Podcasts about mutagenesestudie

Das Einkomponentensystem CadC in Escherichia coli zählt zur Gruppe der ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren und aktiviert bei niedrigem pH-Wert die Expression des cadBA-Operons, einem Säure-induzierbaren Lysin-Decarboxylase-System. Transkriptionsregulatoren der ToxR-Familie zeichnen sich durch einen gemeinsamen modularen Aufbau aus und bestehen aus einer periplasmatischen Sensordomäne, einer Transmembranhelix und einer zytoplasmatischen Effektordomäne. Die Signalwahrnehmung, -weiterleitung und -verarbeitung erfolgt bei den ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren innerhalb eines einzelnen Proteins. Die molekularen Mechanismen der Reizwahrnehmung durch CadC sind bekannt, die Signalweiterleitung und -verarbeitung im Zytoplasma sind hingegen weitgehend ungeklärt. In CadC ist ein zytoplasmatischer Linker (51 Aminosäuren) essentiell für die Signaltransduktion von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Signalweiterleitung von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne untersucht. Mit Hilfe der Kernspinresonanzspektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Linkerregion unstrukturiert vorliegt. Im Rahmen einer umfangreichen Mutagenesestudie wurde beobachtet, dass sowohl eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutionen (Veränderungen der Ladung, der Rigidität oder der Wahrscheinlichkeit zur Bildung einer α-Helix) als auch die Verlängerung des CadC-Linkers zu keiner funktionellen Beeinträchtigung führte. Jedoch wurde die Signalverarbeitung im Zytoplasma durch Verkürzung des Linkers modifiziert und verursachte ein invertiertes Expressionsprofil des Zieloperons cadBA oder die Entkopplung der Expression vom externen pH. Der Linkerregion in CadC konnte keine Rolle in der Oligomerisierung zugeordnet werden. Unabhängig vom Linker wurde in einer in vivo Interaktionsstudie eine pH-abhängige Interaktion (pH < 6,8) zwischen CadC-Monomeren gezeigt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Röntgenkristallstruktur (2,0 Ångström) und in einem parallelen Ansatz die NMR-Struktur (0,46 backbone RMSD) der zytoplasmatischen Effektordomäne in CadC als erste dreidimensionale Struktur der DNA-Bindedomäne eines ToxR-ähnlichen Regulators aufgeklärt. In der Struktur von CadC1-107 wurde ein „winged Helix-Turn-Helix“-Motiv aus der Familie der OmpR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren beobachtet. Im Gegensatz zu der Topologie bereits gelöster OmpR-ähnlichen Regulatoren enthält CadC am Übergang von DNA-Bindedomäne und Linkerregion einen zusätzlichen β-Strang (β-Strang 7), welcher sich stabilisierend auf die DNA-Bindung auswirken könnte. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der DNA-Bindemechanismus von CadC an den cadBA-Promotor untersucht. In in vitro Versuchen zur Bindung von löslichen CadC-Varianten an DNA konnte eine sehr geringe Dissoziationsrate beobachtet werden. Somit ist nicht die Affinität zur DNA sondern die Stimulus-abhängige Interaktion von CadC mit der α-Untereinheit der RNA-Polymerase essentiell für die Aktivierung des cadBA-Operons. Außerdem wurden, basierend auf der Kristallstruktur der DNA-Bindedomäne von CadC Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Die Aminosäure His66 in der Erkennungshelix α3 ist an der Interaktion mit der großen Furche der DNA beteiligt, während die Aminosäuren Lys95 und Arg96 die Interaktion mit der kleinen Furche der DNA vermitteln. Die Ergebnisse dieser Arbeit postulieren ein Modell zur Signalverarbeitung in CadC, in welchem die Signalwahrnehmung im Periplasma zu konformationellen Veränderungen des unstrukturierten CadC-Linkers führt und somit die räumliche Positionierung der DNA-Bindedomänen im CadC-Dimer ermöglicht wird.

Zu Beginn dieser Arbeit wurde DJ-1 erstmals mit der PK in Zusammenhang gebracht. Die ersten Studien zeigten, dass L166P, eine Punktmutation im C-Terminus des DJ-1-Proteins, und eine Deletion von Exon 1-5 zu den Mutationen gehören, die zu den motorischen Fehlfunktionen, den Kardinalsymptomen, im Parkinsonpatienten führen. Diese Arbeit konnte dazu beitragen die Funktion von DJ-1 besser zu verstehen bzw. die Auswirkungen des Fehlens von DJ-1 aufzudecken. Es stellte sich heraus, dass die Expression von L166P im Vergleich zu [wt]DJ-1 sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten stark reduziert war. Die stark verminderte Proteinexpression kann entweder durch eine erhöhte Instabilität der RNA, durch eine Störung in der Proteinsynthese oder einen beschleunigten Abbau hervorgerufen werden. Durch semiquantitative RT-PCR- und quantitative RT-PCR-Experimente konnten Instabilitäten der RNA ausgeschlossen werden. Eine ineffektive Translation konnte durch „Pulse-Chase“-Experimente und CHX-Inhibitorstudien ebenso entkräftet werden. Allerdings scheint ein gesteigerter Abbau von [L166P]DJ-1 verantwortlich für dessen reduzierte Expression zu sein. Die Art des beschleunigten Abbaus konnte zwar nicht zweifelsfrei geklärt werden, aber es zeigte sich, dass ein Zusammenhang zwischen der Stabilität und der Struktur von DJ-1 besteht. Dabei spielt die C-terminale Domäne eine große Rolle, die nur im DJ-1-Protein als signifikante Helix-Knick-Helix Struktur vorhanden ist, nicht aber unter seinen Strukturhomologen. In einer Mutagenesestudie konnte gezeigt werden, dass im Helix-Knick-Helix Motiv nicht nur die PK-assoziierte Mutante L166P, sondern auch die Helix-brechende Mutante V169P in derselben Helix (G-Helix) und eine Deletion am Knick des Motivs (deltaN173/G174) eine Destabilisierung von DJ-1 bewirken konnte. Helix-brechende Mutationen in der H-Helix zeigten keine verminderte Proteinexpression im Vergleich zu [wt]DJ-1. Die G-Helix-brechenden Mutanten scheinen das Protein konformationell so zu verändern, dass keine Dimerisierung mehr möglich ist, was aus Co-IP Studien hervorging. Das Helix-Knick-Helix Motiv, welches einen Großteil der Dimerberührungsfläche ausmacht, scheint bei der Dimerisierung eine entscheidende Rolle einzunehmen. Weiterhin konnte ein direkter Zusammenhang der Stabilität und Integrität von DJ-1 und seiner Funktion herausgearbeitet werden. Dabei sind die G-Helix-brechenden Mutanten unter oxidativem Stress weniger zytoprotektiv und können in (anti)-apoptotischen Signalwegen eine Expression von apoptotischen Genen nicht verhindern. Diese Prozesse sind abhängig vom oxidativen Stress und von der Fähigkeit von redox-sensitivem DJ-1 als Intermediator in apoptotischen Signalwegen antioxidative Gene zu aktivieren. Diese Erkenntnis ist vor allen Dingen in reaktiven Astrozyten von Wichtigkeit, die Neurone, in Parkinsonpatienten besonders die dopaminergen Neurone, vor oxidativem Stress schützen können. In reaktiven Astrozyten ist DJ-1 in großen Mengen lokalisiert und scheint die Aktivierung von Verteidigungssystemen wie GSH zu beeinflussen. Somit ist DJ-1 ein wichtiger Marker für erhöhten oxidativen Stress, nicht nur in der PK, sondern auch bei Schlaganfallpatienten. Eine erhöhte Produktion von DJ-1 würde einen größeren Schutz vor neuronalem Sterben bewirken, so dass dies auch therapeutische Möglichkeiten eröffnen könnte.

Während der Abspaltung von der E. coli-Linie wurde durch die Aufnahme der Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 der Grundstein für die Entwicklung vom Kommensalen zum Pathogen gelegt. Die hier kodierten Effektoren vermitteln ebenso wie einige außerhalb von SPI1 gelegene Effektoren (z. B. SopE2) zentrale Virulenzeigenschaften. Zusätzlich zu diesen konservierten Genen gibt es einige variable Effektoren wie SopE, die erst in jüngerer Zeit erworben wurden und auch heute noch durch horizontalen Transfer zwischen verschiedenen Salmonella-Stämmen weitergegeben werden. Sie dienen wahrscheinlich der Optimierung der Wechselwirkung mit dem Wirt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die G-Nukleotidaustauschfaktoren SopE und das zu 69 % homologe SopE2 eine differenzielle Substratspezifität gegenüber den RhoGTPasen Cdc42 und Rac1 besitzen. Während SopE und SopE2 vergleichbar gut an Cdc42 binden, wird Rac1 von SopE deutlich stärker gebunden als von SopE2. Die schwächere Bindung von Rac1 an SopE2 führt in der Folge zu einer deutlich schwächeren Aktivierung von Rac1. Zellkulturversuche haben gezeigt, dass diese biochemischen Unterschiede zumindest in einigen Zelltypen zu unterschiedlichen Antworten (z. B. Morphologie des Aktinzytoskeletts) führen. Es ist zu vermuten, dass die Unterschiede der molekularen Eigenschaften von SopE und SopE2 einen Selektionsvorteil für S. typhimurium-Stämme darstellen, die beide SopE-Homologe besitzen. Bei der Analyse der Kristallstruktur des SopE ⋅Cdc42-Komplexes zeigte sich, dass SopE eine von der Struktur zellulärer GEFs unabhängige Lösung gefunden hat, den Nukleotidaustausch an RhoGTPasen zu katalysieren. In einer Mutagenesestudie konnten diejenigen Aminosäuren identifiziert werden, die das katalytische Zentrum von SopE bilden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen dafür, dass das katalytische Zentrum von SopE durch das 166 GAGA 169 -Motiv repräsentiert ist. Dieses Motiv weist keine Ähnlichkeiten zur katalytischen DH-Domäne eukaryontischer Rho-GEFs auf. Das deutet darauf hin, dass SopE durch konvergente Evolution entstanden sein muss. In ähnlicher Weise wie in dieser Arbeit könnten auch in Eukaryonten durch funktionelle Analysen noch weitere, bisher unbekannte GEF-Familien identifiziert werden, deren Untersuchung das Verständnis der zellulären Signaltransduktionswege weiter fördern könnte.