zwei Säugetierarten, wie z.B. vermehrter Kollagengehalt beim Menschen, hängen vermutlich damit zusammen, dass das untersuchte Material vom Menschen mindestens 30 Jahre alten Zähnen entstammte, wohingegen das Material vom Schwein maximal 2 Jahre alten Zähnen entstammte. Beim Schwein wurden keine konstanten Unterschiede im Aufbau der Zahnpulpa von Milch- und Dauerzähnen beobachtet. Die Matrix der Pulpa enthält ein dichtes dreidimensionales Netzwerk aus meistens feinen Kollagenfasern. In der Pulpaperipherie und in der Umgebung von Arterien bzw. Arteriolen und Nerven sind Kollagenfasern besonders konzentriert. Immunhistochemisch bestehen diese Fasern aus Kollagen vom Typ III und Kollagen vom Typ I. Typische retikuläre Fasern lassen sich lichtmikroskopisch nur unbefriedigend und wohl nur teilweise mit den histologischen Silberimprägnationsmethoden nachweisen. Elastische Fasern fehlen in der Matrix. Fibronectin kommt in der gesamten Zahnpulpa vor und ist in der zellreichen Peripherie in reicherem Maße vertreten als im Zentrum der Pulpa. Die Substrathistochemie (PAS-Reaktion, Alcianblau-Färbung) zeigt, dass die Zahnpulpa in mäßigem Umfang neutrale Glykoproteine, aber in reichem Maße anionische Proteoglykane enthält, deren Glykosaminoglykane mehrheitlich Chondroitinsulfat und Dermatansulfat sind. Decorin (= Decoran) kommt in reichem Maße in einem sehr regelmäßigen Lokalisierungsmuster vor, und verbindet in regelmäßigen Abständen benachbarte Kollagenfibrillen. Das Muster der regelmäßigen Brücken aus Glykosaminoglykanketten zwischen Kollagenfibrillen entspricht dem Konzept der „Shape-modules“, das in Bindegewebstypen mit ganz anderen biomechanischen Funktionen, als sie in der Zahnpulpa herrschen, erarbeitet wurde, und das offenbar ganz universell gilt. S-100 und Neurofilament-Protein markieren gut kleine Nerven. Der kationische kupferhaltige Farbstoff „Cupromeronic Blue“ markiert im elektronenmikroskopischen Präparat scharf die Glykosaminoglykane von Proteoglykanen. In der Matrix kommen kollagen- und nicht-kollagenassoziierte Proteoglykane vor. Das typische kollagenassoziierte Proteoglykan ist das Decoran (= Decorin), das in anderen Bindegeweben an d- und e-Bande und z. T. zusätzlich an die a- und e-Bande der D-Periode der Kollagenfibrillen bindet. Die Bindungsstellen können am Kollagen der Zahnpulpa nicht genau ermittelt werden; es scheint aber ein komplexes dreidimensionales Muster vorzuliegen. Sehr häufig wurden in der Zahnpulpa auf Längsschnitten durch Kollagenfibrillen nur eine Decoran-„Brücke“ pro D-Periode beobachtet. Neben Decoran, das die benachbarten Kollagenfibrillen verbindet bzw. auf Abstand hält, kommen Proteoglykane vor, die ringförmig oder parallel oder schräg zur Längsachse der Kollagenfibrillen verlaufen. Nicht-kollagenassoziierte Proteoglykane kommen in unterschiedlicher Größe und Struktur in der Pulpamatrix vor.

EBV ist ein Herpesvirus, welches in über 90% aller Erwachsenen nachgewiesen werden kann und in den wenigsten Fällen Beschwerden verursacht. Unter bestimmten Umständen kann es aber zur Ausbildung einer Infektiösen Mononukleosekommen und auch an der Entstehung einer Reihe von Krebserkrankungen, allenvoran die PTLD (posttransplant lymphoproliferative disease), das Burkitt- und das Hodgkin-Lymphom, ist EBV ursächlich beteiligt. Trotz zahlreicher Bemühungen und einiger vielversprechender Ansätze ist bis heute kein wirksamer Impfstoff gegen das Epstein-Barr Virus vorhanden. Im Bereich Exosomen als Mittel zur Induktion von Immunantworten wird seit gut 10 Jahren geforscht und ihre Wirksamkeit konnte bereits in klinischen Studien zur Behandlung mehrerer Krebsarten getestet werden. In dieser Doktorarbeit wurden HEK 293-Zellen und ein auf diesen Zellen basierendes Verpackungssystem für virale Vektoren auf ihre Eignung hin untersucht, rekombinante Exosomen und Virus-like-Particles (VLPs) zu produzieren, welche eventuell als DNA-freies Vakzin gegen EBV eingesetzt werden könnten. In EBV-positiven Verpackungszelllinien konnte durch Induktion des lytischen EBV-Zyklus die Freisetzung DNA-freier VLPs erreicht werden. Genau wie Exosomen aus 293-Zellen, die zuvor mit Expressionsplasmiden für EBV-Antigene transfiziert worden waren, konnten sie aus dem Zellkulturmedium aufgereinigt werden. Ihr großes immunogenes Potential zeigte sich bei der Reaktivierung von EBV-spezifischen TZellklonen und Gedächtnis-T-Zellen aus PBMCs, wo bereits geringe Mengen für eine Stimulation ausreichten. Zu der hohen Effizienz der Partikel trug ihr Tropismus bei, der auf virale Glykoproteine, vor allem gp350, zurückzuführen war. Die Partikel besaßen dadurch eine Affinität zu B-Zellen, über die effizient die Präsentation der Exosomen und Virus-like-Particles erfolgte. Auch in in vivo-Versuchen, bei denen mit dem hu-PBMC-Rag-Mausmodell und dem MHV-68-Mausmodell gearbeitet wurde, konnten durch Immunisierung mit Exosomen bzw. Virus-like-Particles virusspezifische humorale wie zelluläre Imunantworten ausgelöst werden. In Stimulationsexperimenten von malignen Zellen aus Patienten mit chronisch lymphatischer B-Zellleukämie (B-CLL) konnte ich weiterhin zeigen, dass Exosomen und VLPs auch als Überträger funktioneller Moleküle wie den CD40L, einem Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor-Familie, fungieren können. Dieser bewirkte in den sonst nicht immunogenen und deshalb vom Immunsystem nicht erkannten CLL-Zellen eine verstärkte Expression kostimulatorischer, Adhäsions- und apoptoseassoziierter Moleküle. Auf diese Weise war es möglich, autologe Tumor- und EBV-spezifische T-Zellen zu reaktivieren. Exosomen und Virus-like-Particles könnten deshalb bei der Behandlung der B-CLL eine vielversprechende Alternative zur Gentherapie darstellen.

Der TFCC (triangular fibrocartilage complex) überträgt Lasten vom Karpus auf die Ulna und stabilisiert das distale Radioulnargelenk. Läsionen dieser Struktur führen häufig zu Schmerzen im Handgelenk. Trotz der klinischen Bedeutung ist nur wenig über die molekulare Zusammensetzung des TFCC bekannt. Wir haben mittels immunhistochemischer Nachweismethoden die molekulare Zusammensetzung der extrazellulären Matrix des Discus articularis ulnae und des Meniscus ulnocarpalis untersucht. Dabei wurden monoklonale Antikörper gegen Kollagene, Glykosaminoglykane, Proteoglykane und Glykoproteine verwendet. Bei einer Vielzahl von Molekülen (Kollagen I, III, VI, Chondroitin-4-Sulfat, Dermatan- und Keratansulfat, Versican und COMP) zeigt sich ein weitgehend homogenes Verteilungsmuster in allen untersuchten Regionen. Der Nachweis von Kollagen II, Aggrecan und Link Protein hingegen beschränkt sich auf den radialen und zentralen Teil des Discus articularis ulnae, im Meniscus ulnocarpalis sind diese Moleküle nicht nachweisbar. Diese Veränderung des Phänotyps innerhalb des TFCC, von einem radial stark faserknorpeligem Discus articularis ulnae zu einem bindegewebigen Meniscus ulnocarpalis, korreliert mit biomechanischen Untersuchungen, die radial deutlich höhere Druckbeanspruchungen als ulnar beschreiben. Klinische Bedeutung gewinnt die Arbeit durch den Nachweis von Antigenen, die im Rahmen von rheumatischen Erkrankungen eine Autoimmunantwort hervorrufen können. In diesem Zusammenhang werden Kollagen II, Aggrecan, Link Protein und COMP (Cartilage oligomeric matrix protein) diskutiert.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.