Podcasts about leukozytenadh

Die Manifestation der Artherosklerose an den Herzkranzarterien ist die koronare Herzerkrankung (KHK), ein pathologischer Prozess dessen Auswirkungen in Industrieländern die Krankheits- und Todesursachenstatistiken anführen1. Der Myokardinfarkt mit thrombotischem Verschluss einer Koronararterie ist dabei eine der häufigsten Komplikationen. Die zeitnahe Revaskularisation ist die wichtigste therapeutische Maßnahme zur Reduzierung des postischämischen Myokardschadens, wobei auch durch die Reperfusion selbst eine Schädigung der Myozyten und des Endothels stattfindet. Mit Wiedereröffnung der verschlossenen Herzkranzgefäße setzt eine gesteigerte inflammatorische Reaktion ein, begleitet von erhöhter Leukozytenmigration in myokardiales Gewebe. Der Rezeptor der advanced glycation end products (RAGE) wurde in verschiedenen Vorarbeiten im Kontext der myokardialen Ischämie und Reperfusion beschrieben. In dieser Arbeit wurden die postischämische Interaktion von RAGE und Leukozyten und deren funktionelle Relevanz in einem Mausmodell analysiert. Tiere, die defizient für das endotheliale Adhäsionsmolekül ICAM-1 oder für RAGE sind, sowie doppeldefiziente Tiere wurden einer 20-minütigen Okklusion der LAD unterzogen. Nach einer darauf folgenden 15-minütigen Reperfusion wurde die Leukozytenrekrutierung mittels Rhodamin-G6 Infusion fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Außerdem wurde in WT und in ICAM-1/RAGE-defizienten Tieren die linksventrikuläre Funktion nach 45 Minuten myokardialer Ischämie und 24 Stunden Reperfusion mittels invasiver intrakardialer Druckmessung untersucht. In RAGE- oder ICAM-1-defizienten Tieren kam es zu einer gleichwertigen Verminderung der Leukozytenrekrutierung (Abb. 8) im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. In ICAM-1/RAGE-/- Tieren kam es zu einer additiven Reduktion. Ebenso zeigten RAGE/ICAM-1-/-Tiere eine verbesserte postischämische LV-Funktion im Vergleich zu WT-Kontrollen. Um zwischen endothelial und leukozytär exprimiertem RAGE zu differenzieren, wurden Knochenmark-Chimären mit WT und ICAM-1/RAGE-/- Tieren generiert. Hierzu wurden Wildtyp-Mäusen nach Bestrahlung Knochenmark von ICAM-1/RAGE-defizienzenten Tieren transplantiert, um Mäuse mit leukozytärer ICAM-1/RAGE-Defizienz zu generieren. Umgekehrt wurde ICAM-1/RAGE-defizienten Tieren Knochenmark von Wildtyp-Tieren transplantiert. Dadurch erhielten wir Mäuse mit ausschließlich auf dem Endothel fehlender ICAM-1/RAGE-Expression. In diesen Knochenmarkschimären konnten wir zeigen, dass das Fehlen des endothelialen RAGE zu einer deutlichen Reduktion der Leukozytenadhäsion führt, das Fehlen von leukozytärem RAGE hingegen kaum zu einer Änderung der Leukozytenadhäsion. Somit konnten wir zeigen, dass nicht das leukozytäre sondern endotheliales RAGE einen redundanten Effekt für die Leukozytenrekrutierung darstellt. Wir konnten nachweisen, dass diese ICAM-1/RAGE-Defizienz zu einer signifikanten Verbesserung der linksventrikulären Funktion führt. Ein möglicher Mechanismus ist die Interaktion zwischen leukozytärem Mac-1 und endothelialem RAGE. Die reduzierte inflammatorische Reaktion ist verantwortlich für die verbesserte linksventrikuläre Funktion und könnte als neuartiger therapeutischer Ansatz von Nutzen sein.

Thu, 13 Oct 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13617/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13617/1/Kronschnab

Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Diagnosen in den industrialisierten Ländern. In der Regel kommt es zu einem thrombotischen Verschluss einer Koro-nararterie. Die rasche Revaskularisierung und die dadurch erhoffte Reduktion des in-farzierten Areals ist die wichtigste therapeutische Maßnahme zur Rettung des ischämischen Myokards und zur Senkung der Morbidität und Mortalität. Nach der plötzlichen Reperfusion des postischämischen Gewebes kommt es zu einem soge-nannten myokardialen Ischämie/Reperfusionsschaden, der sich als Endothel- und Myozytenschädigung ausbildet. Folge von rascher Reoxygenierung sind u. a. eine gesteigerte inflammatorische Re-aktion und in diesem Rahmen eine gesteigerte Einwanderung von Leukozyten in das ischämische Areal. Die Rolle der Thrombozyten für die postischämische Leukozyten-rekrutierung war bisher unklar. In unserer Studie wurden Wildtyp- (WT), P-Selektin- und ICAM-1/P-Selektin-defiziente Mäuse einer 20-minütigen LAD-Okklusion unterzogen, gefolgt von 15 Mi-nuten Reperfusion, um den Effekt der Interaktion zwischen Endothel, Leukozyten und Thrombozyten und den Einfluss auf den frühen Reperfusionsschaden zu unter-suchen. Anschließend wurden die Herzen ex vivo fluoreszenzmikroskopisch bzw. mittels LV-Druckmessung im isolierten Herzen analysiert. Zur Analyse der Zell-Zell-Interaktion wurden zu Beginn der Reperfusion zirkulierende Leukozyten mit Rhoda-min G6 gefärbt bzw. 2x108 BCECF-AM- oder Rhodamin G6-gefärbte homologe oder heterologe Thrombozyten systemisch infundiert. In P-Selektin-defizienten Tieren war die Verminderung der Leukozytenrekrutierung (Abb. 11) und die Bildung der Leukozyten/Thrombozyten-Co-Aggregate (Abb. 12 sowie die Reduktion des postischämischen linksventrikulären Funktionsverlustes (Tabelle 5) moderat. Dieser Effekt wurde durch die zusätzliche Abwesenheit von ICAM-1 verstärkt (Abb. 11, Abb. 12, Tabelle 5). Die Adhäsion von Plättchen war nicht beeinflusst (Abb. 13). Die Inhibition der Thrombozytenadhäsion mittels Tirofiban, ei-nem GPIIb/IIIa-Inhibitor (Abb. 14), reduzierte die Leukozytenadhäsion und die links-ventrikuläre Dysfunktion (Abb. 15, Tabelle 5). Während in ICAM-1/P-Selektin-defizienten Herzen die direkte Rekrutierung von Leukozyten stark eingeschränkt war, konnte diese durch die Infusion von Wildtyp-Plättchen nahezu vollständig wiederher-gestellt werden. Die Inhibition der Plättchenadhäsion durch die zusätzliche Gabe von Tirofiban konnte diesen Effekt wieder aufheben (Abb. 19). Unsere Experimente de-monstrieren erstmals die Rolle des thrombozytären P-Selektins und des ß3-Integrins GPIIb/IIIa als redundanten Rekrutierungsmechanismus für die thrombozyten-vermittelte postischämische Leukozytenrekrutierung in vivo. Über diesen redundanten Mechanismus tragen Thrombozyten indirekt zum Reperfu-sionsschaden bei, indem sie die postischämische Leukozytenadhäsion verstärken. Diese thrombozyten-vermittelte Leukozytenadhäsion benötigt P-Selektin-suffiziente Plättchen, nicht jedoch endotheliales P-Selektin. Die Antagonisierung von GPIIb/IIIa, die in Patienten effektiv ist für die Thrombolysehandlung31, PTCA177 und Stent-Implantation10, 149, 203, inhibiert sowohl die Plättchenadhäsion als auch thrombozyten-vermittelte Leukozytenrekrutierung. Im experimentellen Modell der akuten myokardialen Ischämie und Reperfusion zeigte die GPIIb/IIIa-Antagonisierung eine protektive Wirkung über die Plättchen-Inhibition hinaus, in dem sie den durch plättchen-vermittelte Leukozytenrekrutierung induzier-ten akuten Reperfusionsschaden reduzierte. In einem weiteren Schritt wurde ein chronisches Mausmodell der myokardialen Ischämie und Reperfusion etabliert, um die Auswirkungen einer reduzierten Leukozy-tenadhäsion auf den chronischen postischämischen Reperfusionsschaden zu unter-suchen und mit alternativen Behandlungsmethoden zu vergleichen. WT-Tiere und ICAM-1-defiziente Tiere wurden einer einstündigen LAD-Okklusion unterzogen, ge-folgt von 14 Tagen Reperfusion. Anschließend wurde die linksventrikuläre Funktion mittels invasiver Millar-Tip Kathetermessung analysiert. 24 Stunden nach Ischämie wurden 3*106 in vitro expandierte embryonale EPC (eEPC) systemisch in WT-Tiere oder ICAM-1-defiziente Tiere infundiert. In zwei weiteren WT-Gruppen wurden auto-loge Progenitorzellen und mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark mobilisiert mittels Gabe von 0,5µg GM-CSF 7 Tage vor Ischämie bzw. direkt postischämisch. In den ICAM-1-defizienten Tieren war der postischämische Funktionsverlust im Ver-gleich zu den WT-Kontrollen etwa im gleichen Maß verringert wie bei den eEPC-behandelten Tieren (Abb. 22 Abb. 23, Abb. 24). Unter reduzierter Leukozytenredukti-on in den ICAM-1-defizienten Tieren zeigte sich ein zusätzlicher benefizieller Effekt durch die Behandlung mit eEPCs (Abb. 22 Abb. 23, Abb. 24). DiI-markierte eEPCs konnten histologisch im Infarkt-Areal in enger Nachbarschaft mit Blutgefäßen nach-gewiesen werden (Abb. 28). Die Adhäsion von Leukozyten und der damit verbundene leukozyten-assozierte Re-perfusionsschaden ist durch die Defizienz von ICAM-1 auch im chronischen Ischä-mie/Reperfusionsmodell vermindert. Embryonale EPCs sind in der Lage in ischämisches Areal einzuwandern, zu inkorpo-rieren und protektiv auf die postischämische Funktion zu wirken. Sie können so über einen längeren Zeitraum als Quelle für parakrine, angiogenese-fördernde, humorale Aktivatoren wie z. B. Thymosin-ß4 den Remodellingprozess unterstützen und führen somit zu einer verbesserten postischämischen Funktion. Die Adhäsion von embryonalen EPCs scheint dagegen unabhängig von ICAM-1 zu sein. Hier spielen Selektine211, 1-Integrine57, 141 und indirekt auch Thrombozyten118 eine wesentliche Rolle. Die präischämische Mobilisation von hämatopoetischen Progenitorzellen aus dem Knochenmark mittels GM-CSF hatte in unserem Modell eine vergleichbar protektive Wirkung wie die eEPC-Behandlung oder die Antagonisierung der Leukozytenadhäsi-on durch ICAM-1-Defizienz, während die postischämische Applikation den posti-schämischen Funktionsverlust nicht verbesserte (Abb. 25, Abb. 26, Abb. 27). Die Zytokin-Applikation zeigte bei rechtzeitiger Applikation vor Beginn der Ischämie eine protektive Wirkung. Dieses Protokoll ist allerdings nicht in der Klinik anwendbar. In weiteren Studien wird es notwendig sein, den optimalen Zeitpunkt und die optima-le Dosis zu evaluieren und mögliche Co-Applikation, z. B. Stromal-Cell-Derived-Factor-1, zur Verbesserung der Rekrutierung und zur Effizienzsteigerung zu untersu-chen, um knochenmark-stimulierende Zytokine als erfolgversprechende Behand-lungsalternativen im akuten Koronarsyndrom am Menschen einsetzen zu können.

Es wurden zwei tierexperimentelle Versuchsaufbauten erarbeitet: 1.Die ex vivo perfusion isolierter Nieren von Macaca Fascicularis mit poliklonalem ATG 2.Perfusion der unteren Extremität von Macaca Fascicularis mit menschlichem Blut in einem geschlossenen Perfusionssystem Mit Hilfe der o.g. Aufbauten wurden folgende Fragestellungen untersucht: 1.Bindet poliklonales ATG im xenogenen konkordanten Modell an Strukturen der Niere von Macaca Fascicularis und 2.wird diese Bindung durch verlängerte Ischämiezeit moduliert? 3.Binden mononukleäre Zellen (Lymphozyten, Monozyten) an Gefrierschnitte der Niere von Macaca fascicularis und 4.wird diese Bindung durch vorherige Behandlung der mononukleären Zellen mit polyklonalem ATG moduliert? 5.Beeinflusst die Behandlung mit polyklonalem ATG das Adhäsionsverhalten menschlicher Lymphozyten bei der konkordanten Xenotransplantation und 6.gibt es diesbezüglich Unterschiede zwischen ATG-Fresenius und ATG-Mérieux? 7.Beeinflusst die Behandlung mit anti- IL-2 Rezeptor Antikörpern das Adhäsionsverhalten menschlicher Lymphozyten bei der konkordanten Xenotransplantation? 8.Ist die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG einer verzögerten Therapie im vorliegenden Ansatz überlegen? Die Ergebnisse im ersten Versuchsaufbau waren: 1.Polyklonales ATG bindet im konkordanten Modell Mensch zu Macaca Fascicularis nicht an Strukturen der Niere. 2.Eine verlängerte Ischämiezeit hat keinen Einfluss auf die Bindung von polyklonalem ATG an Strukturen der Niere von Macaca Fascicularis. 3.Mononukleäre Zellen binden nicht an nach kurzer Ischämiezeit entnommene, Gefrierschnitte der Niere von Macaca Fascicularis. 4.Eine vorherige Behandlung der Zellen mit polyklonalem ATG beeinflusst dieses Bindungsverhalten nicht. Die Ergebnisse im zweiten Versuchsaufbau waren: 1.Ohne vorherige Behandlung des menschlichen Blutes kommt es bereits nach etwa 15 Minuten zu einer weitgehend vollständigen Adhäsion humaner Leukozyten an das Gefäßendothel von Macaca Fascicularis. 2.Die Zugabe von polyklonalem ATG nach vollständiger Leukozytenadhäsion führt zu einer partiellen Aufhebung der Leukozyten-Endothel Interaktion. 3.Durch die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG kann im vorliegendem Versuchsaufbau eine Leukozyten-Endothel Bindung in 4 von 6 Fällen vollständig, und in 2 Fällen nahezu vollständig verhindert werden. 4.Die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG ist im vorliegenden Versuchsaufbau einer zeitversetzten Therapie überlegen. 5.Die prophylaktische Therapie mit anti- IL-2 Rezeptor Antikörpern hat im vorliegenden Versuchsaufbau keine positiven Effekte auf die Leukozyten-Endothel- Interaktion. Folgende klinische Hypothesen lassen sich aus den durchgeführten Experimenten ableiten: 1.Polyklonales ATG vermittelt keine direkte Wirkung durch Bindung an das Gewebe der Niere, unabhängig von der Ischämiezeit des transplantierten Organs. 2.Die prophylaktische Therapie mit polyklonalem ATG ist wirksam bei der Verhinderung zellulärer Abstoßungsreaktionen und verbessert das Transplantatüberleben durch Vermeidung einer Immunisierung.

96 Der hepatische Ischämie-Reperfusionsschaden stellt ein relevantes klinisches Problem nach Lebertransplantation und Leberteilresektion sowie nach hämorrhagischem Schock dar. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, daß Thrombozyten an der Ausbildung des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens beteiligt sind. Bislang liegt jedoch keine Studie vor, in welcher die Mechanismen der Interaktion von Thrombozyten mit dem postischämischen hepatischen Endothel in vivo analysiert wurden. Insbesondere ist nicht geklärt, inwiefern diese Interaktion die Induktion und den Schweregrad des hepatozellulären Schadens beeinflußt. Ziele der Studie waren daher (1) die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion nach hepatischer I/R mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie systematisch in Abhängigkeit von der Ischämie- und Reperfusionszeit quantitativ zu analysieren, (2) zu untersuchen, welche Mechanismen die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion in der Leber vermitteln und (3) zu analysieren, welchen Einfluß diese Interaktion auf den Ischämie-Reperfusionsschaden der Leber hat. An einem etablierten murinen Modell der warmen hepatischen Ischämie-Reperfusion wurde die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion mittels intravitaler Videofluoreszenzmikroskopie untersucht. Thrombozyten wurden von separaten syngenen Spendertieren isoliert, ex vivo mit Rhodamin-6G markiert, intravenös zu den jeweiligen Reperfusionszeitpunkten appliziert und bezüglich ihrer Interaktion mit dem Endothel der hepatischen Mikrogefäße quantitativ analysiert. Zur begleitenden Analyse des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens wurden die sinusoidale Perfusionsrate, die Aktivität der Leberenzyme GOT/GPT im Serum und die Apoptosemarker Caspase-3- Aktivität und Anzahl TUNEL-positiver Zellen im Lebergewebe bestimmt. Durch Verwendung P-Selektin-defizienter Tiere (sowohl Thrombozytenspender als auch Thrombozytenempfänger) wurde die Rolle von endothelialem vs. thrombozytärem PSelektin für die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion untersucht. Des weiteren wurde versucht, durch Applikation eines Fibrinogen-Antikörpers die differentielle Bedeutung von Thrombozyten im Vergleich zu Leukozyten an der Ausbildung des Organschadens der Leber nach I/R in vivo aufklären. Es konnte gezeigt werden, daß hepatische Ischämie-Reperfusion eine Interaktion von Thrombozyten mit dem Endothel in präsinusoidalen Arteriolen, Sinusoiden und postsinusoidalen Venolen induzierte. Das Ausmaß dieser Interaktion war von der Ischämiedauer abhängig, während hingegen die Reperfusionsdauer keinen wesentlichen Einfluß hatte. Die vermehrte Thrombozytenadhäsion ging mit einem signifikanten Anstieg des mikrovaskulären und zellulären Organschadens einher. Untersuchungen an P-Selektin-defizienten Tieren demonstrierten, daß das endotheliale und nicht das thrombozytäre P-Selektin das Rollen und die nachfolgende Adhärenz von Thrombozyten in Arteriolen und Venolen der Leber vermittelte. Darüberhinaus war der postischämische Organschaden in P-Selektin-defizienten Tieren signifikant reduziert. Mittels der Blockade von Fibrinogen während der Reperfusionsphase konnte gezeigt werden, daß Fibrin(ogen) die postischämische Thrombozytenadhäsion vermittelte, an der Leukozytenadhärenz jedoch nicht beteiligt war. Die selektive Hemmung der Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion führte zu einer signifikanten Reduktion des mikrovaskulären Schadens sowie der Apoptoseinduktion in der Leber nach Ischämie- Reperfusion. Somit demonstriert diese Studie erstmals in vivo, daß den Thrombozyten bei der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens eine wichtige Bedeutung zukommt.