Podcasts about b zellentwicklung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, molekulare Vorgänge während der B-Zellentwicklung in der Bursa Fabricii des Haushuhns mittels proteomischer Analysen zu charakterisieren. Hierfür wurden zunächst repräsentative Zeitpunkte der bursalen B-Zellentwicklung für die Probengewinnung definiert. Daran schlossen sich qualitative Proteomanalysen der Bursa Fabricii zu den gewählten Entwicklungszeitpunkten Embryonaltag 10 (ET10), Embryonaltag 18 (ET18), Tag 2 und Tag 28 nach dem Schlupf an. Diese erfolgten durch Vorfraktionierung der Proben mittels 1D-SDS-PAGE und nano-HPLC gefolgt von Tandem-MS-Analysen. Hierbei konnten für die bursalen Proteome zu jedem Zeitpunkt zwischen 1152 und 1392 Proteine identifiziert werden (FDR < 1 %). Überschneidungen der einzelnen Zeitpunkte in 537 allgemeinen Struktur- und Stoffwechsel-Proteinen berücksichtigt, wurden insgesamt 2214 verschiedene Proteine identifiziert. Eine zusätzliche qualitative Analyse aufgereinigter bursaler B-Zellen führte zur Identifizierung von 758 Proteinen. Durch genontologische Analysen konnte festgestellt werden, dass für das Zellwachstum verantwortliche Proteine va. zu den frühen Zeitpunkten zu finden waren, während Proteine, welche eine Rolle für das Immunsystem spielen, eher zu späteren Entwicklungszeitpunkten in Erscheinung traten. Dies spiegelt die Entwicklung der Bursa von der unreifen, embryonalen Wachstums- und Differenzierungsprozessen unterliegenden Bursaanlage, zum fertig ausdifferenzierten, primär-lymphatischen Organ auf molekularer Ebene wider. Konform zu den hohen Proliferationsraten der B-Zellen während der Bursaentwicklung fanden sich in den genontologischen Analysen der B-Zellen besonders hohe Anteile an Proteinen, welche für Zellteilung verantwortlich sind. Proteine, welche in Zusammenhang mit Zellmigration stehen, wurden vor allem in der B-Zell-Probe sowie an ET10 gefunden, was als Hinweis auf eine Beteiligung dieser Proteine an der Einwanderung der B-Zellen in die Bursaanlage betrachtet werden kann. Die anschließende quantitative Proteomanalyse wurde zu denselben Entwicklungszeitpunkten an je sechs biologischen Replikaten mittels 2D-DIGE durchgeführt. In der statistischen Auswertung der quantitativen Veränderungen zeigten sich 402 hochsignifikante Unterschiede zwischen den bursalen Proteomen der verschiedenen Entwicklungszeitpunkte, wobei die sehr große Übereinstimmung der Analyseergebnisse innerhalb der biologischen Replikate die gute Reproduzierbarkeit der Experimente belegte. Die deutlichsten Veränderungen zeigten sich zwischen ET10 und allen weiteren Zeitpunkten, wohingegen innerhalb der übrigen Stadien eine geringere Anzahl signifikanter Unterschiede nachgewiesen wurde. Für die 402 differentiell exprimierten Proteine konnten verschiedene charakteristische Protein-expressionsverläufe nachgewiesen werden, welche Rückschlüsse auf die biologischen Hintergründe ermöglichten. Durch massenspektrometrische Analysen der Proteine mittels MALDI-TOF/TOF und LC-MS/MS gelang es, 203 der 242 zur Identifikation vorgesehenen Spots zu identifizieren. Im Rahmen einer bioinformatischen Auswertung des erhaltenen Datensatzes erbrachten sowohl die genontologische Analysen als auch Pathway-Analysen wesentliche Anhaltspunkte für die Auswahl besonders interessanter und vielversprechender Proteine für weiterführende funktionelle Analysen. Unter den identifizierten, differentiell exprimierten Proteinen fanden sich auffällig viele Vertreter des Aktin-Zytoskelett-Pathways, welcher für die mechanische Stabilisierung von Zellen und deren aktive Bewegungen verantwortlich ist. Dabei fielen in dieser Arbeit sowohl Vinculin als auch Gelsolin durch ihre charakteristischen Expressionsmuster auf. Vinculin zeigte zu Beginn der embryonalen Entwicklung erhöhte Abundanzwerte, welche nach ET18 steil abfielen. Als fokales Adhäsionsprotein stellt es ein Schlüsselprotein in der Regulation der Übertragung von kontraktilen Kräften dar, welche die Voraussetzung für die Migration von Zellen sind. Gelsolin, ein wichtiges Apoptose-Effektorprotein, welches auch in Verbindung mit Zellmotilität gebracht wird, zeigte erhöhte Expressionslevel an ET18, welche über die nachfolgenden Entwicklungszeitpunkte abfielen. Gelsolin konnte in drei verschiedenen Ladungs-Isoformen detektiert werden. Für die Fragestellung dieser Arbeit interessant erschien weiterhin eine Gruppe differentiell exprimierter Proteine des Retinolsäure-Metabolismus. Im Einzelnen wurden die Retinaldehydrogenase 2 (ALDH1A2), das „retinol-binding protein 5“ (RBP5), das „fatty acid-binding protein 7“ (FABP7), und Transthyretin (TTR) mit ähnlichen Proteinexpressions-profilen detektiert, welche ihr Expressionsmaximum jeweils an ET10 aufwiesen. Das könnte ein Hinweis sein, dass die embryonale Entwicklung der Bursa Fabricii von ähnlichen Faktoren gesteuert ist wie die embryonale Ausbildung der sekundär-lymphatischen Organe beim Säuger, bei der Retinolsäure-abhängige Proteine eine entscheidende Rolle spielen. Über die Thematik dieser Arbeit hinausgehend, stellt der umfangreiche proteomische Datensatz dieser Arbeit eine wertvolle Ressource dar, die sowohl für weitere Fragestellungen bezüglich der Bursa Fabricii des Huhns, als auch für die Vervollständigung der Annotation des Hühnergenoms genutzt werden können.

Der Transfer von Genen ist eine unverzichtbare Methode für die Erforschung von Genfunktionen in vivo, für die gezielte Expression von Proteinen oder RNA-Molekülen, sowie für die Entwicklung von Gentherapien z.B. gegen Krebserkrankungen oder genetische Defekte. Gerade unter gentherapeutischen Gesichtspunkten sind virale Gentransfervektoren von Interesse, mit deren Hilfe beispielsweise fehlende bzw. eingeschränkte Genfunktionen wiederhergestellt werden können. Ebenso vorstellbar ist der Einsatz viraler Vektoren für Immunisierungen, die z.B. zur Auslösung tumorspezifischer zellulärer Immunantworten führen. Wünschenswert ist in diesem Zusammenhang besonders eine zellspezifische Expression von Transgenen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb lentivirale Vektoren entwickelt, mit deren Hilfe eine konstitutive Genexpression in B-Zellen ermöglicht wurde. Die Beschränkung der Genexpression auf B-Zellen wurde durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Lentivirale Vektoren haben sich in jüngster Zeit zu interessanten Werkzeugen für die Gentherapie sowie zu vielversprechenden Vakzinkandidaten entwickelt. Mit Hilfe dieser Gentransfervektoren können zahlreiche verschiedene Zelltypen, darunter auch hämatopoetische Zellen einschließlich der Immunzellen, in vitro und in vivo transduziert werden, wobei die Spezifität der Antigenexpression auf der Wahl eines entsprechenden Promotors beruht. Als Transgene wurden das verbesserte grün-fluoreszierende Protein eGFP (enhanced green fluorescent protein; im Folgenden als „GFP“ bezeichnet) und das Hühnerei-Albumin (im Folgenden als „OVA“ bezeichnet) exprimiert. Anhand umfangreicher Analysen der GFP-Expression in Knochenmarkschimären konnte die B-Zellspezifität der generierten Vektoren überprüft werden. Desweiteren wurden die lentiviralen Vektoren auch systemisch (intravenös) angewandt. Hier konnte gezeigt werden, dass die Spezifität der Genexpression mit dieser Applikationsroute erhalten bleibt, wohingegen die Expressionsstärke im Vergleich zu den Chimären erheblich zurückgeht. Funktionelle Studien mit B-zellspezifischen, OVA-kodierenden lentiviralen Vektoren konnten jedoch belegen, dass die Expressionsstärke nach systemischer Anwendung noch ausreichend war, um eine OVA-spezifische zelluläre Immunität zu stimulieren. Damit erwies sich das System auch hinsichtlich möglicher therapeutischer Anwendungen, z.B. als Vakzine, als funktionell. Eine humorale Antikörperantwort gegen virale Hüllproteine bzw. gegen OVA konnte nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend belegen diese Daten, dass die systemische Anwendung B-zellspezifischer lentiviraler Vektoren möglich ist und einen interessanten Ansatz zur Generierung neuer Vakzine bieten kann. Denkbar wäre beispielsweise eine Anwendung bei der Unterstützung therapeutischer Vakzinierungen. Ein weiterer interessanter Aspekt in diesem Zusammenhang ist die Rolle der B-Zelle als antigenpräsentierende Zelle, die mit Hilfe einer temporären Kontrolle der Genexpression genauer untersucht werden könnte. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch ein induzierbares gammaretrovirales Genexpressionssystem entwickelt, um ein gezieltes An- und Abschalten der Genexpression in B-Zellen zu erreichen. Die Beschränkung auf B-Zellen wurde hier ebenfalls durch die Wahl eines entsprechenden zellspezifischen Promotors gewährleistet. Detaillierte in vivo-Analysen des Expressionssystems in Knochenmarkschimären zeigten jedoch, dass es einerseits nach Induktion nur zu einer schwachen Transgenexpression kam und es andererseits eine unerwünschte Hintergrundexpression sowohl in B-Zellen als auch in Nicht-B-Zellen gab. Aus diesen Gründen musste von der Anwendung dieses Systems für geplante Studien zur Rolle der Genexpression während verschiedener Stadien der B-Zellentwicklung abgesehen werden.

Mon, 12 Dec 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5025/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5025/1/Hoemig_Cornelia.pdf Hömig, Cornelia ddc:570, ddc:500, Fakul

Der menschliche Igl-Enhancer besteht aus den drei DNase I-hypersensitiven Regionen HSS-1, -2 und -3, wobei HSS-3 den eigentlichen Enhancer darstellt und HSS-1 und -2 gemeinsam auf HSS-3 synergistisch wirken. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die B-zellspezifische Region HSS-2 näher einzugrenzen und zu charakterisieren. Dazu wurden transiente Transfektionen und In-vivo-Footprinting-Versuche durchgeführt. Die Transfektionsexperimente erfolgten mit den reifen B-Zelllinien MN60 und Daudi. Dazu wurden Luciferasereportergenkonstrukte mit Punktmutationen in den beiden NFkB-Bindungsstellen von HSS-2 oder mit 5’- bzw. 3’-Deletionen in HSS-2 eingesetzt. Die Auswertung der Daten ergab, daß der Transkriptionsfaktor NFkB eine sehr wichtige Rolle in der Regulierung des humanen Igl-Locus spielt. Die Transkriptionskontrolle durch NFkB erfolgt als Bestandteil von Transkriptionskomplexen unter anderem über die Öffnung des Chromatins, womit die DNA auch für andere Faktoren zugänglich wird. Die anschließenden In-vivo-Footprinting-Versuche sollten Aufschluß über die Proteinbedeckung der genomischen DNA von B-Zellen in HSS-2 geben. Für die Untersuchungen wurden die reifen B-Zelllinien Daudi und MN60, die Prä-B-Zelllinie BV173, die T-Zelllinien Jurkat und CCRF-CEM und die myeloische Zelllinie K562 verwendet und zum Teil mit PMA oder TPCK vorbehandelt. Als Nachweismethode diente die LMPCR, als Vergleichs-DNA die freie Plazenta-DNA AF. Den meisten geschützten Sequenzbereichen, deren Anordnung eine Unterteilung von HSS-2 in zwei Teile ermöglicht, konnten mit der Datenbank Transfac bestimmte Faktoren zugeordnet werden. Einige der identifizierten Proteine spielen in der B-Zellentwicklung eine wichtige Rolle. Eine wahrscheinliche Bindung an die Sequenz des HSS-2-Bereichs ist von E47, Ikaros und NFkB anzunehmen. Alle drei stellen Transkriptionsfaktoren dar, die die B-Zellentwicklung und -differenzierung in verschiedenen Stadien steuern. Als Masterfaktor für die Chromatinöffnung im Igl-Locus kommt vermutlich E47 in Frage, die synergistische Wirkung von HSS-2 wird wahrscheinlich durch NFkB, Ikaros und E47 entscheidend beeinflußt.

Der menschliche Igl-Enhancer besteht aus den drei DNase I-hypersensitiven Regionen HSS-1, -2 und -3, wobei HSS-3 den eigentlichen Enhancer darstellt und HSS-1 und -2 gemeinsam auf HSS-3 synergistisch wirken. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die B-zellspezifische Region HSS-2 näher einzugrenzen und zu charakterisieren. Dazu wurden transiente Transfektionen und In-vivo-Footprinting-Versuche durchgeführt. Die Transfektionsexperimente erfolgten mit den reifen B-Zelllinien MN60 und Daudi. Dazu wurden Luciferasereportergenkonstrukte mit Punktmutationen in den beiden NFkB-Bindungsstellen von HSS-2 oder mit 5’- bzw. 3’-Deletionen in HSS-2 eingesetzt. Die Auswertung der Daten ergab, daß der Transkriptionsfaktor NFkB eine sehr wichtige Rolle in der Regulierung des humanen Igl-Locus spielt. Die Transkriptionskontrolle durch NFkB erfolgt als Bestandteil von Transkriptionskomplexen unter anderem über die Öffnung des Chromatins, womit die DNA auch für andere Faktoren zugänglich wird. Die anschließenden In-vivo-Footprinting-Versuche sollten Aufschluß über die Proteinbedeckung der genomischen DNA von B-Zellen in HSS-2 geben. Für die Untersuchungen wurden die reifen B-Zelllinien Daudi und MN60, die Prä-B-Zelllinie BV173, die T-Zelllinien Jurkat und CCRF-CEM und die myeloische Zelllinie K562 verwendet und zum Teil mit PMA oder TPCK vorbehandelt. Als Nachweismethode diente die LMPCR, als Vergleichs-DNA die freie Plazenta-DNA AF. Den meisten geschützten Sequenzbereichen, deren Anordnung eine Unterteilung von HSS-2 in zwei Teile ermöglicht, konnten mit der Datenbank Transfac bestimmte Faktoren zugeordnet werden. Einige der identifizierten Proteine spielen in der B-Zellentwicklung eine wichtige Rolle. Eine wahrscheinliche Bindung an die Sequenz des HSS-2-Bereichs ist von E47, Ikaros und NFkB anzunehmen. Alle drei stellen Transkriptionsfaktoren dar, die die B-Zellentwicklung und -differenzierung in verschiedenen Stadien steuern. Als Masterfaktor für die Chromatinöffnung im Igl-Locus kommt vermutlich E47 in Frage, die synergistische Wirkung von HSS-2 wird wahrscheinlich durch NFkB, Ikaros und E47 entscheidend beeinflußt.