Podcasts about lipoplexen

In der vorliegenden Arbeit wurden A549 Zellen, als Modell für Epithelzellen der Lunge, mittels nicht-viralen Gentransfers mit pDNA bzw. mRNA kodierend für das sekretorische Protein mSEAP transfiziert. Die höchste Transgen-Expression konnte durch den mRNA-vermittelten Gentransfer erreicht werden, unabhängig von dem verwendeten Genvektor. Die Messung der Aktivität von mSEAP im Medium nach mRNA Transfektion mit Liposomen ergab eine Konzentration von maximal 1 ng/50 µl nach 24h, 5 ng/50 µl nach 48h und 7,5 ng/50 µl nach 72h. Für die pDNA Transfektion ergaben sich Konzentrationen für mSEAP von 400 pg/50µl nach 24 h, 700 pg/50 µl nach 48 h und 800pg/50 µl nach 72 h. Es konnte gezeigt werden, dass es bei der Verwendung von mRNA - vor allem nach Transfektion mit dem kationischen Lipid DMRIE-C - zu einer 9-fachen Steigerung der Proteinsekretion in das Medium der kultivierten Zellen kommt. Weiterhin waren ca. 45% der Zellen bei Verwendung von Lipoplexen mit DMRIE-C/mRNA im Gegensatz zu 15% nach Transfektion von pDNA positiv für mSEAP. Nach Transfektion der mRNA mit dem kationische Polymer b-PEI konnten Konzentrationen von mSEAP im Medium von 10pg, 15pg und 50pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h gemessen werden. Für die Magnetofektion von mRNA ergeben sich Mengen von ca. 150pg, 250pg und 400pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h. Dies entspricht im Vergleich zur Verwendung von pDNA einer 3,3-fachen Steigerung nach Transfektion von mRNA/b-PEI Komplexen, mit der Methode der Magnetofektion einer 4-fachen Steigerung der Proteinexpression. Die erhöhte Proteinexpression kann auf die intrazelluläre Barriere des nukleären Imports von pDNA, welche bei der Verwendung von mRNA nicht notwendig ist, zurückgeführt werden. Die Unterschiede des endosomalen „Escape“ - und dem daraus resultierenden Verhältnis freier mRNA zu komplexierter mRNA im Zytoplasma - könnte eine Erklärung für die geringere Effizienz von Polyethyleniminen im Vergleich zu kationischen Lipiden bei dem Transfer von mRNA sein. Weiterhin konnte mit diesem Modell gezeigt werden, dass humane alveolare Epithelzellen des Adenokarzinoms (A549) - als Modell für humane Lungenepithelzellen - imstande sind, zellfremde Proteine nach Transfer genetischen Materials zu translatieren und zu sezernieren. Eine pulmonale Applikation von therapeutischen Genen kodierend für sekretorische Proteine mittels Vernebelung könnte als nicht-invasive Methode z.B. für die Therapie von Hämophilie A oder B eine Rolle spielen. Weiterführende in vivo Versuche könnten Aufschluss über Serumkonzentrationen des sekretorischen Proteins nach pulmonaler Applikation bringen. Die Verwendung von mRNA als therapeutischem genetischem Material zeigt hierbei Vorteile gegenüber von pDNA, aufgrund der gesteigerten Transgen -Expression, der verminderten Dosis an Transferreagenz, sowie dem fast gänzlich ausgeschlossenen Risiko der insertionellen Mutagenese.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten Einzelmolekül-Messungen zur Bindung von myristoyliertem Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt werden. Die Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC) und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine Signal/Rausch-Analyse ermöglichte die Bestimmung der Sensitivität und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde für verschiedene prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso stärker, je höher der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten überein, die mit etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen, dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren Peptidkonzentrationen möglich sind. FCS stellt eine präzise Methode zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmembranen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Größenverteilung bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales System dar. Unter dem Einfluss eines natürlichen Surfactants (Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung von Alveofact unabhängig von der Ionenkonzentration ein stabiles Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten Plasmiden. Dagegen führte die Inkubation mit Alveofact zu einer langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in diesem Fall nach 60 min eine Größe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex. Mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die Größe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und höhere negative Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der makroskopischen Viskosität der Polymerlösung wurden die Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver Überschussladung wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen Komplexe ein ähnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe ermöglichte also einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.

In den vergangenen zehn Jahren wurden große Fortschritte hinsichtlich einer möglichen Gentherapie angeborener Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose oder a1-Antitrypsinmangel erzielt. Dabei spielt die Gentherapie mittels nichtviraler Genvektoren zunehmend eine größere Rolle. Doch trotz ermutigender Ergebnisse aus einer Reihe von klinischen Studien ist die Effizienz des nichtviralen Gentransfers über eine topische Applikation in die Atemwege bis heute zu gering. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, welchen Wechselwirkungen nichtvirale Genvektorkomplexe im Milieu der Atemwege unterliegen. Dabei konnten Veränderungen der inneren Struktur nichtviraler Genvektorkomplexe unter Einfluss von Surfactant bzw. bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit mit Hilfe von Fluoreszenz-Quenching-Assays und Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) nachgewiesen werden. Auch die Oberflächenladung der kationischen Genvektorkomplexe wurde beeinflusst, wobei in Anwesenheit hoher Konzentrationen von Surfactant eine Ladungsumkehr hin zu negativen Werten gemessen wurde. In Bezug auf die äußere Struktur der kationischen Genvektorkomplexe konnte gezeigt werden, dass in Anwesenheit von Surfactant bei Lipoplexen eine starke Zunahme der Größe beobachtet wurde, während die Größe von Polyplexen sogar leicht abnahm. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass die An- oder Abwesenheit von Salz in physiologischen Konzentrationen bei der Herstellung der Genvektorkomplexe einen Einfluss hat auf die Interaktion von Surfactant mit den Genvektorkomplexen. Um zu ermitteln, inwieweit die Veränderung biophysikalischer Parameter die Funktion der Genvektorkomplexe beeinflusst, wurden das Adhäsionsverhalten der Genvektorkomplexe an der Zelloberfläche und ihre Transfektionseffizienz untersucht. Auch hier waren die Folgen der Interaktion mit Surfactant sehr unterschiedlich ausgeprägt, je nach dem, ob kationische Liposomen oder kationische Polymere als Genvektorsystem verwendet wurden. Um die Effizienz des nichtviralen Gentransfers in die Lunge zu erhöhen, gibt es eine Reihe unterschiedlicher Ansätze. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Anwendbarkeit der Magnetofektion auf die Transfektion von Atemwegsepithelien untersucht. Die Magnetofektion beruht auf dem Prinzip der Anreicherung von Genvektorkomplexen am Zielgewebe mit Hilfe magnetischer Anziehungskräfte. Es konnte eine deutlich bessere Dosis-Wirkungs-Beziehung der über kationische Polymere vermittelten Magnetofektion verglichen mit dem konventionellen über kationische Polymere vermittelten Gentransfer nachgewiesen werden. Hierfür waren sowohl eine stärkere als auch eine schnellere Anreicherung der Genvektorkomplexe an der Zelloberfläche verantwortlich. Die Effizienz der Magnetofektion war bei gegebener Inkubationszeit der Transfektionseffizienz konventioneller nichtviraler Gentransfersysteme deutlich überlegen. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte eine Aufnahme der Genvektorkomplexe in Zellen intakter Atemwegsepithelien mit Hilfe der Magnetofektion nachgewiesen werden.