Podcasts about zielgenen

Mon, 25 Feb 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18284/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18284/1/Mittner_Agnes.pdf Mittner, Agnes Maria ddc:570, ddc:50

Thu, 21 Feb 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15427/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15427/1/Stroehle_Bernadette_Sarah.pdf Ströhle, Bernadette Sarah ddc:610, ddc:60

Während der Zellproliferation müssen Zellwachstum und Zellteilung koordiniert werden. Die Kopplung erfolgt in der Hefe durch einen Komplex aus Nop7p, Erb1p und Ytm1p, der sowohl an der Ribosomenbiogenese als auch an der Kontrolle der DNA-Replikation beteiligt ist. Die homologen Proteine Pes1, Bop1 und WDR12 werden in Säugern von Zielgenen des Transkriptionsfaktors c-Myc, einem zellulären Onkoprotein, kodiert. In dieser Arbeit wurde die Existenz eines evolutionär konservierten Komplexes aus Pes1, Bop1 und WDR12 (PeBoW-Komplex) in Säugern belegt. Dabei wurde gezeigt, dass Bop1 als zentrales Protein des Komplexes agiert und die Interaktion von Pes1 und WDR12 vermittelt. Die Integrität des Komplexes ist wesentlich für seine Funktion. Die Depletion einzelner Komponenten sowie die Überexpression des integrierenden Proteins Bop1 hemmen die Reifung der Vorläufer-rRNA der großen ribosomalen Untereinheit sowie die Proliferation der Zellen. Bop1-Überexpression führt zur Ausbildung von zwei Subkomplexen aus Bop1 und Pes1 bzw. Bop1 und WDR12. Während der Bop1/Pes1-Subkomplex als Teil der pre-Ribosomen im Nukleolus lokalisiert, wird WDR12 durch Bop1-Überexpression im Zytoplasma gehalten und fehlt im Nukleolus zur Ausbildung eines funktionellen PeBoW-Komplexes. Pes1 und WDR12 können unabhängig in den Nukleolus translozieren, während Bop1 dafür die Interaktion mit Pes1 benötigt. Untersuchungen zur Stabilität der einzelnen PeBoW-Komponenten zeigten, dass monomeres Bop1 extrem instabil ist, durch Inkorporation in den PeBoW-Komplex aber vor Abbau geschützt wird. Möglicherweise werden hierdurch interne PEST-Sequenzen in Bop1 maskiert. Die Menge an Bop1 ist somit abhängig von der Anwesenheit von Pes1 und WDR12. Die gegenseitige Abhängigkeit der Stabilität aller drei PeBoW-Komponenten konnte in weitergehenden Experimenten gezeigt werden. Schließlich wurde untersucht, ob der PeBoW-Komplex die Ribosomenbiogenese mit der DNA-Replikation über Interaktion mit dem ORC-Komplex, wie in der Hefe beschrieben, koordiniert. Mit Hilfe der BiFC-Methode konnte eine Interaktion von Pes1 mit Orc6, eines Faktors des ORC-Komplexes, gezeigt werden. Die koordinierende Funktion des PeBoW-Komplexes für Zellwachstum und Zellproliferation scheint von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert zu sein.

Notch-Signale spielen bei der Entwicklung von Lymphozyten eine wichtige Rolle. So induzieren Notch1-Signale in Lymphozyten-Vorläuferzellen im Knochenmark die Entwicklung zu T-Zellen, während Notch2-Signale essentiell für die Differenzierung reifer B-Zellen zu Marginalzonen-B-Zellen sind. Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert reife B-Zellen und regt diese zur permanenten Proliferation an. EBNA2, das erste Protein, das in EBV-infizierten B-Zellen exprimiert wird, verwendet zur Regulation von Zielgenen den gleichen Signalweg wie Notch und wird deshalb als (partielles) funktionelles Äquivalent eines aktivierten Notch-Rezeptors (NotchIC) bezeichnet. Notch und EBNA2 können sich bezüglich der Muskelzelldifferenzierung gegenseitig ersetzen, die Proliferation in B-Zellen kann dagegen nur EBNA2 induzieren. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, mit Hilfe welcher Zielgene Notch und EBNA2 unterschiedliche und gemeinsame Funktionen vermitteln. Zu diesem Zweck wurde ein Zellsystem etabliert, bei dem Tetrazyclin-regulierbares aktives Notch1IC oder Notch2IC in humane reife EBV-immortalisierte B-Zellen eingebracht wurde. In diesem System konnten Notch1IC oder Notch2IC in Abwesenheit von EBNA2 exprimiert werden, sowie EBNA2 in Abwesenheit von NotchIC. Die Expression von Zielgenen wurde anhand einer Microarray- Analyse untersucht. Damit sollten Notch1IC-, Notch2IC- und EBNA2-regulierte Zielgene identifiziert werden. Hierbei wurde vornehmlich auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen Notch1IC- und Notch2IC-regulierten Genen, sowie zwischen NotchIC- und EBNA2-regulierten Genen eingegangen. Durch Notch1IC wurden 270 Gene induziert und 374 Gene reprimiert. Notch2IC konnte 757 Gene induzieren und 959 Gene reprimieren. EBNA2 induzierte 6.250 Gene und reprimierte 6.811 Gene. Die Auswertung der Zielgene in der Clusteranalyse ergab, dass viele Gene reguliert wurden, die mit dem Zellzyklus und der Immunmodulation assoziiert sind. Aus diesem Grund sollten diese beiden Signalwege näher untersucht werden. In dem beschriebenen Zellsystem konnten weder Notch1IC noch Notch2IC die EBNA2-vermittelte Proliferation ersetzen. So konnten Notch1IC und Notch2IC zwar einige Zellzyklus-Gene induzieren, die aber assoziierten eher mit der S-Phase und mit der Mitose. Die von EBNA2 stark induzierten Gene c-Myc und LMP1, sowie die G1-Phase assoziierten D-Cycline und der Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 konnten durch NotchIC nicht oder nur schwach induziert werden. Vermutlich können Notch1IC und Notch2IC die Proliferation weder aufrechterhalten noch induzieren, da sie nicht fähig sind, G1-Phase Gene, sowie c-Myc und LMP1 ausreichend stark zu induzieren. Der Einfluss von NotchIC auf die Immunmodulation war mit der von EBNA2 vergleichbar. Die Repression vieler Gene, die mit der Immunmodulation assoziieren, weist darauf hin, dass sowohl Notch1IC, Notch2IC als auch EBNA2 die Immunantwort negativ regulieren. So könnten B-Zellrezeptor (BCR)-Signale über die Repression von Komponenten und Signalmolekülen des BCR abgeschwächt werden, die Antigenpräsentation über die Repression von MHC-Molekülen vermindert werden und der allgemeine Aktivierungszustand zusätzlich über die Repression von Komplement-, Toll-like- und Fc-Rezeptoren vermindert werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass Notch1IC, Notch2IC und EBNA2 den Klassenwechsel negativ beeinflussen. Dies wird möglicherweise über die transkriptionelle Repression der Interleukin-Rezeptoren IL4Rα1 und IL13Rα1, sowie über die Modulation von Molekülen des Signalwegs vermittelt, die die Expression von sterilen Transkripten induzieren und somit die Voraussetzung zum Klassenwechsel bilden.

Zelllinienentscheidungen in der Hämatopoese werden eingeleitet und sind abhängig von der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren. Es ist allerdings bisher nicht geklärt, ob die initiale Aktivierung früher hämatopoetischer Transkriptionsfaktoren durch bisher unbekannte extrinsische Signale oder durch ein zellinternes autonomes Programm erfolgt. Notch Rezeptoren sind evolutionär hoch konservierte Transmembranrezeptoren, die an der Regulation von Zelllinienentscheidungen, Differenzierung und Proliferation in verschiedenen embryonalen und adulten Geweben beteiligt sind. Die Expression von Notch Rezeptoren auf hämatopoetischen Zellen und der dazugehörigen Liganden wie Jagged1 auf Knochenmarksstromazellen deutet auf eine Bedeutung von Notch in der Regulation der Hämatopoese. Vor Kurzem konnte die Induktion der myeloischen Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Notch nachgewiesen werden. Die molekularen Mechanismen dieses Prozesses sind dabei noch völlig unklar. Darin Einblick zu gewinnen wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit durch die Suche nach Zielgenen von Notch in der Myelopoese versucht. Dazu wurden die multipotente myeloische Stammzelllinie FDCP-mix und die granulozytäre Vorläuferzelllinie 32D mit einem durch Tamoxifen aktivierbarem Notch als Zellsysteme gewählt. In dieser Arbeit durchgeführte zytokingesteuerte Differenzierungskinetiken konnten bestätigen, dass die verwendeten FDCP-mix Zellen während ihrer Differenzierung in reife Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten auf RNA-Ebene charakteristische Regulationen von wichtigen myeloischen Transkriptionsfaktoren, Zytokinrezeptoren sowie differenzierungsabhängigen Funktionsproteinen durchlaufen. Sie stellen somit ein optimales Zellsystem zur Analyse von Notch-Zielgenen in der Myelopoese dar. Mit dem Tamoxifen induzierbaren System der Notchaktivierung wurden zuerst bekannte, zentrale Regulationsfaktoren der Myelopoese auf eine Induktion durch Notch im Northern Blot untersucht. Dabei stellte sich als entscheidendes Ergebnis sowohl in 32D als auch FDCP-mix Zellen die direkte, spezifische Induktion des frühen myeloischen Transkriptionsfaktors PU.1 heraus, von dem bekannt ist, dass er myeloische Differenzierung initiiert. Außerdem kam es zu einer indirekten Hochregulation des M-CSF-Rezeptors, der als wichtiges Zielgen von PU.1 bekannt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein extrinsisches Signal, im Organismus durch den Jagged / Notch Signalweg vermittelt, zu einer Aktivierung eines frühen hämatopoetischen Transkriptionsfaktors führt, welcher Zelllinienentscheidungen in der Hämatopoese bestimmt. In Zusammenschau mit den biologischen Wirkungen von Notch in der Hämatopoese weist dies darauf hin, dass extrinsische Mechanismen eine wichtige Rolle in der Regulation der Hämatopoese spielen dürften. Durch ein neu zu etablierendes cDNA-Filter (cDNA-Microarray) Screening-Verfahren konnten dann als weitere wichtige Zielgene von Notch in der Hämatopoese u.a. der Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1), der Interleukin1-Rezeptor-Antagonist (IL1RA), der Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2), sowie c-myc und myb identifiziert werden.

Unzureichende Möglichkeiten in Diagnose und Behandlung von epithelialen Ovartumoren führen zu einer niedrigen Überlebensrate der Patientinnen. Die molekularen Zusammenhänge, die der Progression dieser Krankheit zugrunde liegen, sind noch weitgehend unbekannt und erschweren Verbesserungen in der Früherkennung und Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der Affymetrix Genchip-Technologie die Genexpressionsprofile von elf Ovartumor-Zelllinien mit denen von zwei IOSE-Zelllinien, die aus normalen Epithelzellen des Ovars etabliert wurden, verglichen. So sollten Gene identifiziert werden, welche die Tumorzellen von den normalen Zellen unterscheiden und eventuell als diagnostischer Marker oder als Zielgen für therapeutische Zwecke dienen können. Mit besonderem Augenmerk auf Transmembran- bzw. sezernierte Proteine wurden zunächst 21 bzw. sieben Gene in den beiden Gruppen identifiziert, deren Überexpression in Karzinomen des Ovars zum ersten Mal ermittelt wurde. Die Ergebnisse der Affymetrix-Analyse wurden mittels RT-PCR in sieben ausgewählten Genen bestätigt. Die Expressionsanalysen von drei ausgewählten Genen, NMU, JAG2 und L1CAM, wurden auf Ovartumor-Gewebeproben ausgeweitet und eine mögliche Rolle in der Tumorgenese des Ovarkarzinoms diskutiert. Da für L1CAM spezifische Antikörper zur Verfügung standen, konnte gezeigt werden, dass die Abundanz der L1CAM-mRNA mit der Protein-Abundanz korrelierte und die Lokalisierung in der Zelle wie erwartet in der Plasmamembran erfolgte. Die Expression von L1CAM konnte immunhistochemisch in Paraffinschnitten von Ovarkarzinomen nachgewiesen werden. Zu einem geringeren Prozentsatz konnte das Zelladhäsionsmolekül auch in Borderline-Tumoren, die in der Regel durch eine gute Prognose gekennzeichnet sind, und Fibromen identifiziert werden. In malignen Ovartumoren nicht epithelialer Herkunft konnte keine L1CAM-Expression festgestellt werden. Zeitgleich wurde die Überexpression von L1CAM in Ovarkarzinomen beschrieben und das Molekül als prognostischer Marker in Karzinomen des Ovars, Uterus und des Endometriums identifiziert. Durch funktionelle Analysen sollte die Funktion von L1CAM in Ovartumorzellen untersucht werden. Bei der Klonierung von L1CAM wurde festgestellt, dass aus den verwendeten Ovartumor-Zelllinien nur eine Isoform des Gens isoliert werden konnte, in der die Exons 2 und 27 deletiert sind. In stabilen L1CAMΔ2,27-Transfektanten konnte gezeigt werden, das die Expression dieser Isoform zu erhöhter Adhäsion an Laminin im Vergleich zu Vektor-Transfektanten führt. Die Invasionsfähigkeit der Transfektanten wurde durch die ektopische L1CAMΔ2,27-Expression nicht verändert. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit unter der Verwendung der Genchip-Technologie die zwei potenziellen Markergene NMU und JAG2 identifiziert, die in weiteren Analysen auf ihre Bedeutung in Ovarkarzinomen untersucht werden müssen. L1CAM wurde in immunhistochemischen Studien als Marker identifiziert, dessen prognostischer Wert in Zukunft die Diagnose und Therapie dieser aggressiven Erkrankung verbessern könnte. Zudem bieten die vielfältigen Funktionen von L1CAM Möglichkeiten bei der therapeutischen Intervention durch monoklonale Antikörper, die durch die Expression einer Spleißvariante in Ovartumorzellen spezifiziert werden könnte.

Wed, 17 Dec 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6337/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6337/1/Timm_Alexandra.pdf Timm, Alexandra ddc:500, ddc:540, Fakultät für Chemie und Pharmazie

Das Epstein Barr Virus (EBV) ist ein ubiquitär vorkommendes Herpesvirus, mit dem etwa weltweit 90% der erwachsenen Bevölkerung permanent infiziert sind. Die zumeist asymptomatisch verlaufende Infektion betrifft primäre B–Zellen des Rachenraumes, die nach Aufnahme des Virus entweder zur Virus-Produktion (lytischer Zyklus) oder zur Proliferation angeregt werden (Latenzprogramm, Entstehung von B-Lymphoblasten). Letzteres wird durch den viralen Transkriptionsfaktor EBNA2 kontrolliert, der durch seine viralen und zellulären Zielgene ruhende B-Zellen in vitro immortalisieren kann. Die EBV-infizierten B-Lymphoblasten werden in vivo effizient durch T-Zellen erkannt und abgetötet. EBV entkommt der Immunantwort durch Persistenz in Gedächtnis-B-Zellen, die vermutlich durch Differenzierung der infizierten B-Lymphoblasten entstehen. Es gibt Hinweise, dass diese Differenzierung EBV-vermittelt unter der Mitwirkung von T-Helfer-Zellen abläuft, was auf eine komplexe Kommunikation des Virus mit dem Immunsystem schließen lässt. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen der EBV-vermittelten B-Zell-Immortalisierung und -Kommunikation untersucht. Ein Vergleich von EBNA2-Zielgenen mit Zielgenen des Protoonkogens c-myc, das bei Überexpression B-Zell-Proliferation induzieren kann, ermöglichte dabei die Unterscheidung von Zielgenen, die mit Proliferation und B-Zell-Kommunikation assoziiert sind. Die methodische Herangehensweise bestand in der Proteom-Analyse (2D-Gelelektrophorese mit massenspektrometrischer Proteinidentifikation), Promotoraktivitäts-Analyse (nukleärer Run-On) und einer umfassenden mRNA-Expressions-Analyse (DNA-Chip-Hybridisierung) konditional oder permanent MYC- oder EBV/EBNA2-abhängig proliferierender Zellen. Die erhaltenen Daten bestätigen, dass die von EBNA2 und MYC gemeinsam induzierten Zielgene in grundlegende Prozesse der Lebenserhaltung wie den Nukleotid-, Protein-, und Polyamin-Stoffwechsel, sowie in die oxidative Stressantwort, DNA-Reparatur und Zellteilung involviert sind. Dagegen waren gegensätzlich regulierte Gene funktionell in den Bereich B-Zell-Signaltransduktion- und B-Zell-Kommunikation einzuordnen. Die EBV-abhängige Proliferation ist sowohl mit der Aktivierung des NFkB-Signalwegs assoziiert, als auch mit der verstärkten Expression zentraler Komponenten der Interferon (IFN)-Antwort (insbesondere STAT1) und mit der Repression von Komponenten des B-Zell-Rezeptors (BCR) und der BCR-Signaltransduktion. Die NFkB-Aktivierung führt zur Induktion von antiapoptotischen Genen und von Chemoattraktoren für T-Helferzellen. Die aus Array- und Protein-Daten hervorgehende EBV/EBNA2-vermittelte Aktivierung des NFkB- und des IFN-Signalweges einerseits und die MYC-vermittelte Repression derselben andererseits könnten das molekulare Bindeglied zwischen EBV-vermittelter T-Zell-Stimulation und MYC-vermittelter Immuntoleranz darstellen. Die chemokinvermittelte T-Zell-Rekrutierung und die vermutlich durch STAT1-Expression begünstigte Antigen-präsentation weisen T-Zellen eine aktive Rolle bei der Reifung von EBV-infizierten Lymphoblasten zu B-Gedächtniszellen zu.