Podcasts about zelltypen

Nierentumoren sind Neubildungen, die in der Niere entstehen und sowohl gutartig, also benigne, als auch bösartig, also maligne, sein können. Diese Tumoren können von verschiedenen Zelltypen und Gewebestrukturen innerhalb der Niere ausgehen, wie dem Nierenparenchym, dem Nierenbecken oder den Blutgefäßen. Sie unterscheiden sich in ihrem biologischen Verhalten, ihrer Wachstumsdynamik und ihren prognostischen Merkmalen. Lerne in dieser Folge alles Prüfungsrelevante zu den wichtigsten Tumorerkrankungen der Niere und neben den theoretischen Kenntnissen kommt natürlich auch die Pflege nicht zu kurz. Damit machen wir dich also wieder fit für deine Prüfungen und die praktische Arbeit auf Station.

Der Nobelpreis für Medizin geht 2024 an die US-Amerikaner Victor Ambros und Gary Ruvkun – für die Entdeckung der microRNAs. Sie steuern mit, wie unsere Gene sich regulieren und warum verschiedene Zelltypen im Körper sich unterschiedlich entwickeln. Martin Gramlich im Gespräch mit Ulrike Till, SWR-Wissenschaftsredaktion.

Zu den Kennzeichen der alternden Zelle gehören genetische Instabilität, Entzündungen, aber auch ein Phänomen, das die Forscherin mitochondriale Dysfunktion nennt: Die Mitochondrien erzeugen Sauerstoffradikale, die in hohen Konzentrationen gesundheitsschädlich sein können. "Deswegen sind diese Organellen so entscheidend für den Alterungsprozess, und für mich eben besonders interessant", sagt Madreiter-Sokolowski. Was die Angelegenheit sokompliziert macht, ist die Tatsache, dass der menschliche Körper aus 200 verschiedenen Zelltypen besteht . Diese Zelltypen altern unterschiedlich schnell. "Wir müssen herausfinden, wann wir am besten Anti-Ageing-Interventionen starten." Was kann ich tun, um länger gesund zu bleiben? Immerhin sind 75 Prozent des Alterungsprozesses durch Lifestyle und Umwelteinflüsse erklärbar. Madreiter-Sokolowski empfiehlt eine Kalorienreduktion von 15 Prozent des Gesamtumsatzes. Begründung: Beim Intervallfasten werden weniger Entzündungsfaktoren ausgeschüttet und bestehende Tumorzellen werden unschädlich gemacht. "Allerdings ist das individuell zu betrachten. Neueste Studien zeigen nämlich, dass Frauen hormonell in Schwierigkeiten geraten können." In dieser Hörgang-Episode haben wir uns außerdem noch über aktuelle therapeutische Konzepte unterhalten, Senolytika und Senomorphika. Ebenfalls Thema ist die Fähigkeit bestimmter Lebewesen, ein hohes Alter zu erreichen; man denke nur an Grönlandwale, Nacktmulle und Fadenwürmer. Nahe liegende Frage: Wie schaffen die das? Das Gespräch mit Prof. Madreiter-Sokolowski ist gleichzeitig ein Besuch an einem bemerkenswerten Wissensstandort: dem neuen Med Campus in Graz.

In dieser neuen Episode möchte ich dir deine Selbstheilungszellen vorstellen und wie du sie in ihrer Funktion perfekt unterstützen kannst. Mesenchymzellen, auch mesenchymale Stammzellen (MSCs) genannt, werden in verschiedenen medizinischen und therapeutischen Kontexten eingesetzt. Hier sind einige der Hauptanwendungsgebiete: 1. Regenerative Medizin: MSCs werden häufig in der regenerativen Medizin verwendet, um Gewebe zu reparieren oder zu regenerieren, das durch Krankheit, Verletzung oder Alterung geschädigt wurde. Sie können zu verschiedenen Zelltypen differenzieren, darunter Knochen-, Knorpel- und Muskelzellen, und fördern die Heilung von Geweben. 2. Orthopädie: In der Orthopädie werden MSCs eingesetzt, um Knochen- und Knorpelschäden zu behandeln. Beispielsweise können sie zur Behandlung von Osteoarthritis oder zur Unterstützung der Heilung nach Knochenbrüchen verwendet werden. 3. Kardiologie: MSCs werden in der Herzforschung untersucht, um Herzgewebe nach einem Herzinfarkt zu regenerieren oder Herzinsuffizienz zu behandeln. 4. Immunmodulation: MSCs besitzen immunmodulatorische Eigenschaften, das heißt, sie können das Immunsystem beeinflussen. Dies macht sie nützlich bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder bei der Verhinderung von Transplantatabstoßungen. 5. Neurologie: Forschung wird auch betrieben, um MSCs zur Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Multiple Sklerose, Schlaganfall oder Rückenmarksverletzungen einzusetzen, da sie das Potenzial haben, neuronale Zellen zu regenerieren und Entzündungen zu reduzieren. 6. Wundheilung: MSCs werden zur Förderung der Wundheilung und zur Behandlung von chronischen Wunden wie diabetischen Fußgeschwüren verwendet. 7. Krebstherapie: Es wird auch erforscht, wie MSCs zur gezielten Abgabe von Medikamenten an Tumorzellen eingesetzt werden können. Die Vielseitigkeit der mesenchymalen Stammzellen macht sie zu einem wertvollen Werkzeug in der modernen Medizin, und die Forschung in diesem Bereich wird weiterhin intensiviert, um neue therapeutische Anwendungen zu entdecken. Ich wünsche dir viele gut Erkenntnisse bei dieser neuen Folge

Zwanzig Jahre ist es her, dass Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler im Human Genome Projekt erstmals das menschliche Genom entschlüsselten. 2,7 Milliarden Dollar und 13 Jahre verschlang das internationale Großprojekt. Heute sind Kosten und Zeit dank neuartiger Technologie auf einen Bruchteil der früheren Werte gefallen. Wenige Stunden und wenige hundert Dollar kostet die vollständige Dechiffrierung des menschlichen Genoms heutzutage. Damit werden hocheffiziente Krebstherapien möglich. Ärzte lesen den Code von Tumoren in Kliniken aus und Computer entwerfen individuelle Medikamente gegen genau diese Zelltypen und Mutationen. Schon kurz danach kann die heilende Therapie verabreicht werden. Darüber sprechen wir mit einer Koryphäe dieser neuen Heilmethode: Christopher Mason Professor für Physiologie und Biophysik an der Cornell University in New York. Er gilt als einer der führenden Molekularbiologen der Welt. Fragen stellt auch Dr. Hadi Saleh, CEO von CeramTec. Warum genau sind Kosten und Zeit der Genanalyse so rapide gefallen? Wie funktioniert die Hochgeschwindigkeitsanalyse des Genoms? Wie baut man aus diesen Informationen ein personalisiertes Medikament? Wird Krebs zu besiegen sein? Sind wir die letzte Generation, die Krebs als Todfeind kennt? Ein Viertel aller Todesfälle in Deutschland geht auf Krebserkrankungen zurück. Kann diese Menschheitsgeißel endlich besiegt werden? Eine Folge für alle, die sich für Strategien gegen die drei wichtigsten Killer der Menschheit interessieren (Herz-Kreislaufversagen, Krebs, Atemwegserkrankungen). Und für alle, die das Staunen nicht verlernt haben über die phänomenalen Fortschritte der Genetik und ihrer bahnbrechenden neuen Anwendungen. Und natürlich für alle, die gern länger leben und am liebsten 120 Jahre alt werden würden. Ihnen hat die Folge gefallen? Dann schreiben Sie uns gerne an podcast@hy.co. Wir freuen uns über Post von Ihnen.

Ein Viertel aller Todesfälle in Deutschland ist auf Krebserkrankungen zurückzuführen. Doch durch die neuesten Durchbrüche in der Genforschung besteht nun die Hoffnung auf die endgültige Überwindung dieser Krankheit. Heute schon ist die vollständige Dechiffrierung des menschlichen Genoms möglich. Dies erlaubt es, effiziente Krebstherapien zu entwickeln, bei denen Ärzt:innen den Code von Tumoren lesen und so individuelle Medikamente für spezifische Zelltypen und gegen Mutationen entwerfen können. Experte auf diesem Gebiet ist Christopher Mason, ein renommierter Molekularbiologe von der Cornell University in New York.

Der Ernährungsreport 2023 zeigt: Fleisch und Wurst stehen laut einer repräsentativen Umfrage bei zusehends weniger Menschen in Deutschland täglich auf dem Speiseplan. Etwas mehr greifen dafür regelmäßig zu pflanzlichen Alternativen. „Good News: der Podcast für gute Nachrichten“ ist ein Podcast von Good News. Aufnahme und Redaktion: Bianca Kriel Mehr Good News bekommst du hier: https://goodnews.eu/ Good News ist spendenbasiert, wenn dir unsere Arbeit und dieser Podcast gefallen, kannst du uns hier unterstützen: https://donorbox.org/good-news-app Quellen für den Gute Nachrichten-Überblick: Weniger Menschen in Deutschland essen täglich Fleisch Der Ernährungsreport 2023 zeigt: Fleisch und Wurst stehen laut einer repräsentativen Umfrage bei zusehends weniger Menschen in Deutschland täglich auf dem Speiseplan. Etwas mehr greifen dafür regelmäßig zu pflanzlichen Alternativen. https://www.sueddeutsche.de/panorama/ernaehrungsreport-oezdemir-fleisch-vegetarier-1.6287115 Mülleimer, die wissen, wann sie geleert werden müssen Überfüllte Mülleimer gehören in Berlin zum Alltag. Das könnte sich bald ändern – dank intelligenter Mülleimer. Ausgestattet mit einem Chip können sie die Stadtreinigung informieren, wenn sie voll sind. Für den Bezirk Mitte ist ein Pilotprojekt geplant. In Krefeld und Frankfurt am Main werden die Eimer u. a. bereits getestet. https://www.rbb24.de/panorama/beitrag/2023/10/abfall-eimer-smart-bsr-berlin-muell.html Gehirnatlas ermöglicht neue Einblicke Ein internationales Forschungsprojekt hat den bisher umfangreichsten Atlas des menschlichen Gehirns erstellt und mehr als 3.000 Zelltypen charakterisiert. Die Bilder könnten künftig dabei helfen, Krankheiten wie Parkinson, Epilepsie und Alzheimer zu bekämpfen. https://www.wissenschaft.de/gesundheit-medizin/ein-atlas-des-menschlichen-gehirns/ Rufbusse auf dem Land Deutschlandweit gibt es 80 Rufbussysteme, die den Nahverkehr auf dem Land attraktiver machen sollen. Das Projekt Holibri in Höxter etwa hat die Fahrgastzahlen fast verdreifacht. Mit fünf Elektro-Kleinbussen ohne festen Fahrplan können Fahrten per App oder Telefon gebucht werden. https://www.tagesschau.de/inland/mittendrin/bus-auf-bestellung-hoexter-100.html Kunst für alle in Wien Das Wien Museum überrascht bei seiner Wiedereröffnung am 6. Dezember mit einem neuen Modell: Dauerausstellungen sind kostenlos. Dieses „britische Modell“ ist ein Novum in Österreich und wird von Bürgermeister Michael Ludwig als historischer Schritt gefeiert. https://www.derstandard.at/story/3000000191326/freier-eintritt-im-neuen-wienmuseum Zu erreichen sind wir per Mail: redaktion@goodnews.eu oder unter: https://www.instagram.com/goodnews.eu/ https://twitter.com/goodnews_deu https://www.facebook.com/goodnewsapp01

Die Themen der Wissensnachrichten: +++ archäologisches Team entdeckt eine der ältesten dreidimensionalen Statuen: Ein Mann, der seinen Penis hält +++ Hirnforschung unterscheidet inzwischen 3.000 verschiedene Zelltypen im Gehirn +++ Batterien können jetzt effektiver recycelt werden +++**********Weiterführende Quellen zu dieser Folge:Update ErdeHier berichtet web.de vom Penis-Fund in einer Gabungsstätte in der heutigen Türkei.Brain cell census. 13.10.23Battery metal recycling by flash Joule heating. 27 Sep 2023.First word discovered in unopened Herculaneum scroll by 21yo computer science student, 12.10.2023Evaluating growth in Macrospondylus bollensis (Crocodylomorpha, Teleosauroidea) in the Toarcian Posidonia Shale, Germany. 11 October 2023Annual mass budget of Antarctic ice shelves from 1997 to 2021, Science Advances, 13.10.2023**********Ihr könnt uns auch auf diesen Kanälen folgen: Tiktok und Instagram.

Zwanzig Jahre ist es her, dass Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler im Human Genome Projekt erstmals das menschliche Genom entschlüsselten. 2,7 Milliarden Dollar und 13 Jahre verschlang das internationale Großprojekt. Heute sind Kosten und Zeit dank neuartiger Technologie auf einen Bruchteil der früheren Werte gefallen. Wenige Stunden und wenige hundert Dollar kostet die vollständige Dechiffrierung des menschlichen Genoms heutzutage. Damit werden hocheffiziente Krebstherapien möglich. Ärzte lesen den Code von Tumoren in Kliniken aus und Computer entwerfen individuelle Medikamente gegen genau diese Zelltypen und Mutationen. Schon kurz danach kann die heilende Therapie verabreicht werden. Darüber sprechen wir mit einer Koryphäe dieser neuen Heilmethode: Christopher Mason Professor für Physiologie und Biophysik an der Cornell University in New York. Er gilt als einer der führenden Molekularbiologen der Welt. Fragen stellt auch Dr. Hadi Saleh, CEO von CeramTec. Warum genau sind Kosten und Zeit der Genanalyse so rapide gefallen? Wie funktioniert die Hochgeschwindigkeitsanalyse des Genoms? Wie baut man aus diesen Informationen ein personalisiertes Medikament? Wird Krebs zu besiegen sein? Sind wir die letzte Generation, die Krebs als Todfeind kennt? Ein Viertel aller Todesfälle in Deutschland geht auf Krebserkrankungen zurück. Kann diese Menschheitsgeißel endlich besiegt werden? Eine Folge für alle, die sich für Strategien gegen die drei wichtigsten Killer der Menschheit interessieren (Herz-Kreislaufversagen, Krebs, Atemwegserkrankungen). Und für alle, die das Staunen nicht verlernt haben über die phänomenalen Fortschritte der Genetik und ihrer bahnbrechenden neuen Anwendungen. Und natürlich für alle, die gern länger leben und am liebsten 120 Jahre alt werden würden. Ihnen hat die Folge gefallen? Sie haben Feedback oder Verbesserungsvorschläge? Dann schreiben Sie uns gerne an podcast@hy.co. Wir freuen uns über Post von Ihnen.

Als Stammzellen bezeichnet man Zellen, aus denen durch Zellteilung und Differenzierung viele verschiedene spezialisierte Zelltypen entstehen können. Im erwachsenen Menschen gibt es verschiedenen Arten von Stammzellen in unterschiedlichen Geweben, beispielsweise in der Haut, oder im Knochenmark. Blutstammzellen, die sich auch im Knochenmark finden, sind für die Bildung aller Blutzellen und Zellen des Immunsystems verantwortlich. Wenn es bei der Differenzierung dieser verschiedenen Zelltypen zu Fehlern kommt, kann das die Entstehung von Blutkrebs (Leukämie) zur Folge haben. Neben verschiedenen medikamentösen Behandlungen kann auch eine sog. Stammzelltransplantation für die Therapie von Leukämien eingesetzt werden und ist für die Patient*Innen manchmal die letzte Chance auf Heilung. Bei welchen Blutkrebsarten diese Therapie eingesetzt werden kann, wie das Ganze genau funktioniert und warum jeder von uns sich in Stammzellspenderregistern registrieren lassen sollte, klären wir in unserer heutigen Podcastfolge mit unserem Interviewpartner PD DDr. Philipp Wohlfarth, Transplantationsmediziner vom Wiener AKH. Für Fragen, Anregungen und Kritik zu unserem Podcast könnt ihr uns jederzeit über die österreichischen Webseiten der Firmen Pfizer und Merck, oder über die E-Mail-Adresse krebsbetrifft@merckgroup.com kontaktieren! www.diagnose-krebs.at, www.merck.at, www.pfizer.at

Helmut Pilhar informiert & setzt sich seit über 20 Jahren für die Germanische Heilkunde (GH) nach Dr. Hamer als Alternative zur Schulmedizin ein. Zitat: “Die Schulmedizin – abgesehen von der Notfallsmedizin – ist experimentell!” Sein Ziel: Die GH zur Allgemeinbildung zu machen. In diesem Augen öffnenden Gespräch gehts darum: ► Gesundheit ursächlich in die eigenen Hände zu nehmen ► durch ein holistisches Verständnis von Krankheit als Konflikt Lösungsprogramm des Körpers & Heilungssymptom. Themen: - Wie Ihn die Krebserkrankung seiner Tochter zu Dr. Hamer & der GH führte - Warum die Schulmedizin Hypothesen basiert ist, während die GH ohne Hypothesen auskommt - Die 5 biologischen Naturgesetze nach Dr. Hamer - Warum schulmedizinische Therapien experimentell sind - Unterdrückung der Arbeit von Dr. Hamer durch das (pharmakologische) System - Warum die Schulmedizin keine Krankheitsursachen kennt sondern nur symptomatisch vorgeht - Warum es bei der GH um die Krankheitsursache & ursächliche Therapie geht - Warum jeder Krankheit ein biologischer Schock voraus geht, der den Hamerschen Herd (HH) im Gehirn schafft - Die 3 Kriterien des biologischen Schocks - Warum Statistik nicht nötig ist & man mit Statistik keine Wissenschaft betreiben kann - Warum die GH an jedem beliebigen Patienten reproduzierbar ist ohne Ausnahme - Spontanheilung als erklärtes Ziel - Kostengünstige & Nebenwirkungsfreie alternative Konfliktlösung - Alternatives Erklärungsmodell für Krebs - Warum 'Heilen' nur der Körper kann und man selbst sein bester Therapeut ist - Warum die BH in den Biologieunterricht gehört - 'Lachen' als Zeichen dass der Konflikt gelöst ist - Die 4 verschiedenen Zelltypen und Gehirnareale & deren Zuständigkeit & Konfliktbereiche - Faustregel: Länge Heilungsphase = Konfliktphase - Programmierte unbewusste Konfliktschienen durch Trauma - Heilung als Bewusst werden und Abändern des Konflikt Programms - Psyche, Gehirn und Organ als untrennbare Einheit - Ohne Konfliktlösung keine Heilung - Krankheit als verstehbares Sinnvolles Biologische Sonderprogramms (SBS) - SBS als Reaktion auf Konflikt: Sympathikotonie & Vagotonie - Alternatives Erklärungsmodell für Mikroben: Pilze, Bakterien, Viren(?) als Chirurgen - Die epileptische Krise in der Heilungsphase - Menschliche Medizin: Warum wir keine Tierversuche mehr brauchen - Hypothese Immunsystem - Warum wir keine Angst mehr vor Krankheit brauchen (nur vor der Ursache) - Was unsere Händigkeit aussagt, und warum Sie anders sein könnte als wir denken - Unsere Körperhälften und deren Bedeutung: Partner- und Mutter-/Kindseite - Die Bedeutung von männlicher / weiblicher Hormonlage beim Konflikt - DIe Auswirkungen der 'Pille' - Virologie mit Identitätskonflikt: Die 4 Koch'schen Postulate - Warum die GH bisher nie widerlegt - nur bestätigt wurde ► Helmut Pilhar: https://germanische-heilkunde.at/ HAFTUNGSAUSSCHLUSS: Die hier veröffentlichten Inhalte dienen ausschließlich der neutralen Information & allgemeinen Weiterbildung. Sie stellen keine Empfehlung oder Bewerbung der beschriebenen oder erwähnten Methoden dar. ---------------- ★★ SHARING = CARING if this episode was valuable, please review & share with others who could benefit from this information too! TY! ★★ SIGN UP for free workshops & more: https://simonrilling.com/newsletter --

In dieser Episode geht es um die neuesten Erkenntnisse aus der Schlafforschung und wie du durch deinen Lifestyle Einfluss auf deine Genetik nehmen kannst. Heute geht es um die Schlafforschung und die Epigenetik. Der Begriff "Epigenetik" ist zusammengesetzt aus den Wörtern Genetik und Epigenese, der Entwicklung eines Lebewesens. Epigenetik gilt als das Bindeglied zwischen Umwelteinflüssen, Lifestyle und Genen. Gene werden an- und abgeschaltet. Die Epigenetik - und damit dein Lifestyle - bestimmt mit, unter welchen Umständen welches Gen angeschaltet wird und wann es wieder stumm wird. Der Mensch hat mehr als 200 Zelltypen und in fast jeder Zelle ist dieselbe DNA-Sequenz, aber nicht in jeder Zelle sind alle Gene aktiv. Die primäre Information, die einen Menschen ausmacht, ist die Gensequenz, sonst wären eineiige Zwillinge sich nicht so ähnlich. Doch epigenetische Veränderungen sorgen dafür, dass nur ein Zwilling anfälliger für z.B. Diabetes wird. Spanische Forscher haben eineiige Zwillinge zwischen drei und 74 Jahren untersucht. Was sich herausgefunden haben: Die jüngsten Zwillinge unterschieden sich in ihrem epigenetischen Code kaum. Die ältesten Zwillinge sehr. Im Laufe des Lebens machen Zwillinge unterschiedliche Dinge durch, entwickeln andere Gewohnheiten, z.B. viel oder wenig Zucker essen, sich oft oder wenig bewegen - oder befinden sich in anderen Lebensumständen. So entwickeln sich auch ihre epigenetischen Codes in verschiedene Richtungen. Der unterschiedliche Lifestyle hat dafür gesorgt. Die Bücher 
 - Das Uhrwerk der Natur – wo es um die Chronobiologie, also unsere natürlichen Rhythmen geht, - Wake-up! In dem es darum geht, dass wir alle ausgeschlafener werden, also gut schlafen, - Der zweite Code! Wo Peter Spork erklärt, wie wir unsere Gene über einen gesunden Lifestyle auf gesund bleiben stellen können. - Gesundheit ist kein Zufall: Wo es darum geht, was genau Einfluss auf unsere Gesundheit hat und wie wir alles zum Gute wenden können. - Und schließlich sein neuestes, extrem spannendes Buch: Die Vermessung des Lebens! Wie uns die Systembiologie dabei hilft, Krankheiten zu verhindern, bevor sie entstehen. ziehen einen wunderbaren Kreis um das Thema, um das es in diesen drei Episoden geht: Wie legen wir heute den Grundstein für eine hohe Lebensqualität im Alter? Fernab von chronischen Krankheiten, schmerzenden Gelenken und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Wie schaffen wir es auch mit 70, 80, 90, 100 so fit so sein, dass wir diese letzten Jahre genießen können. Dass wir eben nicht im Pflegeheim landen, weil wir uns nicht mehr selbst helfen können. Nicht auf einen Rollator angewiesen sind, sondern noch wandern oder auf Reisen gehen? Was ich dir mit all meinem Wissen, das ich habe sagen kann: die starke Basis für all das legen wir heute! Jetzt! Im letzten Teil haben wir besprochen, welchen Einfluss die Chronobiologie, die Rhythmik unseres Körpers auf unsere Gesundheit hat. Zum Ende der Episode sind wir in ein zweites großes Thema eingestiegen: die Schlafforschung. Ich starte in diesem 2. Teil mit einer Frage, die du dir sicher auch schon oft gestellt hast. Viel Spaß!

HISTO 2: Zelle - Bevor man wirklich anfangen kann, über den Aufbau von Geweben zu reden, müssen wir erstmal besprechen, aus Gewebe überhaupt aufgebaut sind. Meistens sind dafür die Zelltypen entscheiden, die alle ähnlich aufgebaut sind. Um euch damit nicht zu verwirren, geht's in dieser Folge darum, was man in so einer Zelle so findet - neben Kraftwerken, Poststationen und vieles mehr... Alle Angaben ohne Gewähr.

Die Nachfrage nach Fleischprodukten steigt sowohl in Ländern der Europäischen Union als auch global weiterhin an - und dies trotz Lebensmittelskandalen, schlechten Haltungsbedingungen der Tiere und desaströsen Arbeitsbedingungen für die Angestellten der fleischverarbeitenden Industrie. An sogenanntes In-vitro-Fleisch sind viele Hoffnungen geknüpft: die Herstellung von In-vitro-Fleisch kommt ohne Massentierhaltung aus, benötige weniger Fläche und sei insgesamt umweltfreundlicher. Aber wie wird In-vitro-Fleisch eigentlich hergestellt? In Teil 2 erläutere ich die für die In-vitro-Fleischproduktion verwendeten Zelltypen. Welche Arten von Zellen kommen in Frage? Wie wird die Zellproliferation und -differenzierung gesteuert? Und wird für die Herstellung von In-vitro-Fleisch eigentlich Gentechnik angewendet?

Hey, schön, dass Du wieder dabei bist. Heute gibt es noch einmal einen kleinen Einblick in das Fach Biologie, genauer gesagt in die Immunbiologie. Ich werde Dir zunächst alle Zelltypen vorstellen und Dir anhand einer erklärten Immunreaktion, ihre Verbindungen zueinander darstellen. Anschließend stelle ich Dir die unpezifische und die spezifische Immunantwort vor, damit Du die Unterschiede kennst und diese voneinander differenzieren kannst. Ich hoffe, dieser kleine Einblick in die Immunbiologie hilft Dir für die Abitur-Vorbereitung im Fach Biologie. Dein Name als Unterstützer am Anfang jeder Podcast-Folge? Ich werde Dich am Anfang der nächsten Podcast-Folge namentlich aufführen. Wenn Dir der Podcast zu einem besseren Gefühl oder einer besseren Note verholfen hat, dann freue ich mich über Deine Unterstützung, damit können wir sicherstellen, dass wir weiterhin für Dich tolle Lerninhalte präsentieren können. Mit Paypal kannst Du uns mit folgendem Link unterstützen: paypal.me/abiturcrashkurs Auch mit einer Bewertung bei Apple Podcasts oder einer lieben Nachricht von Dir kannst Du uns gern unterstützen ❤

Stammzellen sind faszinierende Zellen : Sie können sich ein Leben lang teilen und sich in alle verschiedenen Zelltypen des Körpers entwickeln. Sammeln sie jedoch Fehler in ihrem Erbgut an, können sie zu gefährlichen Krebsstammzellen mutieren und Krebs und Metastasen verursachen. Professor Andreas Trumpp untersucht seit vielen Jahren den Zusammenhang zwischen Stammzellen und Krebs. Gerade hat er für seine Arbeiten den Deutschen Krebspreis erhalten. Im BIH-Podcast spricht er über neue Erkenntnisse, wie man die Krebsstammzellen als Wurzel der Krebserkrankung bekämpfen könnte.

Der Molekularmediziner Prof. Eckhard Wolf hält das Vorgehen japanischer Forscher, mittels Chimärenzucht menschliche Organe zu gewinnen, für nicht aussichtsreich. "Denn letztlich ist die Entstehung eines Organs ein sehr komplexer Prozess, der darauf basiert, dass sich eben verschiedene Zelltypen miteinander austauschen.", so Wolf.

Folge 013 - Pflanzliche Festigungsgewebe: Kollenchym und Sklerenchym Show Notes: Bitte unterstützt den Biologie Passion Podcast finanziell ➤ paypal.me/biologiepassionpdcst Hier gehts zum zugehörigen Blogartikel auf meiner Webseite. Wenn dir die Podcastfolge gefallen hat, würde mich eine kurze Bewertung auf iTunes freuen. Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst. Vielen Dank fürs Zuhören!

Folge 008 - Zelltypen von Pflanzen | Aufbau und Funktion Show Notes: Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst! 

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Live vom 33. Chaos Communication Congress aus Hamburg zeichnen wir unsere 20. Folge auf. Am Podcast-Tisch des Sendezentrums nimmt Adrian mit den beiden Gästen Matthias (war schon dabei in Folge D, Folge F, Folge R) und Lars vom Auf-Distanz Podcast live vor Publikum auf. Dabei geht es um folgende 3 Themen mit dem Anfangsbuchstaben T: - Eigentlich erwartet man keine große Innovationen beim Luftanhalten. Dennoch hat sich der Sport rund ums /*/Tauchen/*/ stets professionalisiert. Matthias berichtet über die ersten Tauchaparaten, die von Da Vinci entwickelt wurden bis hin zu modernsten Methoden zur Flüssigatmung und den Problemen von ausgasenden Stoffen in der Blutbahn. - /*/Transit/*/ bedeutet erstmal nur, dass etwas an etwas anderem vorbeizieht. In der Astronomie meint man damit, dass ein Himmelskörper vor einem anderen herwandert und ihn somit teilweise Verdeckt. Lars ist Hobby-Astronom und beschreibt die Grundlagen des Transits allgemein - und im speziellen am Beispiel des Merkurtransit. - Wir nehmen unsere Umwelt über viele Sinne wahr. Ein sehr wichtiger Part wird vom /*/Tastsinn/*/ übernommen. Dabei kommen vier verschiedene Zelltypen in einer Menge verschiedener Kombinationen zum Einsatz. Adrian erklärt wie wir überhaupt tasten und welchen Part davon welcher Zelltyp übernimmt. Wir wünschen viel Spaß beim Nachhören dieser Live-Produktion.

Im komplexen System der Funktionsweise von Thrombozyten werden auch dem Cholesterin der thrombozytären Zellmembran verschiedenste Funktionen zugeschrieben. Es hält die Zelle als wichtiger Membranbestandteil flexibel und beweglich und reichert sich bevorzugt in lipid rafts an. Durch die Anreicherung in diesen cholesterinreichen Domänen nimmt es Einfluss auf das clustering bestimmter Membranrezeptoren oder auf die transmembranöse Signalvermittlung und trägt auf diese Weise wesentlich zur Organisation und Funktionalität der Zellmembran bei. Dass der Cholesteringehalt der Zellmembran auch Einfluss auf die Bildung von Mikropartikeln hat, konnte in dieser Arbeit erstmals nachgewiesen werden. Die Cholesterinbeladung führte zu einem höheren Anstieg der Mikropartikelanzahl als die Cholesterindepletion der Thrombozytenmembran. Durch die zusätzliche Einwirkung von Scherkräften im Kegel-Platten-Viskosimeter konnte die rein passive Generierung von Mikropartikeln noch erhöht werden. Hier waren die meisten Mirkopartikel ebenfalls in der Gruppe der cholesterinbeladenen Thrombozyten zu finden. Im TDT-Test spiegelte sich die höhere Anzahl von Mirkopartikeln in der Gruppe der cholesterinbeladenen Thrombozyten in einer verkürzten Gerinnungszeit gegenüber den cholesterindepletierten Plättchen wider. Insgesamt zeigte sich die Thrombingenerierung durch Veränderung des Cholesteringehaltes der Plättchenmembranen jedoch verlangsamt. Während eines Flussversuchs über VWFdA1 bildeten mit Cholesterin beladene Thrombozyten bei einer Scherrate von 10.000s-1 durchschnittlich längere tether aus als cholesterindepletierte Thrombozyten. Dies spricht dafür, dass der Cholesteringehalt die Flexibilität der Thrombozytenmembran insgesamt beeinflusst und damit auch die Adhäsion zum Zytoskelett, so wie es bereits für andere Zelltypen beschrieben wurde. Cholesterinbeladene Thrombozyten exprimierten im ruhenden Zustand mehr P-Selektin als cholesterindepletierte Thrombozyten. Während die P-Selektin-Expression der cholesterindepletierten Plättchen durch das Einwirken von Scherkräften deutlich gesteigert wurde, kam es bei den cholesterinbeladenen Thrombozyten zu keinem weiteren Anstieg. Dies deutet auf eine gestörte Degranulation der Thrombozyten durch Cholesterinbeladung hin, bzw. auf eine „Aktivierung“ der Thrombozyten trotz Blockierung der klassischen Aktivierungskaskaden. Ob die bei uns unter experimentellen Bedingungen in vitro beobachteten Phänomene auch die generell erhöhte Aktivität der Thrombozyten von Patienten mit Hypercholesterinämie, sowie die bei dieser Erkrankung bestehende erhöhte Anzahl von Mirkopartikeln erklären kann müssen weitere Studien klären.

Eine effektive Regulation der Gewebedurchblutung erfordert eine Koordination der Reaktion einzelner Gefäßzellen bzw. verschiedener Gefäßabschnitte. Der zur Koordination erforderliche interzelluläre Signalaustausch kann zumindest teilweise über Gap Junction-Kanäle erfolgen, die als interzelluläre Verbindungen den Austausch von elektrischen und chemischen Signalstoffen zwischen benachbarten Zellen ermöglichen. Dieser Austausch kann über die Modulation der Permeabilität von Gap Junction-Kanälen reguliert werden. Aus Untersuchungen an Modellzellen (HeLA-Zellen) war bereits bekannt dass NO eine solche Modulatorwirkung ausübt, wenn die Gap Junctions nur Connexin 37 (Cx37) enthalten während kein Effekt von NO auf Gap Junctions zu beobachtet war, wenn Gap Junctions aus Cx43 oder Cx40 gebildet wurden. Da Endothelzellen normalerweise alle drei Connexine exprimieren, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, inwieweit NO in diesen Zellen überhaupt eine nachweisbare Wirkung auf die Gap Junction Permeabilität und damit auf den Signalaustausch entfaltet. Als Modell des Signalaustauschs wurde die Ausbreitung von Calciumwellen jeweils zwischen Endothelzellen oder glatten Muskelzellen allein oder zwischen beiden Zelltypen untersucht. Nach Auslösung von interzellulären Calciumwellen als Folge einer mechanischen Stimulation von einzelnen Zellen konnte zunächst gezeigt werden, dass die interzelluläre Ausbreitung von Calcium unter den gewählten Versuchsbedingungen über Gap Junctions-erfolgte. Im Gegensatz zum Modellsystem der HeLa Zellen, in denen nur Cx37 exprimiert war, zeigte NO in den Endothelzellen (humane Nabelschnur, alle drei Connexine exprimiert) abgesehen von einer geringradigen Verzögerung keinen Hemmeffekt auf die Gap Junction-abhängige Ausbreitung von Calcium-Signalen. Wurde jedoch Cx43 durch Behandlung mit siRNA herunterreguliert, führte NO auch in den Endothelzellen zu einer Hemmung der interzellulären Calciumwellenausbreitung. Auch in intakten Endothelzellen, die mit glatten Muskelzellen kokultiviert wurden, ließ sich bei genauerer Analyse ein Hemmeffekt von NO nachweisen. Dieser war jedoch auf die Zellbereiche beschränkt, in denen Endothelzellen und glatte Muskelzellen unmittelbar benachbart waren (myoendotheliale Junctions). In diesen myoendo-thelialen Gap Junctions, fanden wir auf der Endothelseite immunhistochemisch überwiegend Cx37 exprimiert. Aufgrund dieser präferentiellen Lokalisation von Cx37 scheint daher NO eine besondere Rolle bei der Modulation des Calciumaustauschs (und potentiell auch anderer Signalmoleküle wie IP3 oder cyclische Nukleotide) zu spielen. Die Kontrolle des Calciumaustauschs könnte funktionell eine calciumabhängige glattmuskuläre Kontraktion bei Endothelstimulation verhindern und somit die endothelabhängige Dilatation verstärken. Diese bisher unbekannte NO-Wirkung auf Cx37-exprimierende Gap Junctions könnte einen weiteren Mechanismus der Gefäßtonusregulation darstellen.

Die diabetische Nephropathie ist derzeit weltweit der häufigste Grund für die terminale Niereninsuffizienz mit einem Anteil von einem Drittel aller Fälle. Im Verlauf der diabetischen Nephropathie kommt es zu einer zunehmenden Glomerulosklerose. Die Fähigkeit der parietalen Epithelzelle zur Ausbildung von extrazellulärer Matrix und ein möglicher Beitrag zur Glomerulosklerose ist bislang unklar. Daher sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle bei der diabetischen Nephropathie vermehrt extrazelluläre Matrix bildet und dadurch die Bowman’sche Kapsel verdickt. Diese Frage wurde unter Verwendung einer immortalisierten murinen parietalen Epithelzelllinie und einer primären humanen parietalen Epithelzelllinie im Zellversuch und Stimulation dieser Zellen mit hoher Glukosekonzentration (30mM), TGF-β1 und „advanced glycation endproducts“ nachgegangen. Außerdem wurde retrospektiv die Bowman’sche Kapsel von sechs humanen Nierenbiopsien mit diabetischer Nephropathie per Licht- und Transmissionselektronen-mikroskopie untersucht. Im ersten Schritt war die Aktivierung der parietalen Epithelzelle unter diabetischer Kondition Fokus der experimentellen Untersuchung. Hier lag ein zellspezifischer Effekt vor. Während für die humanen parietalen Epithelzellen keine funktionellen oder morphologischen Zeichen der Aktivierung gefunden werden konnte, zeigten murine parietale Epithelzellen eine Aktivierung nach Stimulation mit TGF-β1. Der zweite Schritt bestand in der Untersuchung der Bildung von TGF-β1 in parietalen Epithelzellen. Auch hier konnten unterschiedliche Stimulationseffekte bei den murinen und humanen parietalen Epithelzellen beobachtet werden. Während die humanen parietalen Epithelzellen weder auf Transkriptions-, noch auf Translationsebene eine geänderte Expression zeigten, exprimierten die murinen parietalen Epithelzellen in einem positiven Feedback-Mechanismus auf Transkriptionsebene verstärkt TGF-β1 nach Stimulation mit TGF-β1. Auf Translationsebene konnte eine verstärkte Bildung von TGF-β1 nach Stimulation mit „advanced glycation endproducts“ und eine verminderte Bildung nach Stimulation mit Glukose beobachtet werden. Der dritte Schritt beinhaltete die Untersuchung der Kollagenbildung in den parietalen Epithelzellen und die Vermessung der Bowman’schen Kapsel. Während Glukose in keiner der Zelltypen zu einer Änderung der Kollagengenexpression führte, induzierte TGF-β1 in den humanen und murinen parietalen Epithelzellen eine Hochregulation der Genexpression verschiedener Ketten von Kollagen IV und Kollagen I α 1. „Advanced glycation endproducts“ verstärkten die Transkription der Kollagene in den humanen parietalen Epithelzellen, wohingegen sie diese in murinen parietalen Epithelzellen herunterregulierten. In der retrospektiven histologischen Untersuchung von sechs Patienten mit diabetischer Nephropathie und sechs Vergleichspatienten wurde per Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie die Dicke der Bowman’schen Kapsel vermessen. In den lichtmikroskopischen Messungen zeigte sich für die Patienten mit diabetischer Nephropathie eine signifikant verdickte Bowman’schen Kapsel. Diese Verdickung konnte bei Patienten mit diabetischer Nephropathie in den transmissionselektronenmikroskopischen Messungen bestätigt werden. Letztlich ist die Lichtmikroskopie die geeignetere Messmethode, weil hier eine höhere Anzahl an Glomeruli gemessen werden kann und sie einen Selektionsbias ausschließt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle unter diabetischer Kondition verstärkt extrazelluläre Matrix bildet und diese basal ablagert. In den murinen parietalen Epithelzellen ergaben sich Hinweise auf den Mechanismus der Aktivierung und einen positiven Feedbackmechanismus von TGF-β1 bei der diabetischen Nephropathie. Die Verdickung der Bowman’schen Kapsel ist von klinischer und diagnostischer Bedeutung, da die Ausbildung der parietalen Fibrose viele Funktionen der parietalen Epithelzellen und Bowman’schen Kapsel einschränkt und der Glomerulus letztlich sklerosiert bzw. verödet. Diagnostisch werden künftige Studien den Wert der Dickenmessung der Bowman’schen Kapsel als zusätzliches pathologisches Kriterium der Stadieneinteilung der diabetischen Nephropathie zeigen.

Epithelzellen, die Modell-Zelllinien dieser Dissertation, sind für die Aufteilung und Abtrennung verschiedener Kompartimente eines Organismus zuständig, indem sie sich zu Grenzflächen zusammenschliessen, welche häufig hohen physikalischen Spannungen und Kräften ausgesetzt sind. Um diese physikalischen Kräfte zu verarbeiten oder sie selbst zu produzieren, verwenden Epithelzellen, wie alle anderen Zelltypen auch, das Zytoskelett, das sich im Allgemeinen aus den Komponenten Mikrotubuli, Intermediär-Filamenten und Aktin sowie den damit korrespondierenden Motorproteinen Dynein, Kinesin sowie Myosin zusammensetzt. In dieser Dissertation wird das Zusammenspiel von Aktin und Myosin auf der apikalen Seite von Epithelzellen untersucht. Im Falle von konfluenten Zellen mit vollständig ausgebildeten Zell-Zell-Kontakten sind auf der apikalen Seite der Zellen Mikrovilli zu finden, kleine, mit Aktin-Bündeln gefüllte Ausstülpungen aus der Zelloberfläche, welche für die optimierte Nahrungsaufnahme sowie als Antennen für Signalverarbeitung zuständig sind. Im Zuge der Arbeit konnten wir feststellen, dass sich der Aktin-Myosin-Aufbau auf der apikalen Seite von Einzelzellen ohne Zell-Zell-Kontakte, sogenannten nicht-konfluenten Zellen, grundsätzlich ändert. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und anderen experimentellen Methoden zeigen wir, dass zwar ähnliche Ausstülpungen auf der apikalen Oberfläche von Einzelzellen zu finden, diese jedoch häufig verlängert, gebogen, hoch-dynamisch und oft parallel zur Zellmembran orientiert sind. Wir zeigen mittels molekularbiologischer Methoden, dass ein zusätzliches, innerhalb der apikalen Zellmembran liegendes isotropes Akto-Myosin-Netzwerk für die dynamische Reorganisation der Mikrovilli-Ausstülpungen verantwortlich ist. Der Identifzierung des isotropen Akto-Myosin-Netzwerkes, welches eine der Hauptaussagen dieser Dissertation ist, wird eine detaillierte Analyse der dynamischen Netzwerkreorganisation angefügt, die mittels temporaler und örtlicher Bild-Korrelationsanalysen charakteristische Zeiten und Längen der Dynamik definiert. Des Weiteren entwickeln wir mehrere Bild- Analyseverfahren, allen voran die Methode der iterativen temporalen Bildkorellation sowie des optischen Flusses, wodurch wir eine Oszillation der Netzwerk-Reorganisationsgeschwindigkeit identifizieren und parametrisieren können. Verschiedene, auf Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter optischer Fluss-Bildanalyse basierende Experimente geben Hinweise auf zwei mögliche Erklärungen für die identifizierten Oszillationen. Sowohl Myosin aktivitätsregulierende Proteine als auch spontan auftretende Spannungsfluktuationen im unter Zugspannung liegenden Netzwerk können mögliche Ursachen für die identifizierten Netzwerkoszillationen sein. Obwohl eine eindeutige zelluläre Funktion des apikalen Akto-Myosin-Netzwerkes im Rahmen dieser Doktorarbeit noch nicht identifiziert werden konnte, so können wir aufgrund von verschiedenen Resultaten dennoch postulieren, dass das hier identifizierte Netzwerk eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration und Signaltransduktion einnimmt. Unabhängig davon repräsentiert das hier gefundene Netzwerk die faszinierende Möglichkeit, ein aktives, zweidimensionales Akto-Myosin-Netzwerk nicht nur in vitro, sondern in seiner natürlichen Umgebung studieren und biophysikalische Eigenschaften analysieren zu können.

Ziel dieser Arbeit ist es, die Interaktionsmöglichkeiten von humanen mesenchymalen Stammzellen mit Gliom- und Gliomendothelzellen vor dem Hintergrund eines möglichen Einsatzes von hMSCs als therapeutische Vehikel zu untersuchen. Die Integration von Stammzellen in ein Tumorgefäßsystem soll in vitro mittels tube formation assays quantifiziert werden. Des Weiteren wird darauf eingegangen, inwieweit hMSCs über verschiedene Zellkontaktarten mit Gliomzellen interagieren und welchen Einfluss dies auf beide Zelltypen hat. Der Austausch von Substanzen via gap junctions wird ebenso wie die partielle wie komplette Zellfusion untersucht. Hierzu dienen in-vitro-Färbemethoden und immunzytochemische Ansätze. Weiterführend werden die möglichen Auswirkungen dieser Interaktionen auf zellphysiologische Eigenschaften wie Migration in einem Sphäroidmodell eruiert, das in seinem Aufbauschema näher an den in vivo vorherrschenden Bedingungen liegt als die reine Monolayer- Zellkultur. Zudem wird in vivo das Potenzial von bereits zu therapeutischen Zwecken genetisch modifizierten Stammzellen weiter untersucht sowie die im Anschluss gewonnenen Hirnresektate weiter immunhistochemisch analysiert.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die prinzipielle Fragestellung zu beantworten, ob Stammzellen aus humanen Haarfollikeln in ausreichender Menge expandiert werden können und inwieweit eine Differenzierung in neuroendokrine Zellen möglich ist. Es sollte eine Methode zur Isolierung und Langzeitkultivierung von Haarfollikelstammzellen etabliert und optimiert werden, um eine neue Quelle autologer adulter Stammzellen für zelltherapeutische Ansätze zu gewinnen. Durch Verwendung verschiedener Medien und Beschichtungsarten wurde ein Protokoll entwickelt, aus Dispase-verdauten Hautbiopsien Progenitorzellen zu isolieren. Die auf diese Weise expandierten Zellen wurden mit FACS-Analyse, RT-PCR und Immunhistologie charakterisiert. Im letzten Teil der Arbeit wurde durch Zugabe von spezifischen Faktoren die Fähigkeit zur Differenzierung in unterschiedliche Zelltypen untersucht. Nach Austestung verschiedener Zellkulturbedingungen wurde eine neue Population von Zellen aus der Haarfollikelregion isoliert. Diese Zellen, die als hBSCs bezeichnet wurden, waren über mehr als 30 Passagen mit stabilem Phänotyp kultivierbar (Self-Renewal). Zudem waren sie im Colony-Unit-Assay positiv und zeigten die Expression pluripotenter (Oct4) und multipotenter Stammzellmarker (Nestin, BCRP1, Sox2). Die molekulare Signatur der hBSCs zeigt einige Übereinstimmung mit Merkelzellen, neuroektodermalen Zellen der Haut, die eine Rolle als Mechanorezeptoren und neurosekretorische Zellen der Haut spielen. Unter Verwendung von etablierten Protokollen wurde die Fähigkeit der Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten, glatte Muskelzellen, Neuronen und endokrine Zellen untersucht. Der Nachweis der Entwicklung von glatten Muskelzellen, Neuronen und in eingeschränktem Maße auch Adipozyten belegt die Multipotenz der hBSCs. Darüber hinaus besitzen die hBSCs die Fähigkeit, stimulusabhängig Somatostatin zu exprimieren und zu sezernieren. Somit ist es erstmals gelungen, humane adulte Stammzellen/Progenitorzellen mit neuroendokrinen Eigenschaften zu isolieren. Zusammenfassend ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, eine Methode zu etablieren, mittels derer eine neue Population von humanen multipotenten Stammzellen aus der Haarfollikelregion in Langzeitkultur expandiert werden konnte. Die Plastizität der hBSCs und insbesondere die Differenzierung in reife endokrine Zellen muss in weiteren Studien untersucht werden.

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den durch S-Lost-verursachten Symptomen in der Haut, die zunächst durch starke Blasenbildung und später durch eine verzögerte Wund-heilung charakterisiert sind. Bei S-Lost handelt es sich um einen chemischen Kampfstoff, der erstmals im ersten Weltkrieg zum Einsatz kam und bis heute in vielen internationalen Kon-flikten großen Schaden anrichtete, obwohl der Gebrauch schon 1925 durch die Genfer Konvention verboten wurde. Aktuell stellt S-Lost zudem eine Bedrohung durch terroristische Aktivitäten dar. Da für S-Lost-induzierte Verletzungen bislang keine spezifisch wirksamen Behandlungs-methoden verfügbar sind, besteht großes Interesse an der Aufklärung der dem Krankheitsbild zugrunde liegenden molekularen Pathomechanismen, um daraus Rückschlüsse auf besser ge-eignete therapeutische Maßnahmen ziehen zu können. In unseren ersten Experimenten wurden als mögliche Auslöser der Blasenbildung die Expression und Sekretion ausgewählter Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogenen Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs) in einem 3D-Haut-modell und in verschiedenen Zelltypen der Haut (Keratinozyten, Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen, monozytäre Zellen, PMN-Granulozyten) sowohl in Mono- als auch in Mischkultur untersucht. Unter Verwendung von molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden wie qRT-PCR, Zymographie und Western Blot gelang der Nachweis, dass MMPs - insbesondere MMP-9 - nach Exposition der Zellen (v.a. Fibroblasten und monozytäre Zellen) mit S-Lost deutlich hochreguliert wurden. Zu Erhärtung der Annahme, dass MMP-9 durch Degradation der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis zur Blasenbildung beiträgt, konnte als Pathomechanismus nun erstmals eine parakrine Stimulation von Fibroblasten durch S-Lost-behandelte Keratinozyten identifiziert werden, als deren Folge eine vermehrte MMP-9-Sekretion resultierte. Darüber hinaus zeigte sich in weiteren Versuchen unter Verwendung des sog. Scratch-Assays und eines Transwell-basierten Invasionsassays, dass das Migrations- und Invasionsverhalten der Fibroblasten in Gegenwart des konditionierten Mediums der S-Lost-behandelten Keratinozyten positiv beeinflusst wurde. Aus klinischer Sicht sprechen diese Erkenntnisse für neue therapeutische Ansätze, die darauf beruhen sollten, die S-Lost-induzierte, auf proteolytischer Aktivität basierende Blasenbildung der Haut durch Applikation spezifischer MMP-Inhibitoren zu behandeln. In einem weiteren Projekt wurde die verzögerte Wundheilung als spätes Symptom der S-Lost-Vergiftung auf zellulärer Ebene untersucht, bei der eine eingeschränkte Re-Epithelialisierung der betroffenen Hautstellen beobachtet wird. Sowohl für den Prozess der Wundheilung als auch für die stetige Erneuerung der Haut werden epidermale Stammzellen benötigt, die für die Bildung von Keratinozyten verantwortlich sind. Diese unipotenten Progenitorzellen befinden sich in der basalen Schicht der Epidermis und sind in der Lage zu proliferieren und anschließend terminal zu differenzieren. Um eine Beeinflussung dieser Prozesse durch S-Lost zu untersuchen, wurden primäre unreife Keratinozyten (NHEK) verwendet und hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials untersucht. Dabei erwies sich S-Lost als potenter Induktor der Differenzierung von NHEK, was durch Bestimmung der Expression typischer Markerproteine wie Keratin-1, Involucrin und Loricrin gezeigt wurde. Die Induktion des Reifungsprozesses war sowohl von einem Rückgang der Proliferation als auch von einer verminderten Migrationsrate der Zellen begleitet. Die eingehende Analyse von mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signaltransduktionswegen führte zu der Erkenntnis, dass die Aktivitäten von p38 und ERK1/2 gegenteilige Rollen im Differenzierungsprozess einnehmen. Studien mit spezifischen Inhibitoren der MAPK be¬legten, dass p38 für den Reifungsvorgang in NHEK essentiell ist, während ERK1/2 diesem entgegen wirkt. So konnte durch Blockade von p38 die von S-Lost ausgelöste Differenzierung der Zellen verhindert werden. Ebenso war es durch diese Behandlung möglich, die von S-Lost stark beeinträchtige Migrationsfähigkeit der Keratinozyten wiederherzustellen, welche mit einer erhöhten MMP-1-Expression einherging. Davon abgeleitet erscheint es therapeutisch sinnvoll, selektive p38-Inhibitoren für die Behandlung von Wundheilungsstörungen nach Exposition der Haut mit S-Lost einzusetzen. Zusammenfassend erbrachten unsere Studien also den Nachweis, dass der S-Lost-induzierten Blasenbildung (als frühes Symptom) die spezifische Induktion der MMP-9 zugrunde liegt. Darüber hinaus konnte erstmals eine verfrühte Differenzierung in unreifen Keratinozyten der Haut (als mögliche Ursache für die verzögerte Wundheilung) nachgewiesen werden, wobei die MAPK p38 bei der Initiierung des Prozesses von entscheidender Bedeutung ist. Aufgrund dieser Resultate empfiehlt sich eine kombinierte Applikation von Inhibitoren der Aktivitäten von MMP-9 und p38, wobei der Einsatz jedoch zeitlich abgestimmt erfolgen sollte, um pathologische Effekte (Blasenbildung bzw. Differenzierungsinduktion in Keratinozyten) zu blockieren, ohne die positiven Auswirkungen von MMP-9 und p38 auf die Heilung (Migration von Immunzellen und Keratinozyten bzw. Reepithelialisierung) zu hemmen.

Ich spreche mit der Biochemikerin Tanja Maritzen vom Institut für Chemie und Biochemie der Freien Universität Berlin über den Aufbau und Vorgänge in Säugetierzellen. Dabei geht es darum, welche Teile eine Zelle hat und aus welchen Grundbausteinen diese bestehen. Außerdem beleuchten wir, wie der Signal- und Stoffaustausch innerhalb von Zellen und zwischen Zellen funktioniert, wie sie mit Energie versorgt werden und wodurch sich verschiedene Zelltypen unterscheiden.

AIMS: The proliferative potential of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes is limited, and reasonable yields for novel therapeutic options have yet to be achieved. In addition, various clinical applications will require the generation of specific cardiac cell types. Whereas early cardiovascular precursors appear to be important for novel approaches such as reseeding decellularized hearts, direct cell transplantation may require ventricular cells. Our recent work demonstrated that MesP1 represents a master regulator sufficient to induce cardiovasculogenesis in pluripotent cells. This led to our hypothesis that 'forward programming' towards specific subtypes may be feasible via overexpression of distinct early cardiovascular transcription factors. METHODS AND RESULTS: Here we demonstrate that forced expression of Nkx2.5 similar to MesP1 is sufficient to enhance cardiogenesis in murine embryonic stem cells (mES). In comparison to control transfected mES cells, a five-fold increased appearance of beating foci was observed as well as upregulated mRNA and protein expression levels. In contrast to MesP1, no increase of the endothelial lineage within the cardiovasculogenic mesoderm was observed. Likewise, Flk-1, the earliest known cardiovascular surface marker, was not induced via Nkx2.5 as opposed to MesP1. Detailed patch clamping analyses showed electrophysiological characteristics corresponding to all subtypes of cardiac ES cell differentiation in Nkx2.5 as well as MesP1 programmed embryoid bodies, but fractions of cardiomyocytes had distinct characteristics: MesP1 forced the appearance of early/intermediate type cardiomyocytes in comparison to control transfected ES cells whereas Nkx2.5 led to preferentially differentiated ventricular cells. CONCLUSION: Our findings show proof of principle for cardiovascular subtype-specific programming of pluripotent stem cells and confirm the molecular hierarchy for cardiovascular specification initiated via MesP1 with differentiation factors such as Nkx2.5 further downstream.

Das menschliche Genom ist entschlüsselt, die Regulation aller Genaktivitäten aber noch lange nicht verstanden. Eine weitgehend ungeklärte Rolle spielt dabei die dreidimensionale Anordnung des Erbguts. Professor Thomas Cremer und seinem Team gelang es, alle menschlichen Chromosomen, also einzelne DNA-Moleküle, im Zellkern räumlich darzustellen – in verschiedenen Zelltypen, zu unterschiedlichen Zeiten und bei krankhaften Veränderungen wie Krebs.

Der Transfer von Genen ist eine unverzichtbare Methode für die Erforschung von Genfunktionen in vivo, für die gezielte Expression von Proteinen oder RNA-Molekülen, sowie für die Entwicklung von Gentherapien z.B. gegen Krebserkrankungen oder genetische Defekte. Gerade unter gentherapeutischen Gesichtspunkten sind virale Gentransfervektoren von Interesse, mit deren Hilfe beispielsweise fehlende bzw. eingeschränkte Genfunktionen wiederhergestellt werden können. Ebenso vorstellbar ist der Einsatz viraler Vektoren für Immunisierungen, die z.B. zur Auslösung tumorspezifischer zellulärer Immunantworten führen. Wünschenswert ist in diesem Zusammenhang besonders eine zellspezifische Expression von Transgenen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb lentivirale Vektoren entwickelt, mit deren Hilfe eine konstitutive Genexpression in B-Zellen ermöglicht wurde. Die Beschränkung der Genexpression auf B-Zellen wurde durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Lentivirale Vektoren haben sich in jüngster Zeit zu interessanten Werkzeugen für die Gentherapie sowie zu vielversprechenden Vakzinkandidaten entwickelt. Mit Hilfe dieser Gentransfervektoren können zahlreiche verschiedene Zelltypen, darunter auch hämatopoetische Zellen einschließlich der Immunzellen, in vitro und in vivo transduziert werden, wobei die Spezifität der Antigenexpression auf der Wahl eines entsprechenden Promotors beruht. Als Transgene wurden das verbesserte grün-fluoreszierende Protein eGFP (enhanced green fluorescent protein; im Folgenden als „GFP“ bezeichnet) und das Hühnerei-Albumin (im Folgenden als „OVA“ bezeichnet) exprimiert. Anhand umfangreicher Analysen der GFP-Expression in Knochenmarkschimären konnte die B-Zellspezifität der generierten Vektoren überprüft werden. Desweiteren wurden die lentiviralen Vektoren auch systemisch (intravenös) angewandt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Spezifität der Genexpression mit dieser Applikationsroute erhalten bleibt, wohingegen die Expressionsstärke im Vergleich zu den Chimären erheblich zurückgeht. Funktionelle Studien mit B-zellspezifischen, OVA-kodierenden lentiviralen Vektoren konnten jedoch belegen, dass die Expressionsstärke nach systemischer Anwendung noch ausreichend war, um eine OVA-spezifische zelluläre Immunität zu stimulieren. Damit erwies sich das System auch hinsichtlich möglicher therapeutischer Anwendungen, z.B. als Vakzine, als funktionell. Eine humorale Antikörperantwort gegen virale Hüllproteine bzw. gegen OVA konnte nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend belegen diese Daten, dass die systemische Anwendung B-zellspezifischer lentiviraler Vektoren möglich ist und einen interessanten Ansatz zur Generierung neuer Vakzine bieten kann. Denkbar wäre beispielsweise eine Anwendung bei der Unterstützung therapeutischer Vakzinierungen. Ein weiterer interessanter Aspekt in diesem Zusammenhang ist die Rolle der B-Zelle als antigenpräsentierende Zelle, die mit Hilfe einer temporären Kontrolle der Genexpression genauer untersucht werden könnte. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch ein induzierbares gammaretrovirales Genexpressionssystem entwickelt, um ein gezieltes An- und Abschalten der Genexpression in B-Zellen zu erreichen. Die Beschränkung auf B-Zellen wurde hier ebenfalls durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Detaillierte in vivo-Analysen des Expressionssystems in Knochenmarkschimären zeigten jedoch, dass es einerseits nach Induktion nur zu einer schwachen Transgenexpression kam und es andererseits eine unerwünschte Hintergrundexpression sowohl in B-Zellen als auch in Nicht-B-Zellen gab. Aus diesen Gründen musste von der Anwendung dieses Systems für geplante Studien zur Rolle der Genexpression während verschiedener Stadien der B-Zellentwicklung abgesehen werden.

Wurminfektionen und allergische Reaktionen sind mit einer starken Zunahme von Interleukin-4 (IL-4)-produzierenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems assoziiert. In dieser Arbeit wurden einige grundlegende Eigenschaften IL-4-produzierender Zellen des angeborenen Immunsystems untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Zunahme eosinophiler und basophiler Granulozyten nach Infektion mit dem gastrointestinalen Nematoden Nippostrongylus brasiliensis auf unterschiedliche Art reguliert wird: Basophile Granulozyten nehmen durch eine erhöhte de novo Bildungsrate im Knochenmark zu, während die Anzahl eosinophiler Granulozyten durch eine erniedrigte Apoptoserate in peripheren Organen erhöht wird. Durch Immunfluoreszenzfärbungen N. brasiliensis-infizierter Mäuse konnte hier erstmals gezeigt werden, dass sich beide Zelltypen in der roten Pulpa der Milz nahe der Marginalzone ansammeln, während Mastzellen im Marginalsinus lokalisiert sind. Ferner wurde eine Zunahme eosinophiler und basophiler Granulozyten in der Lamina propria des Dünndarms und in der Lunge festgestellt, wobei basophile Granulozyten gleichmäßig verteilt im Parenchym der Lunge vorliegen, während eosinophile Granulozyten hauptsächlich in perivaskulären und peribronchialen Bereichen lokalisiert sind. Die funktionelle Charakterisierung von basophilen Granulozyten zeigte, dass diese durch sekretorische Produkte von N. brasiliensis-Larven aktiviert werden können, wenn sie zuvor mit Serum infizierter Mäuse sensibilisiert worden waren. Zudem können basophile Granulozyten die alternative Aktivierung von Makrophagen veranlassen und die Zunahme eosinophiler Granulozyten in vivo verstärken. Die Depletion von basophilen Granulozyten zeigte, dass sie an der Eliminierung einer primären und sekundären N. brasiliensis-Infektion entscheidend beteiligt sind. Des Weiteren konnte die Bedeutung von dendritischen Zellen (DC) durch Verwendung von genetisch DC-defizienten Mäusen für die Initiierung einer effizienten Immunantwort gegen N. brasiliensis bewiesen werden. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle von Zellen des angeborenen Immunsystems bei einer Th2-Immunantwort und könnten somit auch zum besseren Verständnis von Th2-assoziierten Krankheitsbildern beitragen.

Die protektive Wirkung von Immunsuppressiva auf den hepatischen I/R-Schaden deutet darauf hin, dass T-Zellen bei diesem alloantigen-unabhängigen Ereignis eine Rolle spielen. Die Mechanismen der Aktivierung bzw. der mikrovaskulären Rekrutierung von CD4+ T-Zellen bei alloantigen-unabhängiger I/R der Leber sind jedoch weitgehend ungeklärt. Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher (1) die Rekrutierung von T-Zell-Subopulationen in den postischämischen hepatischen Mikrogefäßen in vivo zu untersuchen, (2) die Mechanismen einer Interaktion von CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R zu analysieren, (3) die Rolle von CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens zu beurteilen, (4) zu untersuchen, ob die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen MHC Klasse II-abhängig stattfindet und (5) zu analysieren, ob CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R mit Kupffer-Zellen interagieren. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in vivo der Typ, die mikrovaskuläre Lokalisation und die Kinetik der Lymphozyten-Endothelzell-Interaktion während hepatischer I/R intravitalmikroskopisch charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere CD4+ T-Zellen, und nicht CD8+ T-Zellen, während I/R in der hepatischen Mikrozirkulation akkumulieren. Diese Akkumulation tritt hauptsächlich in den Sinusoiden auf, nur zu einem geringeren Teil in den postsinusoidalen Venolen. Bereits nach 30-minütiger Reperfusion ist gegenüber der schein-operierten Gruppe eine signifikante Zunahme der Anzahl akkumulierter CD4+ T-Zellen in den Mikrogefäßen der Leber zu beobachten, die Anzahl emigrierter CD4+ T-Zellen nimmt im Verlauf der Reperfusionszeit signifikant zu. Im Rahmen der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens beteiligt sind. Über CD40L- und CD28-abhängige Signalwege ist die postischämische Akkumulation von Thrombozyten und Leukozyten in der hepatischen Mikrozirkulation von CD4+ T-Zellen abhängig. Darüber hinaus wird die Ausbildung des mikrovaskulären Schadens, gemessen anhand des sinusoidalen Perfusionsdefizites, sowie die Ausbildung des hepatozellulären Schadens, gemessen anhand der hepatischen Transaminasen, CD40L- und CD28-abhängig über CD4+ T-Zellen mediiert. Mittels simultaner Visualisierung zweier Zellpopulationen in vivo konnte in dieser Dissertations¬schrift erstmals nachgewiesen werden, dass CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R kolokalisieren. Unter Verwendung P-Selektin- und CD40L-defizienter Mäuse konnte in vivo nachgewiesen werden, dass eine feste Adhärenz zwischen Thrombozyten und CD4+ T-Zellen über P-Selektin und PSGL-1 vermittelt wird, während die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L eine reziproke Aktivierung unter Thrombozyten und CD4+ T-Zellen bedingen. In einem weiteren Abschnitt dieser Studie konnte unter Verwendung von blockierenden Antikörpern schließlich erstmals in vivo gezeigt werden, dass die im Rahmen der hepatischen I/R stattfindende Aktivierung von CD4+ T-Zellen MHC-Klasse II-unabhängig abläuft. Schließlich wurde in einem weiteren Abschnitt dieser Dissertationsschrift erstmals in vivo nachgewiesen, dass eine reziproke Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R vorliegt. Die Anzahl postischämisch akkumulierter CD4+ T-Zellen ist nicht nur nach vollständiger Depletion von Kupffer-Zellen, sondern auch nach selektiver Unterbindung der Signalwege über TNF-α und IL-6 sowie des Abfangens freier Sauerstoffradikaler signifikant vermindert. Vice versa konnte hier Anhand der Untersuchung der Phagozytoseaktivität von Kupffer Zellen mittels Latex-Beads gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen die Aktivität von Kupffer-Zellen beeinflussen. Weitergehende Untersuchungen zur reziproken Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen konnten unter Verwendung von Durchflusszytometrie zeigen, dass proinflammatorische Mediatoren wie TNF-α und IL-6, vornehmlich freigesetzt durch Kupffer-Zellen während hepatischer I/R, nicht nur direkt aktivierend auf CD4+ T-Zellen wirken, sondern auch sinusoidale Endothelzellen aktivieren können. Eine Aktivierung der sinusoidalen Endothelzellen mit entsprechender Alteration der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, VCAM-1 und VAP-1 stellt wiederum einen pathophysiologischen Mechanismus dar, der mit einer konsekutiven Verstärkung der Akkumulation von CD4+ T-Zellen nach I/R verbunden ist. Zusammenfassend weisen diese in vivo Daten darauf hin, dass hepatische I/R die Akkumulation und Emigration von CD4+ T-Zellen, jedoch nicht von CD8+ T-Zellen induziert. Adhärente CD4+ T-Zellen sind in Sinusoiden mit Thrombozyten kolokalisiert; dies lässt eine gegenseitige Aktivierung beider Zelltypen durch direkten Zellkontakt oder über die Aktivierung des Endothels vermuten. Eine CD4 T-Zell-Defizienz geht mit einer Verminderung der postischämischen Thrombozytenakkumulation und mit einer Reduktion des mikrovaskulären I/R-Schadens einher. Die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in hepatischen Mikrogefäßen wird durch Kupffer-Zellen, wahrscheinlich über die Freisetzung von Sauerstoffradikalen, TNF-α und IL-6, vermittelt.

In der hier durchgeführten Studie „Untersuchungen zur mikrobiellen Besiedlung der Nasenhöhle von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis unter besonderer Berücksichtigung von Staphylococcus aureus und Staphylococcus aureus Small Colony Varianten“ sollte das Keimspektrum der chronischen Rhinosinusitis (CRS) beim Menschen, mit Schwerpunkt auf Staphylococcus aureus (Sa) und seinem Small Colony Variant (SCV) -Phänotyp, untersucht werden. Die chronische Rhinosinusitis (CRS) ist eine häufig vorkommende Erkrankung die bei etwa 5-15 % der Bevölkerung westlicher Industrienationen auftritt. Ihre Ätiologie ist noch unbekannt, allerdings wird als mögliche Ursache eine Infektion mit Bakterien diskutiert. Unter den Bakterien wird dem grampositiven Keim Staphylococcus aureus eine große Bedeutung bei dieser Erkrankung zugeschrieben. In dieser Studie wurden Nasenschleimhautbiopsien und Nasenspülproben von 31 Patienten mit CRS und nasalen Polypen (CRSNP+), 13 Patienten mit CRS ohne nasale Polypen (CRSNP-) und 21 Kontrollpatienten mit verschiedenen mikrobiologischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Studie stellen eine bakteriologische Ursache für die chronische Rhinosinusitis in Frage. Es wird deutlich, dass der normale Phänotyp von Sa keine wesentliche Rolle bei der CRS spielt, da dieser Keim sowohl bei erkrankten als auch bei gesunden Probanden etwa gleich häufig auftrat, bei CRSNP- Patienten sogar in noch geringerer Menge als bei den anderen beiden Gruppen. In keiner der untersuchten Proben konnten SASCV nachgewiesen werden, so dass deren Rolle bei der CRS untergeordnet erscheint. Auf Grund der kleinen Fallzahlen kann von dieser Studie zwar nicht auf die Gesamtbevölkerung geschlossen werden, aber die Ergebnisse geben dennoch Hinweise auf die tatsächliche Situation. Auch bei der Untersuchung der übrigen in den Proben vorkommenden gram-positiven und gram-negativen, aeroben und anaeroben Bakterien konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Beim Vergleich der hier angewandten mikrobiologischen Nachweismethoden, stellte sich heraus, dass die Bakterienkultur im Vergleich zur Real-time PCR und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung die sensitivste Methode war. Die PCR hat allerdings den Vorteil dass auch DNA toter Bakterien nachgewiesen werden kann, und dass sie erheblich schneller durchzuführen ist als die Bakterienkultur. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung an Paraffingewebsschnitten scheint nach den hier vorliegenden Ergebnissen nicht geeignet zu sein, Sa im Gewebe nachzuweisen. Auf diesem Gebiet besteht also noch Bedarf an weiterer Optimierung der Methode an Paraffinschnitten. Neben bakteriologischen Untersuchungen von Patientenproben sollten Auswirkungen des Sa und SASCV- Nachweises auf nasale immunologische Parameter erfasst werden. Hierzu sollte das nasale Zytokinmuster erhoben werden und mögliche Unterschiede der Genexpression bei CRSNP+ Patienten mit Sa- Nachweis untersucht werden. Wie eine Infektion mit Sa bzw. SASCV zelluläre Reaktionen auf Proteinebene beeinflusst und ob Unterschiede zwischen Sa und SASCV in der induzierten Zellantwort bestehen, wurde zusätzlich an humanen monozytären MonoMac-6 Zellen (MM6) und an humanen Atemwegsepithelzellen der Zelllinie BEAS-2B (B2B) untersucht. Eine in vitro Infektion dieser beiden Zelltypen mit verschiedenen Sa- Stämmen führte zu einer unspezifischen Stimulierung der Sekretion aller untersuchten Proteine. Eine Polarisation in Richtung TH1 bzw. TH2, also in Richtung CRSNP- bzw. CRSNP+ konnte nicht festgestellt werden. Auch die Microarrayanalysen von Sa-positiven und Sa-negativen Biopsien von CRSNP+ Patienten zeigen keine vermehrte Expression von Genen für Zytokine die für TH1 oder TH2 polarisieren. Ebenso wurde die Konzentration der in der nasalen Lavage gemessenen Zytokine durch eine Infektion mit Sa nicht beeinflusst und ein TH2 Shift war nicht erkennbar. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass bei der CRS vermutlich zunächst eine Entzündung vorliegt, die dann ggf. die bakterielle Besiedlung fördert, als dass diese Entzündung initial durch eine bakterielle Infektion induziert wird. Es sei aber nochmals darauf hingewiesen, dass hier nur kleine Fallzahlen untersucht wurden. Klarheit könnte eine groß angelegte Studie mit möglichst hohen Patientenzahlen und einer gut charakterisierten Patientenpopulation sowie ggf. die Verwendung molekularer Verfahren zum Nachweis bakterieller Erreger bringen. Diese Studie zeigt, dass eine bakterielle Ursache der CRS unwahrscheinlich ist.

Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Dendritische Zellen (DC) übernehmen essentielle Aufgaben in der Homöostase des Immunsys-tems und in der Induktion von Toleranz oder Immunität. Eine besondere Wechselwirkung findet hierbei zwischen DC und T-Zellen statt, welche durch die Präsentation und Erkennung von Selbstpeptiden, beziehungsweise Fremdantigenen, vermittelt wird. DC spielen eine wichtige Rolle bei der Selektion eines funktionellen T-Zell-Kompartiments im Thymus. In der vorliegenden Stu-die wurde die Funktion der Antigenpräsentation von DC für die Homöostase und die Aktivierung von CD8-T-Zellen in vivo untersucht. Diese Arbeit soll zeigen, dass die Präsentation von Selbstpeptiden auf DC die homöostatische Pro-liferation (HP) von naiven CD8-T-Zellen induziert. Nach der Depletion von T-Zellen durch Be-strahlung oder Antikörpergabe kam es zu einer HP von naiven CD8-T-Zellen. Diese Proliferation war streng MHC-abhängig. Die Expression von MHC-I auf DC reichte aus, um eine komplette HP zu erlauben, welche im Teilungsmuster, der Aktivierungsmarkermodulation und den Proliferati-onsraten jener von proliferierenden Zellen in C57BL/6-Wildtypmäusen glich. Überraschenderwei-se waren CD4-T-Zellen in der Lage, die HP von transferierten naiven CD8-T-Zellen zu inhibieren. Erst durch die Depletion von endogenen CD4-T-Zellen kam es zu Teilungen, während CD25-positive regulatorische T-Zellen keinen Einfluss auf die HP von naiven CD8-T-Zellen ausübten. DC sind essentiell um Toleranz beziehungsweise Immunität nach der Erkennung von Fremdanti-genen zu generieren. Um die Bedeutung der Antigenpräsentation auf DC genauer zu charakterisie-ren, wurde die Immunantwort in einem Mausstamm, in welchem alle Zellen MHC-I tragen zu Tie-ren, in denen nur DC MHC-I exprimieren und somit naive CD8-T-Zellen aktivieren können, un-tersucht. Hierbei wurde deutlich, dass DC ausreichten um Toleranz, als auch Immunität von nai-ven CD8-T-Zellen zu induzieren. Kam es jedoch zu einer differentiellen Antigenpräsentation nach systemischer Administration des Antigens (als Peptid oder Virus in die Blutbahn), waren antigen-präsentierende nicht-DC in der Lage, die Immunantwort abzuschwächen. Dies geschah durch In-duktion von Apoptose, wodurch die Anzahl antigenspezifischer Effektor-T-Zellen verringert und somit auch die Formation des immunologischen Gedächtnisses beeinträchtigt werden konnte. Diese Ergebnisse betonen die enorme Bedeutung der Antigenpräsentation durch DC, weisen aber auch auf die besondere Rolle der Antigenpräsentation durch andere Zelltypen als DC hin, welche in der Lage sind eine Immunantwort deutlich zu modulieren.

In der vorliegenden retrospektiven Studie wurden verschiedene klinische, immunhistochemische und morphometrische Parameter an einem Gesamtkollektiv von 494 Patienten mit primärem Bronchialkarzinom hinsichtlich ihrer prognostischen Relevanz untersucht. Das Patientenkollektiv setzte sich aus 242 Patienten der Thoraxklinik Heidelberg und 252 Patienten der Klinik für Chirurgie der Universitätsklinik in Szeged (Ungarn) zusammen. Es wurden die Präparate der operativ versorgten primären Bronchialkarzinome im R0-Stadium (kein Residualtumor nachweisbar) in einem Zeitraum von 01. 01. 1990 bis 31. 12. 1995 untersucht. Die Expression von Galektin-1 und -3 sowie heparinbindendem Lektin in den Tumorzellen wurde überprüft. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit zur Bindung von Galektin-1, Galektin-3, CG-16 und Hyaluronsäure getestet. Intratumorale Endothelzellen wurden mithilfe eines gegen den von-Willebrand-Faktor gerichteten Antikörpers kenntlich gemacht. Die Ergebnisse der anschließenden syntaktischen Strukturanalyse wurden mit dem Ziel der Bestimmung prognostisch relevanter Faktoren hinsichtlich des Metastasierungsverhaltens und der Überlebenszeit statistisch untersucht und mittels eines multivariaten Regressionsmodells getestet. Die univariate Analyse zeigte eine günstige Prognose für die Patienten, deren Bronchialkarzinome nicht die Fähigkeit hatten, Galektin-3 zu binden sowie Galektin-1 zu exprimieren. Eine signifikant ungünstige Prognose ergab sich bei großen Zellabständen, hohem Entropiewert und Metastasierung von Tumorzellen in die Lymphknoten. Die multivariate Analyse zeigte, verglichen mit den anderen Zelltypen, eine relativ günstige Prognose für das Plattenepithelkarzinom und für Patienten, deren Tumorzellen nicht über die Fähigkeit verfügten, Galektin-3 zu binden und zu exprimieren. Für Männer ergab sich eine schlechtere Prognose als für Frauen. Prognostisch ungünstige Prädiktoren waren zudem: ein positiver Nodalstatus, das Vorhandensein eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms, und wenn die Tumorzellen in Anwesenheit von Kalzium keine Hyaluronsäure binden konnten. Schließlich erwies sich eine zunehmende Dichte der Tumorzellen, die bis zu 40 µm von intratumoralen Blutgefäßen entfernt lagen, als unabhängiger Prädiktor. Somit konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass die computergestützte Bildzytophotometrie geeignet ist, erzeugte analytische Daten, die auf der Expression und Bindung von Galektinen beruhen, mit der Überlebenszeit von Patienten zu korrelieren. Demgemäß liefert die Analyse der Expression von Galektinen und ihrer Bindungsstellen für die Prognose von Patienten, die an einem Bronchialkarzinom erkrankt sind, zusätzliche wichtige Informationen.

Verschiedene Arbeiten der letzten Jahre konnten zeigen, dass sich in vielen, verschiedenen Zelltypen genreiches, transkriptionell aktives und früh replizierendes Chromatin bevorzugt im Inneren der Zellkerne aufhält, während das genarme, transkriptionell inaktive und spät replizierende Chromatin vorrangig an der Zellkernperipherie zu finden ist. Dennoch ist bislang noch nicht wirklich verstanden, welche der Chromatineigenschaften, wie die lokale Gendichte, die Expression oder die Replikationszeit, tatsächlich einen ausschlaggebenden Einfluss auf die räumliche Anordnung im Zellkern haben und welche dieser Eigenschaften nur aufgrund ihrer Korrelation mit diesen „dominanten“ Merkmalen eine spezifische Verteilung im Interphasekern aufweisen. Um dieses Problem zu untersuchen, stellten wir Pools aus BAC Klonen von HSA 11, 12, 18 und 19 für R-und G-Banden-spezifische Regionen, genreiche bzw. genarme Segmente sowie für hoch bzw. niedrig exprimierte Gene zusammen. Mit Hilfe der multicolor 3D-FISH Technik, Bildverarbeitung und computergestützter, quantitativer Auswertungen wurde die Lage dieser BAC Pools im Zellkern sowie ihre Anordnung bezüglich ihrer Chromosomenterritorien analysiert. Sowohl in den humanen Lymphozyten wie in den humanen Fibroblasten fanden wir den R-Banden Pool, den genreichen Pool sowie den Pool, der die hoch exprimierten Gene enthielt, weiter im Zellkerninneren als ihre jeweils korrespondierenden Pools (G-Banden, genarmer Pool, bzw. niedrig exprimierte Gene). Für jeden BAC Pool wurde mittels sorgfältiger Datenbankrecherche die mittlere lokale Gendichte, der mittlere GC Gehalt, die Replikationszeit sowie das mittlere Expressionsniveau bestimmt. Anschließend wurde eine Korrelationsanalyse dieser Parameter mit der berechneten mittleren, relativen Position der Pools im Zellkern durchgeführt. Die höchste Korrelation ergab sich für die Gendichte, während wir zeigen konnten, dass das Expressionsniveau, die Zuordnung zu einer R- oder G.Bande, sowie das Replikationstiming offensichtlich so gut wie keinen Einfluss auf die radiale Anordnung des Chromatins im Zellkern hat. Diese radiale Positionierung der verschiedenen Pools spiegelte sich auch in ihrer Anordnung bezüglich der Chromosomenterritorien wieder. Diese zeigen eine polare Anordnung in Bezug auf den Zellkern: Genreiche Segmente waren zum Mittelpunkt des Zellkerns hin orientiert, während die genarmen Segmente in der Hälfte des CTs zu finden waren, die sich in Richtung der Peripherie erstreckte. Etwas weniger deutlich ausgeprägt wurde diese Anordnung auch für die R-/G-Banden Pools sowie für die von der transkriptionellen Aktivität abhängigen Pools beobachtet. Dies spricht für eine deutliche strukturelle Transformation bei der Umwandlung der Metaphasenchromosomen zu den CTs der Interphase, die Territorien haben eine hohe Plastizität. Wir konnten bestätigen, dass die extrem genreiche und hoch transkriptionell aktive Region 11p15.5 oft weit aus ihrem CT herausragt. Ein ähnliches Verhalten konnte jedoch nicht für die ebenfalls sehr genreichen und transkriptionell aktiven Segmente des Chromosoms 12 beobachtet werden, was gegen die Annahme spricht, das dieses Phänomen des „looping outs“ ein typische Anordnung für Chromatinabschnitte mit solchen extremen Eigenschaften ist. Wir konnten ebenfalls keine Unterschiede für die Verteilung der BAC Pools der Chromosomen 12, 18 und 19 bezüglich der Oberfläche der CTs finden. R- und G-Banden, genreiche und genarme Segmente sowie hoch und niedrig exprimierte Gene scheinen gleichmäßig im gesamten Territorium verteilt zu sein. Die äußere, das CT einschließende Oberfläche scheint entgegen der Erwartung offensichtlich kein wichtiger Reaktionsort für besonders genreiche bzw. hoch exprimierte Sequenzen zu sein.

Gentherapie ist ein vielversprechender neuer Ansatz für die Tumortherapie. Daher ist die Entwicklung eines effizienten Vektorsystems von großer Bedeutung. Bisher wurden unterschiedliche Serotypen des Adeno-assoziierten Virus (AAV) beschrieben, welche einen erheblichen Unterschied im Tropismus für bestimmte Gewebearten und Zelltypen aufweisen. Daraufhin haben wir systematisch den effizientesten Serotyp unter den AAV Serotypen 1 bis 5 bezüglich der Effektivität des Gentransfers in humanen Tumorzellen untereinander verglichen. Um alle Einflüsse außer denen, die auf das Kapsid zurückzuführen sind, auszuschließen, enthalten alle fünf Serotypen die gleiche Transgen-Kassette, einheitlich flankiert von der ITR (Invertierte terminale Wiederholung = inverted terminal repeat) des AAV-Serotyp 2. AAV2 war der effizienteste Serotyp in einer Reihe klinisch relevanter Tumorzelllinien mit einer Transduktionseffizienz von über 99,5±0,2 % bei nur 1000 genomische Partikeln / Zelle. Transduktionseffizienzen um die 70 % konnte durch den Serotyp 1 in Prostata- und Zervixkarzinom und durch den Serotyp 3 in Prostata-, Mamma-, Kolon- und Zervixkarzinom beim Einsatz von 1000 genomischen Partikeln pro Zelle erzielt werden. AAV4 und AAV5 haben durchgehend schlecht transduziert. Die höchste Transduktionseffizienz unter den humanen Tumorzelllinien betrug für AAV4, 40,6±3,1 % und 25,4±2,2 % für AAV5 beim Zervixkarzinom. Die jüngsten Fortschritte in der AAV-Vektor-Technologie weisen darauf hin, dass AAV- basierte Vektoren für die Tumorgentherapie eingesetzt werden können. Unsere Vergleichsanalysen zeigen, dass AAV2 zwar der am vielversprechenste Kandidat für eine solche Anwendung ist, aber AAV1 und AAV3 auch als gute Alternativen verwendet werden können. Dies ist besonders dann von Bedeutung, wenn eine Anwendung mit AAV2 durch neutralisierende Antikörper verhindert wird. Gao et al. konnten zeigen, dass diese Serotypen trotz des Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen AAV2 zum effizienten Gentransfer befähigt sind. Die Transduktionseffizienz von AAV4 und AAV5 ist generell zu niedrig, was eine effiziente Anwendung in der Tumorgentherapie derzeit unmöglich macht. Bei Untersuchungen einiger muriner Zelllinien stellten wir fest, dass sie sich am besten von AAV1 transduzieren lassen. Um nachzuweisen, ob AAV1 generell murine Zellen besser transduziert als AAV2, müssten weitere Untesuchungen durchgeführt werden. Dies ist für die zukünftige AAV-Forschung von Bedeutung, da eine Bestätigung unserer Beobachtung bedeuten würde, dass die Ergebnisse aus den zahlreichen in-vivo-Experimenten mit Mäusen nicht auf den Menschen übertragbar wären.

Der Aufbau des Zellkerns und die höheren Organisationsmuster von Chromosomen gehorchen Regeln, die bisher in menschlichen Zellen und Zellen einiger Primaten bestätigt werden konnten. In dieser Arbeit sollte an einem anderen Säuger, der Maus, untersucht werden, in wie weit sich die bisher gewonnenen Erkenntnisse auch auf den molekularbiologisch intensiv studierten Modellorganismus der modernen Genomforschung übertragen lassen. Besonders interessant ist die Frage, weil der Karyotyp der Maus nur akrozentrische Chromosomen enthält und viel homogener in Bezug auf Chromosomengröße und Gendichte ist, als der Karyotyp des Menschen oder verschiedener Primaten. Die letzten gemeinsamen Vorfahren von Mäusen und Menschen lebten vor über 80 Mio. Jahren, in dieser Zeitspanne fanden die zahlreichen Veränderungen am Genom der Maus statt. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob Gemeinsamkeiten in Bezug auf die Organisation des Chromatins nachzuweisen sind und ob evolutionär konservierte Organisationsmuster zu finden sind. Die quantitative Untersuchung der Topologie von Chromosomenterritorien und Zentromerregionen erfolgte mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf Zellkernen von vier Zelltypen der Maus. Auf Kerne von Lymphozyten, Fibroblasten, ES-Zellen und Makrophagen wurden die Territorien von sechs Chromosomen mittels Chromosomen-Paint-Sonden hybridisiert. Das ausgewählte Chromosomenset enthielt genreiche, genarme, große und kleine Chromosomen in verschiedenen Kombinationen. Bilddaten wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen und einer digitalen quantitativen Bildanalyse unterzogen. In allen Mauszelltypen zeigten sich klare Korrelationen zwischen sowohl Gengehalt als auch Größe und radialer Verteilung von Chromosomenterritorien. Bei kugeligen Lymphozytenkernen korreliert die Gendichte stärker mit der radialen Verteilung als es die Chromosomengrößen tun. In Fibroblasten sind beide Korrelationen schwächer, aber nachweisbar, in ES-Zellen sind die Korrelationskoeffizienten wieder etwas höher und für beide Verteilungsmodelle gleich, in Makrophagen überwiegt die größenabhängige Verteilung der Chromosomenterritorien. Das genreichste Chromosom MMU 11 zeigt in den Lymphozyten die meisten Unterschiede zu anderen Chromosomenterritorien, während sich das genarme MMU X in den untersuchten männlichen ES Zellen durch seine extreme Randlage von den anderen unterscheidet. Innerhalb der Fibroblasten und Makrophagen gibt es vergleichsweise wenig signifikante Unterschiede zwischen den radialen Positionen der untersuchten Chromosomenterritorien. Zelltypspezifische Verlagerungen von Chromosomenterritorien zeigten sich auch nach einem Differenzierungsschritt von ES-Zellen zu Makrophagen. Die Lage der Chromozentren ist zelltypspezifisch. Im Gegensatz zu den untersuchten Chromosomenterritorien liegen die Chromozentren in Fibroblasten und Makrophagen in relativ zentralen Positionen. In Lymphozyten sind die Chromozentren am weitesten nach außen zum Zellkernrand gelangt, gefolgt von den ES-Zellen. Die Anzahl der Chromozentren ist ebenfalls zelltypspezifisch. Ausgehend von der Chromozentrenzahl in ES Zellen nimmt die Zahl der Chromozentren in differenzierteren Zellen zu (Lymphozyten, Fibroblasten) oder bleibt gleich (Makrophagen). Aufgrund der Ergebnisse lässt sich ausschließen, dass die äußere Form des Zellkerns alleine für die beobachteten Verteilungsunterschiede verantwortlich ist. Allerdings waren die beobachteten Unterschiede kleiner als bei vergleichbaren menschlichen Zelltypen. Mit ein Grund dafür ist sicher die geringere Variabilität der Chromosomengröße und Gendichte im Genom der Maus. Zellkernvolumina lagen zwischen 470 und 650 µm3. Lymphozyten besitzen im Durchschnitt die kleinsten Kerne der zyklierenden Zelltypen, ES-Zellen die größten. Makrophagen befanden sich in der G0-Phase, ihre Zellkerne waren am kleinsten und wiesen die geringste Standardabweichung auf. Die Analyse der Winkel und Abstände innerhalb der Chromosomenterritorien zeigte eine sehr flexible Positionierung innerhalb der Grenzen radialer Ordnungsprinzipien. Diese Resultate sind unvereinbar mit einem früher vorgeschlagenen Modell der Trennung des parentalen Genoms. Es gibt keine Hinweise für eine Abweichung von einer zufälligen Verteilung, von einer Häufung nahe beieinanderliegender MMU 1 Homologen in Makrophagen abgesehen. Zur Untersuchung der Struktur von Chromosomenterritorien wurden Programme angewandt, bei denen steigende Schwellwerte zu Zerfällen von Objekten führten, die analysiert wurden. Zwei unabgängige Methoden zur Berechnung von Objektzahlen in Bildstapeln führten zu gleichen Ergebnissen. Mit dem Programm OC-2 konnten Unterschiede in der Textur von Chromosomenterritorien bei der Maus innerhalb eines Zelltyps, als auch zwischen Zelltypen festgestellt werden. Dabei wurden die individuellen Chromosomengrößen mit berücksichtigt. Es konnte kein allgemeiner Zusammenhang zwischen den durchschnittlichen maximalen Objektzahlen und dem Gengehalt der entsprechenden Chromosomen festgestellt werden, vielmehr scheint die Textur des Chromatins von noch unbekannten, zelltypspezifischen Faktoren beeinflusst zu sein. Die Analyse der Chromatinstruktur in normalen menschlichen Zelltypen und in Tumorzelllinien mit dem Objektzählprogramm OC-2 ergab allgemein erhöhte Objektzahlen in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zelltypen. Davon unabhängig waren auch immer die genreichen HSA 19 durch höhere Objektzahlen charakterisiert als die etwas größeren genarmen HSA 18 in den selben Zell-typen. Vergleiche zwischen den Objektzahlen eines Chromosoms in normalen Zelltypen und Tumorzelllinien ergaben mehr Unterschiede, als Vergleiche nur innerhalb der normalen Zelltypen. Die hier untersuchten Tumorzelllinien weisen eine objektreichere Chromatinstruktur auf, als die ihnen gegenübergestellten normalen Zelltypen.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die komplexen Zusammenhänge zwischen der Kernlokalisation, der transkriptionellen Aktivität und dem Replikationsverhalten von Zelltyp-spezifisch regulierten Genen in menschlichen Zellen besser zu verstehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kernlokalisation der drei benachbarten, jedoch funktionell unabhängigen Gene GASZ, CFTR und CORTBP2 der humanen CFTR-Region auf Chromosom 7q31 ermittelt und mit dem Expressionsverhalten verglichen. Durch eine 2D-Erosionsanalyse wurde die radiale Positionierung dieser Gene in einer Reihe von Zelllinien und primären Zelltypen untersucht. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass transkriptionell aktive Gene der CFTR-Region bevorzugt im Zellkerninneren lokalisierten, nicht exprimierte Gene waren dagegen eng mit der Kernperipherie assoziiert. Die benachbarten Genloci wiesen dabei eine voneinander weitgehend unabhängige Lokalisation auf. Unter Verwendung hoch auflösender konfokaler Mikroskopie und dreidimensionaler Bildrekonstruktion konnte diese Korrelation durch eine 3D-Erosionsanalyse im Wesentlichen bestätigt werden. Um zu ermitteln, ob die unterschiedlich positionierten Genloci mit verschiedenen Chromatin-Fraktionen assoziiert sind, wurde eine Kolokalisationsanalyse vorgenommen. Die Daten haben gezeigt, dass inaktive Genloci der CFTR-Region zu einem hohen Anteil mit dem perinukleären Heterochromatin assoziiert sind, aktive Genloci lokalisierten dagegen bevorzugt in dem hyperazetylierten Euchromatin im Kerninneren. Mehrfarben-FISH Experimente haben gezeigt, dass die eng benachbarten Genloci entsprechend ihrer transkriptionellen Aktivität simultan mit unterschiedlichen Bereichen im Zellkern assoziiert sein können und vermutlich die intergenischen Bereiche zwischen den Genen als flexible Linker dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen im Gegensatz zu früheren Studien (Sadoni et al., 1999; Volpi et al., 2000; Williams et al., 2002; Mahy et al., 2002) die Vermutung nahe, dass die Positionierung subchromosomaler Regionen auf der Ebene einzelner Gene reguliert wird. Durch die Behandlung der Zellen mit TSA wurde außerdem gezeigt, dass eine erhöhte Histonazetylierung zu der Dissoziation eines inaktiven Genlokus von heterochromatischen Bereichen führt, die transkriptionelle Aktivität davon jedoch nicht beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welcher funktionelle Zusammenhang zwischen dem Replikationsverhalten von GASZ, CFTR und CORTBP2 und der transkriptionellen Aktivität und Kernlokalisation dieser Gene besteht. Die Bestimmung der Replikationszeitpunkte wurde durch die Untersuchung des Auftretens von FISH-Dubletten während definierter S-Phase Stadien vorgenommen. Da bei dieser Analyse die Möglichkeit besteht, den Anteil an Dubletten durch eine verlängerte Schwester-Chromatid Kohäsion zu unterschätzen (Azuara et al., 2003), wurden die ermittelten Zeitpunkte darüber hinaus durch verschiedene Fixierungsmethoden überprüft. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass transkriptionell aktive Genloci, die in dem hyperazetylierten Euchromatin lokalisierten, zu einem früheren Zeitpunkt replizierten als nicht exprimierte Genloci, die eng mit dem perinukleären Heterochromatin assoziiert waren. Durch eine TSA-Behandlung der Zellen wurde nachgewiesen, dass vor allem die Assoziation mit definierten Chromatin-Fraktionen einen Einfluss auf das Replikationsverhalten ausübt, die transkriptionelle Aktivität und das Replikationsverhalten jedoch nur indirekt miteinander in Zusammenhang stehen. Auf der Basis dieser Daten und früherer Studien wurde ein Modell erstellt, das die epigenetischen Mechanismen zueinander in Beziehung setzt, die an der Aktivierung Zelltyp-spezifisch regulierter Gene beteiligt sind. Der letzte Teil dieser Arbeit war der Frage gewidmet, ob Komponenten der Zellkernlamina an der perinukleären Positionierung des reprimierten CFTR-Lokus beteiligt sind. Dazu wurden HeLa S6 Zellen mit Lamin A/C-, Lap2- oder Emerin-siRNAs transfiziert. Nach erfolgreichem Knockdown wurde die Kernlokalisation des CFTR-Lokus durch Erosionsanalysen und Abstandsmessungen zu der Kernperipherie ermittelt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass nach dem Knockdown von Lamin A/C, Lap2 oder Emerin der CFTR-Lokus signifikant weiter im Kerninneren lokalisierte. Dabei schienen Lamin A/C und Lap2 einen stärkeren Einfluss auf die Lokalisation von CFTR auszuüben als Emerin. Auch wenn in früheren Arbeiten bereits gezeigt wurde, dass die Kernlamina für die Positionierung peripheren Chromatins von Bedeutung ist (Sullivan et al., 1999; Goldman et al., 2004; Zastrow et al., 2004), konnte hier zum ersten Mal ein direkter Einfluss auf die Lokalisation eines einzelnen Genlokus demonstriert werden. In einem ergänzenden Ansatz wurde die Kernlokalisation von CFTR in Fibroblasten von HGPS-Patienten untersucht, die auf Grund der Akkumulation von mutiertem Lamin A/C Deformationen der Zellkernlamina und Zellzyklus-Defekte aufwiesen (Eriksson et al., 2003; Goldman et al., 2004). Durch Abstandsmessungen zu der Kernperipherie und durch Kolokalisationsanalysen wurde gezeigt, dass der CFTR-Lokus in HGPS-Zellen einen größeren Abstand zur Kernperipherie aufwies und häufiger im hyperazetylierten Euchromatin lokalisierte als in Fibroblasten eines gesunden Probanden. Insgesamt unterstützen diese Daten die Vermutung, dass die Misslokalisation von reprimierten Genen in ein verändertes Chromatin-Umfeld an dem Krankheitsbild dieser und anderer Laminopathien beteiligt sein könnte.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Dendritische Zellen (engl.: dendritic cells, DC) gelten seit ihrer Entdeckung als eine der wichtigsten Zelltypen des Immunsystems. Dies gilt sowohl für die Erzeugung von Immunität als auch von Toleranz, insbesondere in Bezug auf T-Zell-vermittelte Immunreaktionen (Banchereau et al. 1998). Im Zuge dessen wird in DC enorme Hoffnung bezüglich des Verständnisses von Autoimmunerkrankungen sowie Erkrankungen wie z.B. Krebs gesetzt, bei der DC schon seit einigen Jahren zur Immuntherapie verwendet werden (Banchereau et al. 2001). Die Analysen von DC beinhalteten jedoch bisher immer die Isolation von DC ex vivo oder deren Kultivierung in vitro. Diese experimentellen Versuchsschritte zeigten einen tiefgreifenden Einfluss auf den Phänotyp von DC und somit auch auf deren immunstimulatorischen Eigenschaften (Pierre et al. 1997; Gallucci et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde durch die Entwicklung eines transgenen Maussystems erstmals der generelle Einfluss von DC auf CD8-T-Zellen in vivo detailliert analysiert. Dies konnte direkt an der Qualität der CD8-T-Zellantworten auf bestimmte Immunstimuli abgelesen werden, ohne die DC isolieren oder anderweitig manipulieren zu müssen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Bedeutung von DC im Thymus bei der Selektion sich entwickelnder CD8-T-Zellen analysiert, da es in Bezug auf die Bedeutung von DC sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Selektion widersprüchliche Meinungen gibt. Es konnte gezeigt werden, dass DC im Thymus nicht zur positiven Selektion von CD8-T-Zellen befähigt sind, sondern dass hierbei den Epithelzellen des Thymus eine entscheidende Bedeutung zukommt. Durch Zelltransferversuche konnte weiterhin gezeigt werden, dass DC zur Eliminierung autoreaktiver CD8-T-Zellen, und somit zur Induktion zentraler Toleranz, durch negative Selektion im Thymus ausreichten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Vermögen von DC sowie die Qualität der durch sie induzierten CD8-T-Zell-Immunantworten untersucht. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass DC ausreichend sind, um eine vollständige und funktionelle Immunantwort durch CD8-T-Effektorzellen in vivo zu induzieren. Bei der Aktivierung von CD8-T-Zellen nur durch DC, konnten beim Vergleich mit Wildtyp-Mäusen jedoch auch qualitative sowie quantitative Unterschiede festgestellt werden, die eine mögliche Bedeutung weiterer Zellen bei der „Feinregulation“ CD8-basierter T-Zellantworten wahrscheinlich machen. Im Gegensatz hierzu konnten keine Unterschiede bei CD8-TZellreaktion nach Induktion von Toleranz erkannt werden. DC konnten in diesem Fall eindeutig als der hauptverantwortliche Zelltyp zur Erzeugung peripherer Toleranz in vivo identifiziert werden.

BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi-Netzwerks und ein strukturell neuartiges Ubiquitin-Konjugationsenzym (UBC) der Maus. Zusätzlich zu der am C-Terminus befindlichen UBC-Domäne enthält BRUCE im N-terminalen Bereich ein BIR (baculovirus inhibitor of apoptosis repeat)-Motiv, die charakteristische Domäne aller BIRPs (BIR-domain containing proteins). Die meisten dieser Proteine haben anti-apoptotische Eigenschaften und werden deshalb in der IAP (inhibitor of apoptosis proteins)-Familie zusammengefasst. Auch BRUCE konnte in vitro als Inhibitor apoptotischer Prozesse beschrieben werden. Um die Funktion von BRUCE in vivo zu untersuchen, wurde eine BRUCE-defiziente Mauslinie etabliert und im Rahmen dieser Arbeit phänotypisch charakterisiert. Die vollständige Inaktivierung des BRUCE-Gens führte zu einer Verzögerung des embryonalen Wachstums sowie zum perinatalen Tod der Knockout-Organismen. BRUCE wird in fast allen embryonalen Geweben exprimiert, deutlich sichtbare morphologische Veränderungen in Folge seiner Deletion traten jedoch hauptsächlich im extra-embryonalen Gewebe der Plazenta auf. Nach störungs-freier Initiierung der Organogenese zeigte sich mit zunehmender Reifung der Plazenta eine Verzögerung der Ausbildung des Labyrinthsystems sowie eine deutliche Reduktion der Spongiotrophoblast-Schicht. Dieses Entwicklungsdefizit kann Ursache einer stark eingeschränkten Effizienz der Nähr- und Sauerstoffversorgung des Embryos sein und sowohl zu Wachstumsretardierung als auch zu perinataler Letalität der transgenen Organismen führen. Die morphologischen Veränderungen im Gewebe wurden nicht, wie ursprünglich angenommen, durch eine erhöhte Apoptoserate der Zellen hervorgerufen. Stattdessen konnten in den defekten plazentalen Geweben drastische Veränderungen in Proliferationsverhalten und Differenzierungsstatus der Trophoblast-Zellen beobachtet werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Auswirkungen des BRUCE-Verlusts auf den Modellorganismus zeigen einerseits die essentielle Bedeutung von BRUCE für die Entwicklung sowie den funktionellen Erhalt der Plazenta und damit für die gesamte Embryonalentwicklung der Maus. Andererseits geben die Ergebnisse Hinweise darauf, dass dieses ungewöhnliche Enzym möglicherweise eine überlebensnotwendige regulative Funktion der Inhibition Apoptose-induzierter oder nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität bei Proliferations- und/oder Differenzierungs-ereignissen bestimmter Zelltypen besitzt.

Die Polymerisation von monomerem G-Aktin zu filamentösem F-Aktin, die Organisation von Aktin-Filamenten zu spezifischen Zytoskelettstrukturen, sowie die F-Aktin Depolymerisation stellen in ihrem dynamischen Zusammenspiel die Triebkraft vieler zellulärer Bewegungsvorgänge dar. Dies sind u.a. Zell-Polarisation, Zell-Migration, Zell-Teilung, Zell-Zell-Interaktionen, Phagozytose und intrazellulärer Vesikeltransport. Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Aktin Organisation hat 1999 einen entscheidenden Fortschritt gemacht: damals wurde entdeckt, dass der sieben Untereinheiten umfassende Arp2/3 Komplex nach Aktivierung durch Proteine der Wiskott-Aldrich Syndrom Protein- (WASp-) Familie Aktin-Filamente de novo polymerisieren kann. Die Experimente für diese Dissertationsarbeit hatten zum Ziel, den Mechanismus der WASp-abhängigen Aktin Nukleation in vitro und in humanen Makrophagen genauer zu untersuchen. Einerseits sollten die Regionen von WASp genauer charakterisiert werden, die für die Aktivierung des Arp2/3 Komplexes verantwortlich sind. Andererseits sollte die Bedeutung von WASp und Arp2/3 Komplex bei der Aktin Nukleation in spezialisierten Adhäsionsstrukturen von Makrophagen, sogenannten Podosomen, geklärt werden. Podosomen sind essentiell für Adhäsion, Migration und vermutlich auch Gewebeinvasion von Makrophagen und ihnen verwandten Zellarten, aber sie finden sich auch in einer Vielzahl weiterer Zelltypen einschließlich metastasierender Tumorzellen. Die Bedeutung von Podosomen wird dadurch verdeutlicht, dass ihr Fehlen bei unter Wiskott-Aldrich Syndrom leidenden Patienten mit klinisch relevanten Immundefekten assoziiert ist. Zur Identifizierung der für die Aktin Nukleation minimal notwendigen WASp Regionen wurden verschiedene GST-Fusionskonstrukte der konstitutiv aktiven VCA (“Verprolin-like“, “Central“, “Acidic“) Domäne hergestellt. Durch Anisotropie Messungen und in GST-“Pulldown“ Versuchen wurde die Bindung von Arp2/3 Komplex und G-Aktin an die verschiedenen Konstrukte in vitro bestimmt. In einem zweiten Schritt wurde getestet, welche Regionen für die Arp2/3 Komplex Aktivierung notwendig sind. Dabei wurde GST-VC als die minimal notwendige Region für die Aktivierung der Aktin Nukleation identifiziert. Durch mikroskopische Analyse von in vitro nukleierten Aktin-Filamenten stellten wir fest, dass der durch GST-VC aktivierte Arp2/3 Komplex auch zur Ausbildung von Aktin-Filament Verzweigungen fähig ist. Die zellulären Effekte der VCA Konstrukte wurden mittels Mikroinjektion in primäre humane Makrophagen untersucht. Aktive Konstrukte führten zum Auftreten von prominenten Aktin-Aggregaten im Zytoplasma und zur Zerstörung von Podosomen. Auch hierbei war GST-VC das kürzeste Konstrukt, das vermutlich durch Aktivierung von zellulärem Arp2/3 Komplex, zur Zunahme des Gehaltes an intrazellulärem polymerisiertem Aktin führte. Obwohl die WASp-A Region als hochaffine Arp2/3 Komplex Bindungsstelle beschrieben worden war (Machesky und Insall, 1998), ist sie für die Arp2/3 Komplex Aktivierung nicht essentiell. Durch Koinjektion von WASp-A oder N-WASP-A mit aktiven GTPasen konnte ein erster experimenteller Hinweise für eine “Priming“- (Sensibilisierungs-) Funktion der A Region am Arp2/3 Komplex gefunden werden. Bei der Untersuchung der Aktin Nukleation und Organisation in Podosomen zeigte sich ein enger funktioneller Zusammenhang zwischen Aktin- und Tubulin-Zytoskelett. So konnte durch Depolymerisierung der Mikrotubuli in adhärierenden Monozyten die Ausbildung von Podosomen verhindert werden. Da bekannt war, dass WASp über seine Polyprolin Domäne an CIP4 (“CDC42 Interacting Protein“) bindet und dieses wiederum mit Mikrotubuli assoziiert, wurde der Einfluss der isolierten WASp-Polyprolin Domäne, aber auch von CIP4 Deletions-Konstrukten, denen entweder die Mikrotubuli oder WASp Bindungsstelle fehlten, auf die Podosomen-Ausbildung untersucht. Einem auf den so erhaltenen Ergebnissen basierendem Modell zufolge könnte WASp durch CIP4 an Mikrotubuli rekrutiert und anschließend via Mikrotubuli an Orte der Podosomen-Bildung transportiert werden. Dort könnte WASp dann zur Aktivierung von Arp2/3 Komplex und zur Nukleation von neuen Aktin-Filamenten führen.

Der programmierte Zelltod (Apoptose), ist ein evolutiv konserviertes Selbstmordprogramm der Zelle, um auf äußere oder endogene Signale zu reagieren. Es dient dazu, überflüssige und/oder geschädigte Zellen zu entfernen. Dieser Prozess ist bei Krankheiten wie z.B. Krebs teilweise außer Kraft gesetzt, und bei Parkinson- oder Alzheimer-Erkrankung zu stark ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Gene biochemisch und molekularbiologisch näher charakterisiert. Bei diesen zwei Genen, die mit Hilfe eines speziell zur Identifikation dominanter, Apoptose–induzierender Gene entwickelten Screnningsverfahrens identifiziert wurden, handelt es sich um CybL, eine Komponente von Komplex II der Atmungskette, und um Saip (Small apoptosis inducing protein) einem Protein, das am endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist. Bisher war bekannt, daß die Atmungskettenkomplexe I und III bei der Fas-Ligand und der Ceramid-vermittelten Apoptose beteiligt sind. Über einen Zusammenhang von Komplex II und Apoptose-Induktion war zu Beginn dieser Arbeit nichts beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde entdeckt, daß neben CybL kann auch noch die kleine Untereinheit von Komplex II (CybS) Apoptose auslösen kann, wohingegen die übrigen Komponenten von Komplex II, das Flavinprotein (FAD) und das Eisen–Schwefelprotein (FeS), nicht in der Lage sind, Apoptose zu induzieren. Die laut Datenbank vorhergesagten vier Transmembrandomänen von CybL sind für die apoptoseinduzierende Eigenschaft notwendig. Darüber hinaus führt nur eine 3,8–fache Induktion von CybL über dem endogenen CybL zu Apoptose in Säugetierzellen. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, daß CybL einerseits bei Überexpression Apoptose induzieren kann, und andererseits Apoptose durch seine Inaktivierung reduziert wird. Daß CybL damit ein spezifischer Sensor für Apoptose ist, konnte dadurch ermittelt werden, daß eine Reihe verschiedener Apoptosestimuli (Doxorubicin, Etoposid, Menadion, Cisplatin, Taxol) und der Fas-Rezeptor einen intakten Komplex II zur Signalvermittlung benötigen. Dazu wurde mit sogenannten B9/B30 Zellen gearbeitet. B9/B30-Zellen sind Lungenfibroblasten aus Hamsterzellen, in denen CybL inaktiv ist (B9), wohingegen die B30-Zellen ein Fusionsprotein zwischen CybL und GFP enthalten, welches die physiologische Aktivität von Komplex II wiederherstellt. In den B9-Zellen ist die Apoptoseinduktion durch Cytostatika (Ausnahme Arsentrioxid) bzw. durch den Fas-Rezeptor reduziert, verglichen mit den B30-Zellen. Auch Untersuchungen an HeLa WT- bzw. HeLa 0-Zellen (die keine intakte Atmungskette besitzen) zeigten, daß für die Apoptoseinduktion mit den oben genannten Reagenzien eine intakte Atmungskette benötigt wird. Im Jahre 2000 wurde CybL als Tumosupressor beschrieben. Es ist daher zu vermuten, daß die Tumorsuppressor-Eigenschaften von CybL auf der Fähigkeit von Komplex II beruhen, proapoptotische Signale aufzunehmen und weiterleiten zu können. Bisher war bekannt, daß eine transiente Inhibition einiger Atmungskettenkomplexe (Komplex I, II, III) zur Bildung von reaktiven Sauerstoffintermediaten (ROI) führt. Es konnte gezeigt werden, daß auch CybL bei Überexpression reaktive Sauerstoffintermediate produziert, und daß viele proapoptotische Signale zur spezifischen Inhibition von Komplex II führt. Da bereits eine geringe Expression von CybL ausreichend ist, um Komplex II zu inhibieren, und dadurch Apoptose ausgelöst wird, kann Komplex II als spezifischer Sensor für Apoptose angesehen werden. Das bisher unbekannte Gen mit dem Namen Saip löst dominant Apoptose in Säugetierzellen aus. Die proapoptotische Eigenschaft von Saip ist vermutlich auf einen evolutiv konservierten Mechanismus zurückzuführen, da auch ein Homolog aus C.elegans nach transienter Transfektion in Säugerzellen Apoptose auslöst. Dabei induziert Saip Caspase-abhängige Apoptosewege, die zur Apoptose-typischen DNA–Fragmentierung und Bildung von apoptotischen Körperchen (Membran blebbing) führt. Es konnte auch eine physikalische Protein-Proteininteraktion (mittels Co-Immunpräzipitation) mit Bap31 gefunden werden. Dieses Protein ist ebenfalls am ER lokalisiert und Bestandteil eines lokalen Apoptose-Sensors, der einen Proteinkomplex mit Procaspase-8L sowie antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie (Bcl-2 bzw. Bcl-XL) bildet. Des weiteren interagiert Saip auch mit einer Deletionsmutante von Spike (Small protein with inherent killing effect-SpikeN19), einem neuen proapoptotischen BH3-only Protein, das ebenfalls am ER lokalisiert ist, und an Bap31 bindet. Saip ist ein ubiquitäres Protein und wird in sehr vielen der getesteten Gewebe und Zelltypen exprimiert. Im Northern-Blot-Verfahren konnte vergleichsweise eine hohe Expression an humaner Saip-mRNA in Niere, Placenta, Herz, Leber, Dünndarm und Skelettmuskulatur detektiert werden. Mit Hilfe von weiteren Northern-Blots wurde herausgefunden, daß Saip durch diverse Reagenzien, die bekanntermaßen Apoptose induzieren können, transkriptionell hochreguliert wird. So ist zum Beispiel das Signal von Saip nach 5-Fluorouracil-Behandlung (5FU), um das 80-fache gegenüber der Kontrolle erhöht. 5FU ist ein sehr effektives und bekanntes Zytostatikum, das in der Klinik zur Behandlung von Colon- und Mammakarzinomen erfolgreich eingesetzt wird. Wird Saip mittels der RNAi–Methode deaktiviert, wird die 5FU-induzierte Apoptose um 1/3 reduziert. Saip könnte somit eine wichtige Rolle in der Behandlung von Tumoren spielen, die mit 5FU therapiert werden.

Das humanpathogene Bakterium H. pylori persistiert im Gastroduodenaltrakt für Jahre oder sogar Jahrzehnte und löst durch die Kolonisation der Magenmukosa eine chronische Entzündungsreaktion aus. In den meisten Fällen bleibt diese symptomlos, es können jedoch auch schwerwiegende Erkrankungen wie ein Magen- oder Zwölffingerdarm-Geschwür oder Magenkrebs daraus hervorgehen. Obwohl die Infektion eine starke zelluläre und humorale Immunantwort hervorruft, kann H. pylori durch das Immunsystem nicht eliminiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von H. pylori auf die Proliferation und Aktivierung von CD4+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass H. pylori zwei Faktoren besitzt, um die Expansion der T-Zellen zu hemmen. Der eine, nicht näher charakterisierte Faktor scheint mit der Oberfläche der Bakterien assoziiert zu sein und inhibiert die Proliferation der T-Zellen bei direktem Kontakt der Bakterien mit den Zellen. Der zweite Faktor wurde als vakuolisierendes Zytotoxin VacA identifiziert, das, wie bisher bekannt war, in Epithelzellen die Bildung saurer Vakuolen auslöst. T-Zellen produzieren, wenn sie aktiviert werden, den Wachstumsfaktor IL- 2, beginnen sich zu vermehren und setzen eine Immunreaktion gegen das Pathogen in Gang. Das VacA-Toxin hemmt jedoch die Bildung von IL-2 und bewirkt eine Hemmung des Zellzyklus bei T-Zellen, indem es die Expression der Cycline D3 und E reprimiert. Diese sind essentiell für die Aktivierung des Retinoblastom-Proteins, das den Übergang des Zellzyklus von der G1- in die S-Phase vermittelt. Durch die Hemmung der IL-2-Produktion und die Erniedrigung der Oberflächenlokalisation von CD25, der -Kette des IL-2-Rezeptors, unterbricht VacA die Signaltransduktion, die normalerweise über den IL-2-Rezeptor zur Expression der Cycline führt. Die Hemmung der IL-2-Produktion durch VacA erfolgt auf transkriptioneller Ebene, indem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) verhindert wird. Die anderen für die Transkription des IL-2-Gens essentiellen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-B werden durch VacA nicht beeinflusst. Die Stimulation der T-Zellen aktiviert zwei Haupt-Signalwege: einer führt über den MAPKinase / ERK-Kinase Weg zur Aktivierung von AP-1 und NF-B, der andere löst eine Erhöhung der Calcium-Konzentration im Zytoplasma aus, was die Ca2+-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert daraufhin den Transkriptionsfaktor NFAT und NFAT wird in den Zellkern transportiert, wo es zusammen mit AP-1 und NF-B die Transkription des IL-2-Gens initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass VacA die Translokation von NFAT in den Kern durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität von Calcineurin verhindert. Dies hat zur Folge, dass NFAT-abhängige Gene, wie das IL-2- Gen oder das für CD25 codierende Gen, nicht abgelesen werden können. Dass Calcineurin ein geeignetes Zielmolekül ist, um eine Immunantwort zu unterdrücken, zeigen auch die medizinisch bedeutsamen Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Cyclosporin A. Beide V Zusammenfassung 91 Substanzen verursachen durch Hemmung von Calcineurin eine starke Immunsuppression. In DNA-Microarray-Analysen wurde untersucht, ob VacA einen ähnlich drastischen Effekt auf die Funktion der T-Zellen hat wie FK506. Dabei zeigte der Vergleich der Genexpression von VacA- und FK506-behandelten T-Zellen, dass VacA eine Untergruppe der Gene, die auch von FK506 reprimiert werden, herunterreguliert, wie z.B. die Gene für die Zytokine Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1, MIP-1, Single C Motif-1 (SCM-1) und SCM- 1. VacA scheint also die Genaktivität von T-Zellen ähnlich wie FK506 zu modulieren, was auf einen ähnlichen Mechanismus, nämlich die Calcineurin-Hemmung schließen lässt. Da das VacA-Toxin ein sekretiertes Protein ist, das auch in den tieferen Schichten des Magengewebes nachgewiesen werden kann, erreicht H. pylori nicht nur die vereinzelt im Magenepithel vorkommenden T-Zellen, sondern auch die T-Zellen, die bei der Infektion in die Lamina propria, eine tiefere Schicht der Magenmukosa, einwandern. Durch die Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung und die Repression von Zytokin-Genen, die wichtig sind für die Modulation der Immunantwort, induziert H. pylori so vermutlich eine lokale Immunsuppression, die seine Eliminierung durch das Immunsystem verhindert und eine chronische Infektion des Magens ermöglicht. In einem zweiten Projekt wurde die Spaltung von CagA in ein 100 kD- und ein Tyrosinphosphoryliertes 40 kD- Fragment nach dessen Translokation in diverse Zelltypen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung nicht nur in Makrophagen, sondern auch in dendritischen Zellen und in T-Zellen auftritt. Die Spaltung scheint von der Tyrosin-Phosphorylierung des CagA-Proteins und von Calcium abhängig zu sein. Dabei wurde die Ca2+-abhängige Protease Calpain in einem in vitro-Ansatz als ein CagAprozessierendes Enzym identifiziert. Auch in Makrophagen kann die Spaltung von CagA in P100 und P40P-Tyr durch den Calpain-Inhibitor Calpeptin verhindert werden. Die Tatsache, dass transloziertes CagA in allen getesteten eukaryontischen Zelltypen außer der Magenepithelzellinie AGS prozessiert wird, deutet darauf hin, dass diese Prozessierung eine biologische Bedeutung hat.

Mit zunehmendem Wissen über die Komplexität der Osteogenese wurde die Aussagekraft einzelner osteoblasten-assoziierter Marker in den letzten Jahren immer mehr in Frage gestellt. Denn der Nachweis einzelner Marker erlaubt weder eine eindeutige Identifikation undifferenzierter hMSC noch eine Abgrenzung von hMSC zu anderen Reifungsstufen der osteoblastären Kaskade. Das Ziel dieser Untersuchung war es daher, über die Erstellung eines immunzytochemischen Färbeprofils mehrerer Marker gleichzeitig, undifferenzierte hMSC eindeutig zu identifizieren und sie gegenüber hOB und evtl. weiteren Differenzierungsstufen der osteoblastären Kaskade abzugrenzen. Durch die Erstellung eines immunzytochemischen Färbeprofils ist es möglich, heterogene Zellpopulationen auf Einzelzellniveau zu charakterisieren und sie voneinander zu unterscheiden. Diese Untersuchung stellt einen sehr erfolgversprechenden Ansatz dar, undifferenzierte humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) zu identifizieren und sie von Zellen der osteoblastären Differenzierungskaskade sowie anderen Zelltypen abgrenzen zu können. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass humane MSC und humane Osteoblasten jeweils spezifische Färbeprofile aufweisen, die eine eindeutige Diskriminierung der beiden Zellpopulationen erlauben. Für eine spezifische Unterscheidung auf Einzelzellnineau ist eine intensive Suche nach spezifischen Markern oder die Kombination mehrerer Marker notwendig. Von den in dieser Arbeit ausgewählten Proteinen ergaben Bone Sialoprotein, Osteocalcin, Decorin sowie Kollagen-IV und Kollagen-X unterschiedliche Färbemuster. Kollagen-IV und –X waren besonders in hMSC positiv, weswegen sie sich für eine Erkennung unreifer osteoblastärer Zellen anbieten. Bone Sialoprotein, Osteocalcin und Decorin eignen sich dagegen für einen Nachweis reifer osteoblastärer Zellen, denn sie waren nur in hOB positiv. Osteocalcin und Decorin erlaubten außerdem eine Abgrenzung differenzierter hOB. Die Proteine Versican und Matrixmetalloproteinase-2 erscheinen darüber hinaus für eine Unterscheidung von osteoblastären und fibroblastären Zellen nützlich zu sein. Die klassischen osteoblastären Marker alkalische Phosphatase, Kollagen-I, Osteopontin oder Osteonectin waren für eine Unterscheidung von hMSC und hOB nicht geeignet, da sie in beiden Zellpopulationen gleiche Ergebnisse lieferten. Insbesondere der Wert der alkalische Phosphatase als immunzytochemischer Marker der osteoblastären Kaskade wird in dieser Untersuchung in Frage gestellt. Eine osteogene Stimulation von hMSC mit Dexamethason, b-Glyzerophosphat und Askorbinsäure bewirkte eine deutliche Veränderung der Morphologie, der Wachstumseigenschaften und des Färbeprofils. Allerdings konnte durch eine osteogene Stimulation kein immunzytochemischer Phänotyp von hMSC induziert werden, welcher identisch mit dem der hOB war. Daher ist es unwahrscheinlich, dass eine Stimulation in vitro mit den oben aufgeführten Zusätzen die komplizierten Verhältnisse der Osteogenese in vivo nachahmen kann.