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Das Einkomponentensystem CadC in Escherichia coli zählt zur Gruppe der ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren und aktiviert bei niedrigem pH-Wert die Expression des cadBA-Operons, einem Säure-induzierbaren Lysin-Decarboxylase-System. Transkriptionsregulatoren der ToxR-Familie zeichnen sich durch einen gemeinsamen modularen Aufbau aus und bestehen aus einer periplasmatischen Sensordomäne, einer Transmembranhelix und einer zytoplasmatischen Effektordomäne. Die Signalwahrnehmung, -weiterleitung und -verarbeitung erfolgt bei den ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren innerhalb eines einzelnen Proteins. Die molekularen Mechanismen der Reizwahrnehmung durch CadC sind bekannt, die Signalweiterleitung und -verarbeitung im Zytoplasma sind hingegen weitgehend ungeklärt. In CadC ist ein zytoplasmatischer Linker (51 Aminosäuren) essentiell für die Signaltransduktion von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Signalweiterleitung von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne untersucht. Mit Hilfe der Kernspinresonanzspektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Linkerregion unstrukturiert vorliegt. Im Rahmen einer umfangreichen Mutagenesestudie wurde beobachtet, dass sowohl eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutionen (Veränderungen der Ladung, der Rigidität oder der Wahrscheinlichkeit zur Bildung einer α-Helix) als auch die Verlängerung des CadC-Linkers zu keiner funktionellen Beeinträchtigung führte. Jedoch wurde die Signalverarbeitung im Zytoplasma durch Verkürzung des Linkers modifiziert und verursachte ein invertiertes Expressionsprofil des Zieloperons cadBA oder die Entkopplung der Expression vom externen pH. Der Linkerregion in CadC konnte keine Rolle in der Oligomerisierung zugeordnet werden. Unabhängig vom Linker wurde in einer in vivo Interaktionsstudie eine pH-abhängige Interaktion (pH < 6,8) zwischen CadC-Monomeren gezeigt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Röntgenkristallstruktur (2,0 Ångström) und in einem parallelen Ansatz die NMR-Struktur (0,46 backbone RMSD) der zytoplasmatischen Effektordomäne in CadC als erste dreidimensionale Struktur der DNA-Bindedomäne eines ToxR-ähnlichen Regulators aufgeklärt. In der Struktur von CadC1-107 wurde ein „winged Helix-Turn-Helix“-Motiv aus der Familie der OmpR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren beobachtet. Im Gegensatz zu der Topologie bereits gelöster OmpR-ähnlichen Regulatoren enthält CadC am Übergang von DNA-Bindedomäne und Linkerregion einen zusätzlichen β-Strang (β-Strang 7), welcher sich stabilisierend auf die DNA-Bindung auswirken könnte. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der DNA-Bindemechanismus von CadC an den cadBA-Promotor untersucht. In in vitro Versuchen zur Bindung von löslichen CadC-Varianten an DNA konnte eine sehr geringe Dissoziationsrate beobachtet werden. Somit ist nicht die Affinität zur DNA sondern die Stimulus-abhängige Interaktion von CadC mit der α-Untereinheit der RNA-Polymerase essentiell für die Aktivierung des cadBA-Operons. Außerdem wurden, basierend auf der Kristallstruktur der DNA-Bindedomäne von CadC Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Die Aminosäure His66 in der Erkennungshelix α3 ist an der Interaktion mit der großen Furche der DNA beteiligt, während die Aminosäuren Lys95 und Arg96 die Interaktion mit der kleinen Furche der DNA vermitteln. Die Ergebnisse dieser Arbeit postulieren ein Modell zur Signalverarbeitung in CadC, in welchem die Signalwahrnehmung im Periplasma zu konformationellen Veränderungen des unstrukturierten CadC-Linkers führt und somit die räumliche Positionierung der DNA-Bindedomänen im CadC-Dimer ermöglicht wird.

Zystische Fibrose ist die häufigste vererbbare letale Erkrankung in Europa, die trotz Fortschritten in Diagnostik und Therapie weiterhin mit einer verkürzten Lebenserwartung einhergeht. Einer der Hauptgründe verfrühter Sterblichkeit betroffener Patienten sind persistierende pulmonale Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa. Der Keim bedient sich des Quorum Sensing (QS), eines interbakterielles Kommunikationssystems, um die Ausbildung von Virulenzfaktoren zu regulieren und die Immunantwort des Patienten zu beeinflussen. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung des P. aeruginosa QS Moleküls 3oxoC12-HSL auf die Reifung humaner Dendritischer Zellen (DZ) untersucht. DZ vermitteln als professionelle Antigen-präsentierende Zellen zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem. Eine Infektion wurde simuliert, indem humane DZ mit Lipopolysaccharid oder Zytokin-Cocktail aktiviert wurden. Anschliessend wurde die Expression von Maturations- und Migrationsmarkern sowie Zytokinsekretion in Anwesenheit von 3oxoC12-HSL untersucht. Bei LPS-stimulierten DZ kam es in Anwesenheit von 3oxoC12-HSL zu einer erniedrigten Expression der Reifungsmarker CD80, CD86, CD83, CD40, HLA-DR, sowie der Migrationsmarker CD184 (CXCR4) und CD197 (CCR7). Die Coinkubation mit Zytokin-Cocktail und 3oxoC12-HSL ergab eine Herabregulierung der Maturationsmarker CD80, CD86 und HLA-DR. Auf unstimulierte DZ zeigte 3oxoC12-HSL keinen Effekt, das Oberflächenmarker-Expressionsprofil dieser Zellen glich dem unreifer DZ. 3oxoC12-HSL inhibierte auch die Sekretion der pro-inflammatorischer Zytokine IL-12, IFN-gamma, MIP-1alpha, TNF-alpha durch LPS- bzw. Zytokin-Cocktail-gereifte DZ. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass 3oxoC12-HSL die Reifung von DZ unterdrückt und somit das Zustandekommen einer effektiven Immunantwort verhindert wird.

Herpesviren exprimieren Micro-(mi)RNAs, welche die Expression von zellulären und viralen Genen beeinflussen. Das Genom des Kaposi Sarkom Assoziierten Herpesvirus (KSHV) kodiert ein Cluster von insgesamt 12 miRNAs, welche sowohl während der latenten, als auch während der lytischen Infektion exprimiert werden. Da bisher nur sehr wenige zelluläre Zielgene für KSHV miRNAs bekannt sind, war es das Ziel dieser Studie, Gene zu identifizieren, deren Expression durch virale miRNAs von KSHV beeinflusst wird. Zu diesem Zweck wurden KSHV miRNAs mit Hilfe eines lentiviralen Transduktionssystems in B-Zellen und in Endothelzellen exprimiert. Diese sind beide natürliche Wirtszellen für KSHV. Die dabei entstandenen Zelllinien wurden mit Hilfe von zwei unterschiedlichen experimentellen Ansätzen untersucht: Beim ersten Ansatz wurde das gesamte Expressionsprofil dieser Zellen mit Hilfe von Microarrays analysiert und, nach Filterung durch bioinformatische Methoden, wurden Kandidaten für eine Regulation durch virale miRNAs identifiziert. Das Ergebnis wurde anhand biochemischer Methoden validiert und zwei zelluläre Transkripte als Zielgene bestätigt. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass KSHV miRNAs die Caspase 3 inhibieren und dadurch die Zellen vor Apoptose schützen. Im zweiten, weitaus effizienteren Ansatz, wurden die sogenannten RISC-Komplexe mit Hilfe von AGO2-spezifischen Antikörpern sowohl aus den KSHV miRNA exprimierenden Zellen als auch aus latent KSHV infizierten Zellen isoliert und die daran gebundenen mRNAs identifiziert. Der RISC-Komplex spielt die entscheidende Rolle bei der miRNA-induzierten Regulation und enthält neben Proteinkomponenten (u.a. Argonauten (AGO)-Proteinen) sowohl die aktiven miRNAs als auch die regulierten mRNAs. Nach Isolierung der gebundenen RNAs konnten mit dieser Methode 72 Gene als Zielgene für KSHV miRNAs identifiziert werden. Viele davon spielen eine wichtige Rolle in unterschiedlichen Prozessen wie Zellzykluskontrolle, in der Apoptose oder der mRNA-Prozessierung. Insgesamt 11 identifizierte Zielgene wurden mit Hilfe von real-time PCRs untersucht und 10 bestätigt. Mittels 3’UTR-Luciferase-Assays wurden 6 davon weiter analysiert und bestätigt. Für die Gene LRRC8D, NHP2L1 und GEMIN8 konnten die zuständigen KSHV miRNAs und die dazugehörigen Bindungsstellen auf dem Transkript identifiziert werden. Bei den letzteren beiden lagen diese interessanterweise nicht wie erwartet in der 3’UTR, sondern in dem kodierenden Bereich.

Polytraumatisierte Patienten entwickeln eine systemische Entzündungsreaktion (systemic inflammatory response syndrome, SIRS), die entscheidend den klinischen Verlauf der Patienten determiniert. Zahlreiche Untersuchungen weisen dem Immunsystem dabei eine zentrale steuernde Funktion zu, wobei die initialen Triggermechanismen der traumabedingten Immunantwort bisher unbekannt ist. Obwohl den Monozyten dabei eine führende Rolle zugesprochen wird, sind die hierfür verantwortlichen intrazellulären Steuerungsmechanismen, insbesondere die Signaltransduktion, die Transkription sowie die Modulation der Translation von inflammatorisch wirksamen Proteinen bislang nur ansatzweise aufgeklärt. Ziele der vorliegenden Untersuchungen waren daher: i) zu überprüfen, ob es überhaupt spezifische, Trauma-responsive mRNA Expressionsmuster in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der frühen posttraumatischen Phase gibt, ii) in einem zweiten Schritt zu untersuchen, ob es darüber hinaus Genexpressionsprofile gibt, die in Abhängigkeit von klinischen Parametern einer signifikant unterschiedlichen Expression unterliegen iii) und schließlich diese identifizierten Faktoren auf ihre biologisch funktionelle Rolle im Organismus zu untersuchen Mittels Affymetrix Oligonukleotid Microarray (22.000 Probe Sets, 14.500 Gene) wurde eine Genom-weite mRNA Expressionsanalyse in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbar posttraumatischen Phase (0h-72h) durchgeführt und in einem mehrstufigen biostatistischen Verfahren mit klinischen Einflussfaktoren korreliert. Zur Überprüfung der biologischen Funktion der identifizierter Genexpressionsprofile wurden biologisch-funktionelle Pathway Analysen mittels Ingenuity Pathway Systems durchgeführt. Um das erste Teilziel zu erreichen wurde eine unsupervised-Analyse anhand der ermittelten Microarray Daten durchgeführt. Zentrales Kriterium der unsupervised Analyse ist nun der Variationskoeffizient eines einzelnen Faktors/Gens. Somit lassen sich diejenigen genetischen Expressionsprofile identifizieren, die durch das gemeinsame klinische Ereignis „Trauma“ zu einer gemeinsamen Expressionsänderung angeregt wurden. Dabei fanden sich 318 Probe Sets (280 Gene) signifikant durch das klinische Ereignis „Trauma“ verändert. Somit lässt sich anhand der vorliegenden Studie die Fragestellung i) klar dahingehend beantworten, dass Trauma-sensitive Gene Zeichen der gleichsinnigen Aktivierung bzw. Deaktivierung zeigen können. Um die Teilfragestellung ii) zu beantworten, wurden die Patienten im Anschluss in klinisch relevante Gruppen unterteilt. Führende Zielparameter waren dabei zunächst die Quantifizierung der anatomischen Verletzungsschwere quantifiziert mittels Injury Severity Score (ISS). In den so gruppierten Datensätzen fanden sich interessanterweise 295 Probe Sets (273 Gene), hochsignifikant verschieden exprimiert in Patienten mit einem ISS > 40 im Vergleich zu weniger schwer verletzten Patienten (ISS < 40 Punkte). Eine ähnliche supervised- Analyse wurde anhand des Kriteriums „Massive Substitution von Erythrozytenkonzentraten“ (>10 EKs/24h) berechnet. Dabei fanden sich 224 Probe Sets (205 Gene) differentiell exprimiert. Besonders interessant zeigten sich die Ergebnisse der supervised-Analyse nach Einteilung der Patienten anhand der Ausprägung eines Multiorganversagens. 660 Probe Sets (642 Gene) waren bei Patienten mit Anzeichen eines solchen (MOF Score ≥4 Punkte) hochsignifikant differentiell exprimiert im Vergleich zu Patienten ohne klinische Hinweise auf ein manifestes Multiorganversagen (MOF-Score < 4 Punkte). Schließlich konnten in einer weiteren supervised-Analyse 763 Probe Sets (696 Gene) identifiziert werden, deren Expression je nach dem, ob der Patient das Trauma überlebt hatte, oder im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben war, erneut ein hochdifferentiell unterschiedliches Expressionsprofil aufweisen. Somit lässt sich Fragestellung ii) dahingehen beantworten, dass es tatsächlich spezifische Genxpressionsmuster gibt, die durch verschiedene klinische Situationen, wie z.B. die Verletzungsschwere, Massentransfusionen, die Entwicklung eines Multiorganversagens oder das endgültige klinische Outcome induziert werden können. Zur Beantwortung der Fragestellung iii) wurden Pathway Analysen durchgeführt. Dieses Instrumentarium fasst den derzeitigen Stand der wissenschaftlichen Erkenntnisse in einer groß-dimensionierten Software zusammen und zeigt die biologisch-funktionellen Beziehungen der einzelnen Faktoren auf. Dabei fanden sich für die klinische Entität der Verletzungsschwere vor allem Gene, die bei der oxydativen Phosphorylierung von Proteinen eine Rolle spielen, als differentiell exprimiert. Patienten, die einer massiven Bluttransfusion zugeführt werden mussten, zeigen eine signifikant andere Regulation des Ubiquitin-C Pathways als Patienten mit geringerem Transfusionsbedarf. Bei polytraumatisierten Patienten, die im Beobachtungszeitraum Anzeichen eines Multiorganversagens entwickelten, zeigte die Pathway Analyse Software eine unterschiedliche Regulation des Ephrin Rezeptor Pathways. Betrachtet man schließlich das Datenset der Outcome-klassifizierenden Gene, so fällt auf, dass Patienten mit positivem klinischen Outcome eine hochsignifikant andere Expression der PPAR-Signalkaskade aufweisen im Vergleich zu Patienten, die im späteren posttraumatischen Verlauf verstorben waren. Somit lässt sich Fragestellung iii) dahingehend beantworten, dass in der Tat einzelnen, biologisch relevanten, funktionellen Gruppen spezifische, klinische Ereignisse zugeordnet werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt somit erstmals, dass es Trauma-responsive, hochspezifische mRNA Expressionsmuster und Signalkaskaden in Monozyten polytraumatisierter Patienten in der unmittelbaren posttraumatischen Phase gibt, die nicht nur mit dem Ausmaß des Traumas, sondern auch mit dem klinischen Verlauf des Patienten hochsignifikant korrelierbar sind.

Die Microarray-Technik stellt eine sehr neue Technologie dar, die zwei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken besitzt. Zum einen ist durch Fluoreszenzmarkierung eine kompetitive Hybridisierung möglich, so daß die behandelte Probe und die zugehörige Kontrolle in einem Experiment unter exakt gleichen Bedingungen untersucht werden können. Der noch größere Vorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Expression mehrerer tausend Gene gleichzeitig untersuchen zu können. In diesem Kapitel wurde der Einfluß verschiedener Strahlenarten (UV-C, γ-, Protonen- und C6+-Ionen-Strahlung) auf die Expression von Hefegenen getestet. In einem ersten Schritt wurden für die verschiedenen Noxen die äquitoxischen Dosen ermittelt, um die Strahlenarten miteinander vergleichen zu können. Als Kontrolle wurde zusätzlich zu den verwendeten Strahlenarten der Einfluß der alkylierenden Chemikalie MMS auf die Expression untersucht. Hierzu liegt bereits eine publizierte Arbeit vor (Jelinsky and Samson, 1999), mit der die hier erzielten Ergebnisse verglichen werden konnten. Fünf der zehn am stärksten induzierten Gene wurden bereits von Jelinsky und Samson als stark induzierbar (Faktor >10) beschrieben. Die Diskrepanz bei den fünf restlichen Genen könnte trotz weitgehender Adaption des „Jelinsky“- Protokolls durch die Verwendung eines anderen Stammes oder durch die unterschiedliche Microarray Technik (hier cDNA-Arrays, bei Jelinsky und Samson Oligonukleotid-Arrays) erklärbar sein. Eine Wiederholung der Hybridisierung ergab, daß die Expressionsunterschiede von den zehn am stärksten induzierten Genen im ersten Experiment im Wiederholungsexperiment in neun Fällen bestätigt werden konnten. Interessanterweise ließen sich sieben dieser Gene in drei Gruppen einordnen, die räumlich auf dem Chromosom direkt benachbart angeordnet sind und vermutlich koreguliert werden. Während bei MMS-behandelten Zellen die stärksten Expressionsunterschiede beobachtet wurden, zeigten sämtliche verwendete ionisierende Strahlenarten einen geringen Effekt auf das Expressionsprofil. UV-Strahlung bewirkte ein intermediäres Expressionsmuster bezüglich der Transkriptmengen - es waren deutlich mehr Gene induziert bzw. reprimiert als bei den ionisierenden Strahlenarten, wohingegen im Vergleich zur MMS-Behandlung signifikant weniger Expressionsveränderungen festgestellt wurden. Die Analyse der Gene mit stark veränderten Transkriptmengen ergab, daß viele Gene, deren Induktion nach Bestrahlung bereits früher publiziert worden ist, hier nicht als induzierbar gefunden wurden. Mehrere Faktoren könnten dafür verantwortlich sein: Niedrig exprimierte Gene (viele der DNAReparaturgene sind niedrig exprimiert!) sind wie bei vielen anderen Methoden der Expressionsmessung schwer detektierbar. Zudem können geringe Expressionsunterschiede (kleiner Faktor zwei) bislang nicht festgestellt werden. Ferner konnten aufgrund des zeitlichen Rahmens meines Aufenthalts am NIEHS alle Hybridisierungen nur einmal (bei γ-Strahlung zweimal) wiederholt werden, wodurch eine statistisch verläßliche Aussage im Fall von geringen Expressionsunterschieden erschwert ist. Daher wurden in diesem Kapitel nur Expressionsunterschiede von mindestens Faktor zwei berücksichtigt. Trotz dieser Schwierigkeiten gibt es einige Indizien, die für eine biologische Relevanz der gezeigten Ergebnisse sprechen. So wurden in mehreren Fällen Genpaare (bzw. -gruppen) identifiziert, deren Transkriptmengen nach Bestrahlung ähnlich stark verändert vorlagen und die bereits früher aufgrund funktioneller Ähnlichkeiten in Genfamilien zusammengefasst wurden (z.B. wurden fünf ribosomale Gene mit mehr als dreifach erhöhter Transkriptmenge nach UV-Bestrahlung gefunden). Außerdem wurden die RNR-Gene bei allen getesteten Strahlenarten als stark induzierbar eingestuft, was aus früheren Expressionsmessungen bereits bekannt ist (Endo-Ichikawa, et al., 1996; Huang and Elledge, 1997; Hurd and Roberts, 1989). Nach UV- und C6+-Ionen - Bestrahlung konnten zudem mit DUN1 und RAD53 zwei Gene als induzierbar eingestuft werden, die an der Signaltransduktion, die zur Induktion der RNR-Gene notwendig ist, beteiligt sind. Schließlich zeigte auch die stichprobenartige Überprüfung der mit Microarrays erzielten Expressionsdaten durch Northern-Hybridisierungen eine gute Übereinstimmung. So konnten die in den drei untersuchten Genen (EGT2, HSP30 und YPR015C) gefundenen Transkriptionsveränderungen nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit MMS verifiziert werden. Neben den Genen mit bekannter Funktion in der DNA-Schadensprozessierung wurden einige Gene identifiziert, die bislang nicht in Verbindung mit DNA-Schädigung gebracht worden sind. So zeigte sich nach Behandlung mit allen untersuchten Strahlenarten (auch MMS) eine deutliche Verringerung der Transkriptmenge des EGT2-Gens, für das eine Rolle in der Zellzykluskontrolle gezeigt wurde (Kovacech, et al., 1996). Eine erhöhte Transkriptmenge wurde für den Leserahmen YLL030C nach UV-,C6+- und γ-Bestrahlung gefunden. Bei sämtlichen verwendeten Strahlenarten wurde eine ebenfalls deutlich erhöhte Transkriptmenge für den Leserahmen YPR015C gezeigt, der aufgrund von Sequenzhomologien als möglicher Transkriptionsfaktor diskutiert wird (Bohm, et al., 1997). Inwieweit Gene, die lediglich bei einer Bestrahlungsart induziert bzw. reprimiert vorlagen, tatsächlich strahlenspezifisch reguliert sind, muß erst durch weitergehende Analysen geklärt werden.