Podcasts about peptiden

Thomas und Wolfgang sprechen über fortgeschrittene funktionelle Anatomie, wie man Übungen bei fortgeschrittenen Trainierenden auswählt, die Wirkung und Vorteile des Schröpfen und wie Thomas es in seiner Arbeit einsetzt, sowie der Einsatz und die Zukunft von Peptiden, wie BPC157 und TB500.

Von Achillessehne bis Leber: Andreas schwärmt von seinen unglaublichen Erfahrungen mit Peptiden, erzählt die Geschichte dieser geheimnisvollen Aminosäure-Verbindungen und von Vladimir Khavinson.   Zur Website von Andreas' Vertrauensmann in Sachen Peptide und Bioregulatoren Werner Ulrich geht es hier.   Zur Website des St. Petersburger Instituts von Vladimir Khavinson geht es hier.   Die Folge mit Andreas' 5 verrücktesten Hacks zum Nachhören gibt es hier.   Den angesprochenen Q10-Spray von Simone Kumhofers Allergosan gibt es hier. Die Folge mit Stefans biohackender Schwester, der Musikerin Anna Müller, gibt es hier zum Nachhören.

Endlose To-Do-Listen, ungesundes Weihnachtsfeier-Essen und hier und da ein Glas Glühwein zu viel - für unsere Haut ist die Vorweihnachtszeit purer Stress. Wie wir uns trotzdem pünktlich zu den Feiertagen noch einen strahlend-gesunden Glow ins Gesicht zaubern können - das weiß Schönheitschirurgin Dr. Julia Berkei. Sie rät u.a.: „Das Gesicht zweimal nacheinander waschen - ein bewährter Beauty-Tipp aus Korea für eine frische Pfirsichhaut!” Außerdem: warum Kaffee, gemischt mit Kollagen-Pulver, nicht nur wach, sondern auch schön macht. Und wie der dezente Einsatz von Botox oder ein Mix aus Peptiden und Meso-Therapie kurz vor Weihnachten noch wahre Wunder bewirken können - das verrät Dr. Berkei im Gespräch mit Podcast-Host Jennifer Knäble. Noch mehr Last-Minute-Hacks für den perfekten Weihnachts-Glow gibt es in diesem BEAUTY BOOSTER. Zuhören macht schön! -- Mehr über Dr. Julia Berkei auf https://www.drberkei.com -- Informationen zu unseren Podcast Partnern: https://www.wonderlink.de/@buntevipgloss-partner -- Ein BUNTE Original Podcast.

Herzlich willkommen zu einer neuen Folge hier im Podcast ketogener Lifestyle und Biohacking. Schön dass du wieder eingeschaltet hast.  Heute erfährst du alles zum Thema “Peptide, Biohacking und Longevity: Experteninterview mit Sebastian Dietrich“. Heute sprechen wir über ein ganz spannendes Thema mit einem absoluten Experten: Peptide. Hast du davon schon einmal gehört? Wir klären heute: Was sind Peptide? Welche viele verschiedene Arten an Peptiden gibt es? Was bewirken sie? Und was haben sie mit Begriffen wie Biohacking, Gesundheitsverbesserung und Longevity zu tun? Ganz viel Spaß beim Zuhören!  Dein Andreas Connecte dich mit mir auf Instagram: https://www.instagram.com/myketocoach_andi/ Sebastian auf Instagram: https://www.instagram.com/sebastian_inex/ Starte JETZT in deinen Ketogenen Lifestyle mit der kostenlosen 7 Tage #hackyourlife Challenge: ⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://myketocoach.de/7-tage-hackyourlife-challenge/⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠  Hier mehr über exogene Ketone erfahren: ⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://myketocoach.de/exogene-ketone/⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠ Zu den Ketonen: https://myketocoach.de/exogene-ketone-schnell-in-die-ketose/

Longevity Strategien zur Hautverjüngung mit Dr. Dr. Roider Im heutigen Interview geht es um Longevity Strategien zur Hautverjüngung, hierzu ist Dr. Dr. Roider zu Gast. Maximon ist ein Unternehmen, das sich auf Longevity spezialisiert hat und verschiedene Ventures im Bereich gesundes Altern aufgebaut hat.  Die Klinik Ajun bietet diagnostische und therapeutische Dienstleistungen zur Verbesserung der Longevity an. Vitamin D spielt eine Rolle bei der Stärkung der Hautbarriere und kann bei bestimmten Hauterkrankungen wie Schuppenflechte helfen. Autoimmunreaktionen wie Schuppenflechte können durch Veränderungen im Lebensstil und Stressmanagement in Remission gebracht werden.  Die zweite Studie untersuchte die Möglichkeit, ohne Sonnenlicht braun zu werden. Dabei wurde ein neuer Mechanismus entdeckt, der die Hautfarbe verändert. Es wurde ein Enzym namens NNT identifiziert, das den Bräunungsprozess aktiviert. Es gibt auch andere Ansätze zur Verjüngung der Haut, wie z.B. die Kontrolle des Zellmetabolismus, die Immunmodulation und die Anwendung von Mikrotraumata. Vitamin C wird als Antioxidans eingesetzt, während Peptide die Fibroblastensynthese stimulieren und zu einer strafferen Haut führen können.  Kleine Dosen von Sonnenlicht können auch positive Auswirkungen auf die Haut haben. In diesem Teil des Gesprächs geht es um die Auswirkungen von Licht auf die Haut und die Rolle der Biofotomodulation bei der Hautverjüngung.  Es wird erwähnt, dass die Durchblutung der Haut durch UV-Licht angeregt wird, um das Immunsystem zu aktivieren. Die Kombination von Morgensonne, UV-Strahlung und Abendsonne kann vorteilhaft sein. Die hyperbare Sauerstofftherapie wird auch diskutiert und ihre potenzielle Wirkung auf die Hautverjüngung. Es wird erwähnt, dass die Aion-Klinik verschiedene Pakete anbietet, die auf die individuellen Bedürfnisse der Patienten zugeschnitten sind. Du möchtest Epigenetic oder Longevity Coach werden? kostenloser Beratungstermin: https://calendly.com/inex-marina/kostenloses-erstgespraech?month=2024-02 INEX Academy: https://www.inex-health.com/education Zeitstempel und Themen: 00:00 Vorstellung von Dr. Elisabeth Reuter und Maximon 07:15 Die verschiedenen Ventures von Maximon 10:24 Die Klinik Ajun und der ganzheitliche Ansatz von Maximon 14:10 Forschung zu antimikrobiellen Peptiden und Vitamin D 26:42 Herausforderungen bei der Umsetzung von Forschungsergebnissen in ein Unternehmen 34:28 Longevity und Hautverjüngung: Kontrolle des Zellmetabolismus, Immunmodulation und Mikrotraumata 37:16 Antioxidantien, Peptide und Sonnenlicht: Schlüssel zur Hautverjüngung 46:15 Hautverjüngung durch Biofotomodulation und hyperbare Sauerstofftherapie 51:47 Das Konzept der Aion-Klinik: Longevity-Medizin für die obere Mittelschicht 59:21 Investitionen in die Gesundheit: Die Bedeutung von Gesundheitsinvestitionen Links: https://www.ayun.ch/de-ch https://www.maximon.com/

Peptide - Wirkung, Anwendung, Dosierung & Risiken Im heutigen Interview geht es um den Einsatz von Peptiden, insbesondere in der Longevity-Medizin und bei Biohackern, gewinnt zunehmend an Bedeutung. Peptide wie BPC 157, TB 500, Tessamorlin und andere werden eingesetzt, um die Wundheilung, Regeneration und Langlebigkeit zu unterstützen. BPC 157 hat antientzündliche Eigenschaften und fördert die Heilung von Sehnen, Muskeln und Geweben. TB 500 wirkt sich positiv auf das muskuloskelettale System aus und unterstützt die Regeneration von Geweben.  Wachstumshormon-Releasing-Hormone und -Peptide werden verwendet, um den Verlust der Wachstumshormonproduktion zu stoppen und positive Auswirkungen auf die Telomerase-Aktivität und die Langlebigkeit zu erzielen.  In diesem Teil des Gesprächs werden verschiedene Peptide besprochen, die mit Fettverbrennung, Muskelmasse, Cholesterin, Insulinsensitivität und Langlebigkeit in Verbindung stehen.  Es werden auch Peptide erwähnt, die sich positiv auf die Hautgesundheit, das Haarwachstum, die Wundheilung, die Mitochondrienfunktion und die Telomerlänge auswirken können. Es wird empfohlen, auf die Qualität der Peptide zu achten, da einige verunreinigt sein können. Du möchtest Epigenetic oder Longevity Coach werden? kostenloser Beratungstermin: https://calendly.com/inex-marina/kostenloses-erstgespraech?month=2024-02 INEX Academy: https://www.inex-health.com/education Zeitstempel und Themen: 00:00 Der Einsatz von Peptiden in der Longevity-Medizin und beim Biohacking 03:44 BPC 157: Antientzündliche Eigenschaften und Heilungsförderung 11:19 TB 500: Regeneration des muskuloskeletalen Systems 19:54 Tessamorlin: Verbesserung der Körperkomposition 20:49 Peptid zur Verbesserung von Fettverbrennung und Muskelmasse 30:03 Peptid zur Unterstützung der Hautgesundheit und des Haarwachstums 35:11 Peptid zur Verbesserung des Blutzuckermanagements und der Insulinresistenz 38:55 Peptid zur Beeinflussung der Telomerlänge und des Alterns 41:12 Qualität der Peptide und vertrauenswürdiger Hersteller Links: Werde Longevity Coach: https://www.inex-health.com/longevity-coach-ausbildung WIEDER JUNG - Longevity Coaching Programm: https://www.inex-health.com/wiederjung DN Lab Peptide Nutze Gutscheincode INEX15: https://dnlabresearch.com/ref/inexhealth/

In Folge 103 geht es um den Ursprung des Lebens. Wir machen uns auf die Suche nach Staub, extraterrestrischen Peptiden und der Antwort nach der Frage, wo das Leben entstanden ist: Auf der Erde oder im Weltall? Außerdem diskutieren wir darüber, ob eine kosmologische Revolution bevorsteht, warum Voyager 1 wieder mit uns spricht und mit Evi schauen wir den Film “Evolution” und klären, ob Leben auch mit Silizium funktionieren kann. Wenn ihr uns unterstützen wollt, könnt ihr das hier tun: https://www.paypal.com/paypalme/PodcastDasUniversum Oder hier: https://steadyhq.com/de/dasuniversum Oder hier: https://www.patreon.com/dasuniversum

Diese Folge findest du auch im Videoformat unter www.epi-genes.com. Thiemo Osterhaus hat sein Ausbildung zum Sanitäter mit 20 Jahren erfolgreich abgeschlossen und danach ein Jahr im Rettungsdienst gearbeitet, wobei ihm klar wurde, er möchte Mediziner werden und als Arzt später Menschen zu helfen und die Welt ein kleines Stück besser zu machen.  Nach dem ersten Staatsexamen hat Thiemo aber schnell bemerkt, dass die klassische Schulmedizin zwar super für die Akutversorgung von Krankheiten ist, aber Gesundheit nicht wirklich ganzheitlich betrachtet. Das war der ausschlaggebende Grund und zugleich Startschuss, etwas anders machen zu wollen.  Nach mittlerweile über 1000 Stunden Erfahrung als Personaltrainer, dem Aufbau eines Personaltrainer-Teams, Leitung eines Fitnessstudios, erfolgreichem Abschließen von über 30 Zusatzausbildungen und seiner Tätigkeit als Dozent einer Fachhochschule und diversen Sportunternehmen im Gesundheitsbereich sagt Thiemo – Medizin ist nicht gleich Gesundheit. Genau aus diesem Grund hat er die Medletics Akademie gegründet, wo er neuste Erkenntnisse aus Medizin, Ernährung, Training, Regeneration und Psychologie zusammenfließen lässt, sodass daraus ein allumfassendes Gesundheits-Konzept entsteht. Im Interview erfährst du wie Thiemo Inhalte aus der Medizin mit Coaching verknüpft und welche Blutwerte seiner Meinung nach sinnvoll sind für für die tägliche Arbeit von Coaches.  Inhalte: 4:55 min: Thiemos Erfahrungen als Personal Trainer und Schwierigkeiten als Coach, chronischen Entzündungen und Schilddrüsenunterfunktion 6:45 min: suboptimaler Trainingsfortschritt ohne ganzheitliches Coaching 11:15 min: Warum Coaches Blutwerte analysieren müssen  13:40 min: Grundvoraussetzungen für die Hormonproduktion werden von normalen Ärzten nicht bestimmt 19:15 min: die Wichtigkeit der Betrachtung des Hormonsystems für Coaches 26:12 min: Hormonoptimierung birgt immenses Potential  28:10 min: Nährstoffmängel sind weit verbreitet und woher sie kommen 33:50 min: Testosteronlaborwerte werden häufig missverstanden  35:00 min: Testosteronwerte indirekt verbessern 40:53 min: Testosteron natürlich boosten 45:40 min: Testosteron erhöhen über Stressmanagement und Journaling 49:11 min: Hoden auf Eis legen und Biophotomodulation 50:50 min: die Wichtigkeit des Mindeste und von Gewohnheiten  53:45 min: Athleten und Nährstoffmängel 58:30 min: Top drei Testosteron Booster 1:00:00 min: Geranyl Geraniol in der Forschung zur Steigerung von Testosteron 1:01:05 min: Dosierung von Pflanzenstoffen und Studien 1:08:30 min: Langlebigkeit und Substitution von Peptiden und Hormonen 1:09:10 min: SAMRMs 1:11:25 min: Bioidentische Hormonsubstitution 1:16:10 min: APOE4 Genotyp und Alzheimer  1:19:08 min: Wichtige Blutwerte für Personal Trainer und Coaches Links: https://medletics-academy.de/ Buch: der Blutwerte Code

Geringere Kaufprämie für E-Autos: Was ändert sich konkret - NRW innovativ Numaferm, Düsseldorf: nachhaltige Herstellung von Proteinen und Peptiden - Vegane Aktien: Absturz nach dem Boom - Etikettenschule Wein und Sekt - Moderation: Oliver Thoma Von Oliver Thoma.

Zu Gast: Dr. Jannis Beutel, 30 Jahre In den Griechenlandurlaub nahm er damals sein aller erstes Chemie Schulbuch mit und konnte es anschließend in- und auswendig. Er wusste also schon früh welcher Leidenschaft er sich verschreiben würde. Der Chemie! Mit Freunden selber Schwarzpulver machen oder Rauchbomben im Chemieunterricht bauen... Es gibt so einige lustige Chemiegeschichten und gibt auch einige zum Besten in dieser Folge. Außerdem gewährt er uns Einblicke in das Leben als Chemiestudent und Doktorand. Erfahrt alles zu Jannis chemischem Leben und was es mit seiner Doktorarbeit und Aids auf sich hat in dieser Folge von Inspirierend anders. Den Podcast findet ihr auf: www.inspirierendanders.com Abonniert gerne den Newsletter um immer auf dem Laufenden zu bleiben und noch mehr Insights zu den Gästen und dem Podcast vor allen Anderen zu erhalten. Ihr könnt auch gerne auf www.patreon.com/inspirierendanders eine kleine Unterstützung für den Podcast dalassen, wenn er euch gefällt und ihr gerne weiter Content hättet.

Einige der gängigen lebensrettenden Medikamente, wie zum Beispiel Insulin, sind aus Proteinen so groß und zerbrechlich, dass sie intravenös verabreicht, statt eingenommen werden müssen. Aber eine neue Generation an Arzneimitteln -- aus kleineren robusteren Proteinen namens Peptiden -- ist auf dem Weg. In einem kurzen, informativen Vortrag, erklärt Molekülingenieur und TED Partner Christopher Bahl wie er am Computer wirksame Peptide entwickelt, die eines Tages die Grippe ausschalten, gegen Lebensmittelvergiftung schützen und Krebszellen am Wachstum hindern könnten.

Wed, 18 Dec 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16784/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16784/1/Deeg_Andreas.pdf Deeg, Andreas

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen neuen Wirkstoff für die Therapie des Morbus Alzheimer zu entwickeln. Morbus Alzheimer ist die häufigste Demenzerkrankung in Deutschland (1). Charakteristisch für diese neurodegenerative Erkrankung ist die zu-nehmende Verschlechterung der kognitiven Leistungsfähigkeit, die mit einem Untergang von Nervenzellen und Synapsen einhergeht. Für die neuropathologische Diagnose des Morbus Alzheimer ist der Nachweis von extrazellulären Aβ-Plaques und intrazellulären versilberbaren Strukturen, den sogenannten neurofibrillären Bündeln (tangles) entscheidend (5). Die Enzyme, die zu der Bildung dieser Aggregate, die im Wesentlichen aus fehlgefalteten körpereigenen Proteinen, dem β-Amyloid bzw. dem Tau-Protein bestehen, beitragen, sind die primären Zielmoleküle in der Wirkstoffentwicklung auf diesem Gebiet in den letzten 20 Jahren gewesen. So wurde eine große Zahl von Wirkstoffen bzw. thera-peutischen Ansätzen identifiziert, die effektiv in vitro und in vivo die Bildung dieser Aggregate inhibieren (1). Die erhofften Effekte auf die alters- und amyloid-abhängigen Defizite bei der Lern- und Gedächtnisleistung konnten durch klinische Studien jedoch nicht belegt werden (73). Eine mögliche Erklärung für den Misserfolg dieser sehr auf-wändigen Studien ist, dass Veränderungen durch Ablagerungen von fibrillärem Aβ bzw. Tau zu irreversiblen Schädigungen führen und somit eine ausschließlich auf Aβ- bzw. Tau fokussierte Therapie nach Ausbruch der Krankheit möglicherweise nicht ausrei-chend ist. Mit den in der Arbeitsgruppe etablierten zellbasierten Assays ist es möglich, Wirkstoffe zu identifizieren, die die Störung der Speicherung von Kalzium im endoplasmatischen Retikulum (ER), einen pathophysiologisch relevanten Mechanismus der Pathogenese des Morbus Alzheimer, modulieren (120). Dieser Ansatz verfolgt somit nicht die seit Jahren praktizierte Strategie, die Aβ- bzw. Tau-Aggregation direkt zu hemmen, sondern der für die Akkumulation dieser Proteine ursächlichen Schädigung von Nervenzellen und deren synaptischen Kontakten entgegenzuwirken. Ziel war es, innovative Wirkstoffe zu entwickeln, die Störungen der zytosolischen Kalziumkonzentration bzw. der Kal-ziumfreisetzung aus dem ER in einer frühen Phase der neuronalen Schädigung normali-sieren. Optimierte Vertreter der neu entdeckten Strukturklasse der Tetrahydrocarbazolamine stabilisieren in der Tat die Kalziumfreisetzung aus dem ER, verbessern den Energiehaushalt der Zelle und verringern die Bildung toxischer Aβ-Peptide. Der genaue Wirkmechanismus der Tetrahydrocarbazolamine konnte in dieser Arbeit jedoch nicht entschlüsselt werden und wird Gegenstand zukünftiger Forschungs-projekte sein müssen. Als mögliches Target bieten sich zum Beispiel IP3-Rezeptoren an. Eine mögliche Interaktion mit diesen könnte dazu führen, dass weniger Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum in das Zytosol austritt. Die identifizierten Verbindungen haben zusätzlich einen positiven Effekt auf die Aktivität der Mitochondrien, was wiederum zu einer Steigerung der Energiebereitstellung der Zelle führt und einen Effekt auf die Produktion von Aβ-Peptiden hat (56). Auch Kalzium beeinflusst über eine indirekte Hemmung der β-Sekretase die Menge an gebildetem Aβ (157). In Folge dessen wirken Tetrahydrocarbazolamine sehr wahrscheinlich über verschiedene Mechanismen auf die Bildung der toxischen Aβ-Peptide. Eine synergistische Verstärkung ist daher durchaus denkbar. Tetrahydrocarbazolamine besitzen somit eine Wirkung auf drei verschiedene Mechanismen, die bereits zu Beginn der Pathogenese von Morbus Alz-heimer eine wichtige Rolle spielen. Zurzeit befinden sich nach den uns zugänglichen Informationen keine anderen Substanzen in der präklinischen oder klinischen Entwick-lung, die ein ähnlich breites Wirkprofil aufweisen. In den anschließend durchgeführten Therapieversuchen in transgenen Mausmodellen des Morbus Alzheimer konnte allerdings kein Effekt auf die Anzahl und Größe von Plaques festgestellt werden. Dies ist vermutlich vor allem der kurzen Behandlungsdauer zuzuschreiben. Eine längere Behandlung mit gea_133 war auf Grund einer Lebertoxizität, die wahrscheinlich ursächlich für das Sterben der Tiere in der 3. Behandlungswoche war, nicht möglich. Ein zentraler Punkt der zukünftigen Erforschung dieser Substanzklasse wird die Entwicklung und Testung von Derivaten sein, die keine Lebertoxizität aufweisen.

Die Mastitis des Rindes ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchwirtschaft. Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) zählen zu den wichtigsten Mastitiserregern, die jedoch zumeist sehr unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen. So verursacht E. coli hauptsächlich transiente, akute klinische Mastitiden, während S. aureus als bedeutendster Verursacher chronischer bis subklinischer Mastitiden mit persistierendem Verlauf angesehen wird. In den letzten Jahrzehnten wurde die Pathophysiologie der entzündeten Milchdrüse eingehend wissenschaftlich bearbeitet. Frühe Zeitpunkte einer intramammären Infek-tion, zu denen die Pathogene zwar bereits erkannt wurden, aber noch keine klinischen Symptomen in Erscheinung getreten sind, wurden bislang in vivo noch nicht untersucht. Zu den ersten wirtsseitigen Ereignissen nach dem Eindringen und Erkennen der Patho-gene zählen Veränderungen in der Abundanz von mRNA-Transkripten immun-relevanter Gene. Vertreter dieser differentiell exprimierten Gene gehören z.B. zu den Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden. Diese sollen es dem Wirt ermöglichen, eine adäquate Immunantwort zu initiieren, welche als entscheidend für den klinischen Verlauf der Erkrankung gilt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur Simulation der ersten 3 h nach dem Eindringen der Pathogene E. coli und S. aureus in das Euter etabliert. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Untersuchung von Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene nach unterschiedlich langer Erregerexposition (1-3 h) in verschiedenen Kompartimenten der Milchdrüse. Dabei wurden die Lokalisationen Zitzenzisterne (ZZ), Drüsenzisterne (DZ) und das ventrale Euterparenchym (EU) näher untersucht. Großes Augenmerk lag auf einer strengen Standardisierung der Versuchs-tiere, um die Vergleichbarkeit der erzielten Ergebnisse sicherzustellen. Der Versuch umfasste 12 erstlaktierende Kühe der Rasse Holstein-Friesian mit makelloser Allgemein- und Eutergesundheit und einer Zellzahl < 50.000/ml Milch in allen 4 Eutervierteln. Bei den Tieren wurden 3 Euterviertel jeweils sequentiell über einen Zeitraum von 1, 2 und 3 h entweder mit 5*106 CFU E. coli1303 (n = 6) oder S. aureus1027 (n = 6) intrazisternal inokuliert. Ein Kontrollviertel blieb unbehandelt und diente der Ermittlung von Basisexpressionswerten. Mit Hilfe der unterschiedlich lange inokulierten Viertel konnte ein zeitlicher Verlauf der Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene extrapoliert werden. Wie erwartet traten innerhalb des dreistündigen Versuchszeitraumes keinerlei klinische Effekte bei den Versuchstieren auf. Die innere Körpertemperatur, der Leukozytengehalt im Blut, der SCC und verschiedene Milchinhaltsstoffe erfuhren keine Veränderungen, die auf die Pathogen-Exposition zurückzuführen waren. Durch wiederholte Unter-suchung von Milchproben im Versuchsverlauf wurde die bakterielle Vermehrung analysiert. Hierbei konnte eine Vervielfachung von E. coli um durchschnittlich das 30-fache festgestellt werden, wohingegen sich S. aureus innerhalb der ersten 3 h p. inoc. vergleichsweise schwach vermehrte (durchschnittlich 1,8-fach). Die beiden im Tiermodell verwendeten Bakterienstämme wurden parallel in vitro in Milch und in Nährmedium kultiviert, um deren Wachstum und Adaptationsfähigeit zu untersuchen. E. coli erreichte nach 14-stündiger Inkubation in Milch ein Maximum von 1,2*109 ± 2,5*108 CFU/ml (MW ± SD), während S. aureus mit 5,3*108 ± 8,9*108 CFU/ml (MW ± SD) eine deutlich schwächere und heterogenere Vermehrung zeigte. Im Anschluss an diese Vorinkubation in Vollmilch wurde untersucht, ob sich die Pathogene an das spezifische Wachstumsmedium Milch anpassen konnten. Nach Umsetzen in frische Vollmilch zeigten die Pathogene jedoch kein verbessertes und beschleunigtes Wachstum im Vergleich zu in standardisiertem Medium vorkultivierten Bakterien. Um die Vergleichbarkeit mit früheren Experimenten sicherzustellen, wurden E. coli und S. aureus deshalb mit Nährmedium für die in vivo-Versuche präpariert. Drei Stunden nach Inokulation des ersten Euterviertels wurden die Tiere getötet und Gewebeproben innerhalb von 20 min aus den drei zu untersuchenden Lokalisationen (ZZ, DZ, EU) der einzelnen Euterviertel gewonnen. Die Proben wurden unmittelbar nach Entnahme in Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufarbeitung bei -80°C tiefgefroren. Im Rahmen weiterer Untersuchungen fand dann die mRNA-Extraktion sowie die Analyse der Transkript-Abundanzen entzündungsrelevanter Kandidatengene (IL6, TNF, CXCL8, CCL20, S100A9, LAP, LCN2, MX2 und CYP1A1) mittels qRT-PCR statt. Die Auswahl geeigneter Gene erfolgte sowohl anhand eines orientierenden Vorversuchs in vivo als auch anhand bekannter, in vergleichbaren in vitro-Experimenten regulierten Genen der Milchdrüsenepithelzelle. Es konnte gezeigt werden, dass die Expressionsänderungen nach Kontakt mit E. coli deutlich stärker und homogener ausfielen als nach Kontakt mit S. aureus. Bereits nach 1-stündiger Erregerexposition konnten signifikante Steigerungen der mRNA-Expression einiger Gene verzeichnet werden. Dies galt vor allem für die Chemokine CCL20 und CXCL8 sowohl nach Exposition mit E. coli, als auch mit S. aureus. Für die Zytokine IL6 und TNF konnte eine rasche mRNA-Expressionssteigerung nach 1-stündiger intramammärer Inokulation von E. coli nachgewiesen werden, während eine Regulation im Euter mit S. aureus inokulierter Tiere erst nach 2 h und vergleichsweise schwächer eintrat. Die antibakteriell wirkenden Faktoren S100A9 und LAP waren den Chemo-kinen und Zytokinen zeitlich nachgeschaltet, wurden aber nur nach Exposition mit E. coli deutlich hochreguliert. Im Gegensatz zu in vitro-Untersuchungen mit Milch-drüsenepithelzellen konnte für die Gene LCN2, MX2 und CYP1A1 keine nennenswerte Regulation nach Inokulation mit E. coli und S. aureus festgestellt werden. Des Weiteren fiel auf, dass die untersuchten Kandidatengene invariant stärker in ZZ und DZ heraufreguliert wurden, als im EU. Meist ähnelten sich ZZ und DZ in Stärke und Verlauf der Expressionsänderung. Im ventralen Euterparenchym dagegen konnte nach Inokulation von E. coli nur für die Gene IL6, TNF, CXCL8 und S100A9 eine vergleichsweise schwache, aber statistisch signifikante Steigerung der mRNA-Expression aufgezeigt werden. Nach Inokulation mit S. aureus konnte in dieser Lokalisation keine Hochregulation der untersuchten Kandidatengene festgestellt werden. Das in dieser Arbeit etablierte Tiermodell zeigt erstmalig in vivo die frühe patho-genspezifische und kompartimentabhängige Regulation immunrelevanter Gene im Eutergewebe der Milchkuh auf. Es bietet damit eine gute Basis für holistische Ansätze zur Untersuchung sehr früher Ereignisse bei der Wirt-Pathogen-Interaktion. Mittelfristig soll hiermit aufgeklärt werden, welche wirts- und pathogenseitigen Mechanismen zur Entstehung akuter und chronischer Mastitiden führen und welche Faktoren persistente Infektionen der Milchdrüse fördern oder verhindern. Detaillierte Kenntnisse über solche frühen Ereignisse ebnen den Weg, Ansätze für eine verbesserte Mastitis-Diagnostik, -Prophylaxe und -Therapie bei der bovinen Mastitis zu finden.

Donald Fraser ist Professor für Erdwissenschaften an der Universität Oxford und verbringt derzeit als Gast von Prof. Bernd Michael Rode ein Sabbatical in Innsbruck. Gemeinsam mit den Chemikern um Rode möchte der renommierte britische Wissenschaftler den Geheimnissen um die Entstehung des Lebens auf die Spur kommen. Experimente mit Peptiden und Tonmineralen versprechen neue Erkenntnisse.

Während der Tumorangiogenese werden neue, tumorspezifische Blutgefäße gebildet. Bei diesem Prozess wird unter anderem der Hauptbestandteil der Basalmembran das Kollagen IV durch die Matrix-Metalloproteasen (MMP) 2 und 9 enzymatisch gespalten. Dabei werden bisher verborgene Bereiche der Kollagen IV α-Stränge freigelegt, welche Endothelzellen als Migrationssignale dienen. Diese als kryptische Bindungsstellen bezeichneten Bereiche sind kennzeichnend für angiogene Blutgefäße. Ziel der Untersuchungen war, ein Oligopeptid zu finden, welches spezifisch an diese Bindungsstellen bindet, das möglicherweise als Konjugat für therapeutisch wirksame Radionuklide und Zytostatika in Frage kommt. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes in vivo/in vitro Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek durchgeführt und ein Phage isoliert, der an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV bindet und die Oligopeptidsequenz TLTYTWS präsentiert. Im Rahmen einer Phagen-Biodistribution mit LLC Tumor-tragenden Mäusen konnte eine spezifische Anreicherung des Phagen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Der Phage weist also die Fähigkeit auf, sich im Tumorgewebe anzureichern. Diese Eigenschaft wird auch als „Tumor-homing“ bezeichnet. Die von dem Phagen präsentierte Peptidsequenz wurde zur chemische Synthese des TLTYTWS-Oligopeptids verwendet. Dieses Oligopeptid ist in der Lage, in vitro die Bindung des Phagen an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV dosisabhängig zu inhibieren. Weiterhin kann durch Koinjektion des TLTYTWS-Phagen und des TLTYTWS-Oligopeptids bei LLC Tumor-tragenden Mäusen die Akkumulation des Phagen im Tumorgewebe inhibiert werden, was die Spezifität des „Tumor-homings“ belegt. Zudem reduziert das TLTYTWS-Oligopeptid dosis-abhängig die Endothelzell-Differenzierung in vitro im Tube-Formation Assay und die Angiogenese in vivo im Matrigel-Plug Assay. Auf Grund dieser Charakteristika eignet sich das Oligopeptid möglicherweise zum Einsatz in der Diagnostik oder Therapie in der Onkologie.

Die Reaktivierung von Herpesviren, wie EBV, CMV und HHV-6, kann bei Patienten nach einer allogenen Stammzelltransplantation zu schwerwiegenden Erkrankungen und sogar zum Tod führen. Zur Behandlung von EBV- oder CMV-assoziierten Komplikationen hat sich in der Vergangenheit der adoptive Transfer von virusspezifischen T-Zellen, die aus dem T-Zellgedächtnis des Stammzellspenders isoliert wurden, als wirksam und gut verträglich erwiesen. Patienten mit einem CMV-negativen Transplantatspender haben ein erhöhtes Risiko für CMV-assoziierte Erkrankungen, und gerade in diesem Fall fehlt eine adoptive Therapie, weil CMV-spezifische T-Zellen von einem solchen Spender nicht verfügbar sind. Um dieses Problem zu lösen, habe ich in meiner Arbeit die Herstellung von CMV-spezifischen T-Zellen mittels retroviralem Transfer des spezifischen T-Zellrezeptors untersucht. Zuerst habe ich CD4+ und CD8+ T-Zellklone mit verschiedenen HLA-Restriktionen, die die endogen prozessierten und präsentierten CMV-Antigene pp65 und IE-1 erkennen, aus dem T-Zellgedächtnis von CMV-positiven Spendern generiert und charakterisiert. Für den retroviralen Transfer wurden vier pp65-spezifische T Zellrezeptoren unterschiedlicher HLA-Restriktionen ausgewählt. Die Gene der TCRs wurden kloniert und auf primäre T-Zellen CMV-negativer Spender übertragen. CMV-TCR-transgene T Zellen zeigten ein breites Spektrum an wichtigen Effektorfunktionen wie die Freisetzung von IFN-γ und IL 2 sowie Zytotoxizität und Proliferation gegenüber endogen prozessiertem pp65, und die Zellen konnten durch strikt antigenspezifische Stimulation angereichert und expandiert werden. Die Expansion der TCR-transgenen Zellen war von einem Anstieg der spezifischen Effektorfunktionen begleitet, was zeigt, dass die übertragene Spezifität stabil und voll funktionsfähig war. Deshalb erwarte ich, dass diese CMV-TCR-transgenen T-Zellen sich für die effektive Kontrolle einer akuten CMV-Infektion eignen und darüber hinaus für ein antivirales Gedächtnis sorgen werden. Auch die Reaktivierung von HHV-6 führt in immunsupprimierten Patienten zu ernsthaften Erkrankungen. Leider ist es allerdings bisher nicht möglich, HHV-6-spezifische T Zellen für den adoptiven Transfer herzustellen, weil die Antigene und Epitope der HHV-6-spezifischen Immunantwort nicht bekannt sind. Durch die Stimulation mit Peptiden aus den HHV-6-Tegumentproteinen U11 und U54, die aufgrund von konservierten HLA-Bindungsmotiven als CD8-T-Zellepitope vorhergesagt wurden, ist es mir gelungen, HHV-6-spezifische CD8+ T-Zellen von gesunden Virusträgern in vitro anzureichern. Ich konnte T-Zellklone spezifisch für mehrere HLA-A*0201-restringierte Epitope herstellen: die U11-Peptide GIL, MLW und SLM sowie die U54-Peptide ILY und LLC. Ich zeigte, dass ILY und LLC bei der intrazellulären Antigenprozessierung entstehen. ILY-spezifische T-Zellen erkannten virusinfizierte Zellen in vitro. Damit habe ich die ersten CD8-T Zellepitope von HHV-6 charakterisiert und gezeigt, dass sich auch die HHV-6-spezifische T Zellantwort, ähnlich wie die CMV-spezifische, gegen virale Tegumentproteine richtet. Durch Multimerfärbung von peripheren Blutzellen konnte ich zeigen, dass diese HHV-6-spezifischen T Zellen im T-Zellgedächtnis gesunder Virusträger im Vergleich zu anderen herpesvirusspezifischen T-Zellen selten sind. Diese Erkenntnisse liefern eine Grundlage für weitere Untersuchungen des HHV-6-spezifischen T-Zellrepertoires und helfen, Strategien für die Herstellung von HHV-6-spezifischen T-Zellen für die Immuntherapie zu entwickeln.

Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen ist die Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen und Peptiden ein wichtiger pathogener Faktor, dessen Ursachen und Mechanismen bis heute größtenteils unbekannt sind. Teilweise entfaltete Zustände der beteiligten Proteine und Peptide, die oftmals Startpunkte der Fehlfaltung bilden, sind mit den gängigen experimentellen Techniken strukturell kaum aufzuklären. Im Gegensatz dazu lassen sich mit Hilfe von Molekulardynamik-(MD)-Simulationen die beteiligten Strukturen im Prinzip mit atomarer Auflösung charakterisieren. Ziel dieser Arbeit war es daher, Methoden zur MD-Simulation von Modellpeptiden zu entwickeln und anzuwenden, um Einsichten in die ersten Schritte der angesprochenen Fehlfaltungsprozesse zu gewinnen. Da die Faltungseigenschaften von Peptiden insbesondere von der Temperatur abhängen, habe ich im ersten Teil meiner Arbeit eine Strategie zur minimalinvasiven Temperaturkontrolle für MD-Simulationen entwickelt. Im Gegensatz zu gängigen Vorgehensweisen werden hierbei die Konformationsübergänge eines Peptids nicht verlangsamt, und das durch die Simulation abgetastete statistische Ensemble bleibt ungestört. Um den Konformationsraum mit der Fehlfaltung assoziierter Peptide effizient abzutasten, muss darüberhinaus auf sogenannte replica-exchange-Techniken zurückgegriffen werden, die durch einen regelmäßigen Konfigurationsaustausch zwischen parallelen Simulationen bei unterschiedlichen Temperaturen eine schnellere Konformationsdynamik des Peptids bewirken. Ein weiterer methodischer Teil meiner Arbeit beschäftigt sich daher mit Regeln zur optimalen Wahl der Temperaturleiter und des Austauschschemas für den Einsatz dieser Techniken. Insbesondere habe ich gezeigt, dass bisher bei der Ableitung entsprechender Regeln von falschen Voraussetzungen ausgegangen wurde, weshalb nur suboptimale Ergebnisse erzielt werden konnten. Aus der mathematischen Analyse des Problems und anhand eines Monte-Carlo-Modells habe ich eine tatsächlich optimale Strategie entwickelt. Schließlich habe ich diese Strategien angewandt um einen Aspekt der Fehlfaltung des Prion-Proteins (PrP) näher zu untersuchen. Ziel einer Reihe von replica-exchange-Simulationen war es, die Stabilität der ersten alpha-Helix (H1) von PrP gegen ihre Entfaltung zu untersuchen. Hierzu wurde ein Modell-Peptid mit einer H1 entsprechenden Sequenz in unterschiedlichen Lösungsmitteln simuliert. Dabei zeigte sich, dass die entsprechende Peptidsequenz in Wasser mehrheitlich keine alpha-helikale Faltung annimmt und vergleichsweise schnell entfaltet, während mit abnehmender Polarität des Lösungsmittels die Stabilität deutlich zunimmt. Damit bestätigt sich eine Hypothese von Hirschberger et al. [Biophys. J. 90, 3908-3918 (2006)] daß H1 für die Fehlfaltung von PrP keine Barriere darstellt, falls dieser Prozess, wie vermutet, als ersten Schritt den Wechsel von H1 von einer schwach in eine stark polare Umgebung beinhaltet.

Fri, 24 Apr 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11555/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11555/1/Reichold_Rudolf.pdf Reichold, Rudolf ddc:530, ddc:500, Fak

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Ziel dieser Dissertation war es, die Funktionen des rekombinanten humanen Hitzeschock-Protein 70 (rhuHsp70) in der durch dendritischen Zellen (DCs) vermittelten innaten und adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Intrazellular hat das Hitzeschock-Protein 70 vielfältige Funktionen unter anderem bei der Proteinfaltung und der Verhinderung von Aggregationen. Die Rolle des extrazellulären Hsp70 im Immunsystem ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Aufgrund seiner verschiedenen beschriebenen Funktionen, die die innate Aktivierung von von immunkompetenten Zellen, wie DCs, und die effiziente Präsentierung von gebundenen Antigenen umfassen, wurde ein bedeutendes thera-peutisches Potential des rekombinanten oder aus Tumormaterial isolierten Hsp70 für die immun-basierte Tumortherapie postuliert. Allerdings gibt es zu der Rolle von Hsp70 im Immunsystem widersprüchliche Daten. Mit dem Nachweis von Kontaminationen in dem für viele Studien verwendeten rekombinanten Hsp70, die auf die E.coli Kultur zurückgeführt wurden, wurden die Funktionen von Hsp70 angezweifelt. Welches therapeutisches Potential Hsp70 tatsächlich hat, war offen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass rhuHsp70 die Kreuzpräsentation von Peptidantigenen signifikant steigerte. Durch den Vergleich von gleichen Mengen Peptid-antigen, allein oder im Komplex mit rhuHsp70, wurde zum ersten Mal die Steigerung durch rhuHsp70 quantifiziert. Dabei zeigte rhuHsp70 selbst keine Signal-Funktion auf die DCs. RhuHsp70 induzierte keinen intrazellulären Einstrom von Calciumionen, induzierte nicht die phänotypische Maturierung, aktivierte nicht Zytokinsektretion und veränderte nicht die Makropinozytoseeigenschaften der DCs. Demnach hat rhuHsp70 keine dem einem Maturierungssignal vergleichbaren Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass die Reinheit des verwendeten rhuHsp70 entscheidend für die korrekte Schlussfolgerung und Interpretation der experimentellen Ergebnisse ist. Schon geringe Mengen an Kontaminationen wie Endotoxine haben stimulatorische Aktivität auf DCs, die fälschlicherweise dem rhuHsp70 zugeschrieben wird. Mit dieser Arbeit wurde erstmals nachgewiesen, dass die in den rhuHsp70 Präparationen in nanomolaren Konzentrationen enthaltenen freien Nukleotide und nicht rhuHsp70 selbst den intrazellulären Einstrom von Calciumionen in DCs induzieren. Bis dato wurden die Nukleotide nicht als Ursache für das mit Hsp70 induzierte Calciumsignal beachtet. Mit der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin gezeigt, dass die Funktion von rhuHsp70 in der Kreuzpräsentation nicht an eine innate Signalfunktion gebunden ist. Durch eine bisher nicht durchgeführte Verknüpfung von biochemischer Analyse der Substrat- rhuHsp70 Interaktionen und immunologischer Antigenpräsentation wurde als wichtige Voraussetzung für die Verbesserung der Kreuzpräsentation die Komplexbildung zwischen Peptid und rhuHsp70 nachgewiesen. Die gesteigerte Kreuzpräsentation korreliert direkt mit der biochemischen Komplexbildung. Dabei war die rhuHsp70 vermittelte Steigerung unabhängig von TAP, Sec61 und der Ansäuerung der endolysosomalen Kompartimente. Die Kreuzpräsentation von verschiedenen Peptiden mit unterschiedlichen Prozessierungsbedingungen wurde durch Bindung an rhuHsp70 verstärkt. Es wurde gezeigt, dass mehr Peptidantigen in den APCs vorhanden war, die mit rhuHsp70:Peptid inkubiert wurden, im Vergleich zu den APCs, die mit der gleichen Menge Peptid ohne rhuHsp70 inkubiert wurden. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die verbesserte Kreuzpräsentation der Peptid-antigene durch rhuHsp70 auch zu einer Zunahme von Antigen-spezifischen T-Zellen unter Primingbedingungen führt. Dabei wurden beim Priming mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger oder gleich viel Antigen-spezifische IFN-g und Perforin sezernierenden Zellen erhalten. Bemerkenswert ist, das die Zellen aus dem Primingansatz mit den rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs eine deutlich bessere Antigenspezifität als die Zellen aus dem Primingansatz mit Peptid gepulsten DCs aufwiesen. Die Quantifizierung der Zusammensetzung der geprimten Zellpopulation ergab, dass mit rhuHsp70:Peptid gepulsten im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger CD8+ T-Zellen erhalten wurden. Konsistent wurde eine Zunahme der CD3+CD4+ T-Zellen beobachtet. Innerhalb dieser CD3+CD4+ T-Zellpopulation war der Anteil der FOXP3+ T-Zellen in den Ansätzen mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs erhöht, aber es wurde hierbei keine konsistente Zunahme der CD25++FOXP3+ Zellen beobachtet. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Arbeit ergeben sich neue interessante Fragen zu der Interaktion von rhuHsp70 mit dem Immunsystem. So ist zu klären, welche Funktionen die durch das Priming mit rhuHsp70:Peptid Komplex gepulsten DCs entstehenden CD4+ T-Zellen ausüben. Wichtig ist auch, den Grund der besseren Antigenspezifität der mit rhuHsp70:Peptid Komplex geprimten Zellen zu untersuchen.

Thu, 6 Dec 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7793/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7793/1/Lang_Christiane.pdf Lang, Christiane

Eine der ersten Barrieren des Körpers gegen Bakterien, Pilze und Viren stellt die unspezifische angeborene Immunantwort dar. Zu den wichtigsten Vertretern der angeborenen Immunantwort zählt die Gruppe der antimikrobiellen Peptide. Diese Gruppe wird, gerade im Hinblick auf die Zunahme azolresistenter Candida-Stämme, immer wichtiger zur Entwicklung neuer therapeutischer Optionen. Weiterhin gewinnt der Hauptpathogenitätsfaktor von Candida albicans, die sekretorische Aspartatproteinase, an Bedeutung als therapeutischer Angriffspunkt. Ziel dieser Dissertation war die Isolierung und Identifizierung von Peptiden aus humanem Plazentagewebe, die das Wachstum von Mikroorganismen, im speziellen von Candida albicans, hemmen. Desweiteren wurde ein Peptid aus humanem Plazentagewebe gereinigt, welches in der Lage ist, den Hauptpathogenitätsfaktor von Candida albicans, die sekretorische Aspartatproteinase zu inhibieren. Zu diesem Zweck wurde eine Peptidbank aus humanem Plazentagewebe hergestellt. Die Separation von biologisch aktiven und inaktiven Peptiden erfolgte durch Reversed-Phase und Kationenaustausch-Chromatographie, wobei die antimikrobielle Aktivität der gesammelten HPLC-Fraktionen durch den Mikrodilutionstest und Sap-Inhibitionsassay überprüft wurde. Mittels dieser Methoden war es erstmals möglich, ein Peptid zu detektieren, welches sowohl die sekretorische Aspartatproteinase von Candida albicans inhibiert, als auch antimikrobielle Wirksamkeit besitzt. Dieses Peptid wurde chromatographisch gereinigt und als Fragment der β-Kette des humanen Hämoglobins identifiziert. Hierbei handelt es sich um ein kationisches Peptid, bestehend aus den 36 C-terminalen Aminosäuren des oben genannten Hämoglobins. Zudem wurden weitere bereits bekannte antimikrobielle Proteinfragmente mit Hilfe des Mikrodilutionstests und Sap-Inhibitionsassays auf antifungale Aktivität geprüft. Dabei wurde festgestellt, das ein Fragment der humanen Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, hGAPDH (1-31), sowohl das Wachstum von Candida albicans als auch die sekretorische Aspartatprotease des Pilzes hemmt. Die antifungale Aktivität des Peptides konnte auf ultrastruktureller Ebene bestätigt werden. Darüber hinaus zeigt dieses Peptid eine protektive Wirkung bei der Entwicklung oraler Kandidosen. Dies konnte unter Zuhilfenahme eines in-vitro-Schleimhaut-Kandidose-Modells auf der Basis rekonstituierten humanen Epithels gezeigt werden. Die in dieser Arbeit identifizierten und verwendeten Proteinfragmente sind ein vermutlich wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems und spielen eine wesentliche Rolle bei der Abwehr von Mikroorganismen. Aufgrund ihrer Eigenschaften könnten diese Peptide z.B. mittels lead structure Optimierung und molecular modeling in ihrer Wirksamkeit verbessert werden und sich zur Entwicklung neuer klinisch anwendbarer Peptidantibiotika eignen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten Einzelmolekül-Messungen zur Bindung von myristoyliertem Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt werden. Die Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC) und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine Signal/Rausch-Analyse ermöglichte die Bestimmung der Sensitivität und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde für verschiedene prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso stärker, je höher der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten überein, die mit etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen, dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren Peptidkonzentrationen möglich sind. FCS stellt eine präzise Methode zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmembranen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Größenverteilung bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales System dar. Unter dem Einfluss eines natürlichen Surfactants (Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung von Alveofact unabhängig von der Ionenkonzentration ein stabiles Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten Plasmiden. Dagegen führte die Inkubation mit Alveofact zu einer langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in diesem Fall nach 60 min eine Größe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex. Mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die Größe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und höhere negative Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der makroskopischen Viskosität der Polymerlösung wurden die Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver Überschussladung wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen Komplexe ein ähnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe ermöglichte also einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.

In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden Histon-Methyltransferasen Su(var)3-9 und E(Z) aus Drosophila melanogaster charakterisiert. Die Histonmethylierung als Modifikation war schon länger bekannt gewesen, bis zum Jahr 2000 war jedoch vor allem die Acetylierung etwas genauer untersucht worden. Su(var)3-9 war die einzige bekannte Histon-Lysin-Methyltransferase, als diese Arbeit begonnen wurde. Zur Charakterisierung wurde das myc-getagte Enzym aus Drosophila-Kernextrakt durch Affinitätschromatographie aufgereinigt und zunächst die Substratspezifität festgestellt. Wie das humane Enzym Suv39H1 methyliert es ebenfalls spezifisch H3-K9 (Lysin 9 im Histon H3). Das aus den Kernextrakten aufgereinigte Enzym besitzt aber auch die Fähigkeit, ein an H3-K9 präacetyliertes Substrat zu methylieren. Die Vermutung, dass Su(var)3-9 mit einer Histondeacetylase assoziiert ist, konnte durch Verwendung von TSA als HDAC-Inhibitor bestätigt werden. Es stellte sich heraus, dass HDAC1 (Rpd3) mit Su(var)3-9 assoziiert ist. Um das Enzym besser untersuchen zu können, wurde es als Volllängenprotein und als Deletionsmutante in E. coli exprimiert. Die Aufreinigung des rekombinanten Enzyms sowie seine Lagerbedingungen wurden optimiert. Das Volllängenprotein Su(var)3-9 liegt – wie durch Gelfiltration festgestellt - als Dimer vor, die Interaktion mit sich selbst ist über den N-Terminus vermittelt. Su(var)3-9 bindet an sein eigenes, bereits methyliertes Substrat. Dies wurde an Peptiden untersucht, die den ersten 20 Aminosäuren des Histons H3 entsprechen, und entweder an Lysin 9 dimethyliert oder unmodifiziert waren. Die Interaktion mit dem methylierten Substrat ist auf die Chromodomäne von Su(var)3-9 zurückzuführen, ist jedoch schwächer als die Wechselwirkung von HP1 mit methyliertem H3-K9. Des weiteren wurde eine Drosophila-Zelllinie stabil mit Su(var)3-9 transfiziert. Das überexprimierte Protein ist jedoch nur schwach aktiv. Die Tatsachen, dass Su(var)3-9 mit HDAC1 interagiert sowie mit seinem eigenen Substrat assoziiert, ermöglichen die Aufstellung von Hypothesen über die bis jetzt kaum erhellte Ausbreitung von Heterochromatin in euchromatische Bereiche. Durch die Wechselwirkung mit der Deacetylase könnte Su(var)3-9 auch in aktiv transkribierte Bereiche vordringen und diese methylieren. Die Acetylierung, Zeichen für aktive Transkription, würde durch die Methylierung ersetzt werden. Die Interaktion mit seinem umgesetzten Substrat könnte verhindern, dass das Enzym sich nach der Reaktion entfernt, vielmehr könnte Su(var)3-9 entlang eines DNA-Stranges sukzessive alle Nukleosomen methylieren. Die darauffolgende Bindung von HP1 an methyliertes H3-K9 könnte den heterochromatischen Charakter des Chromatins verstärken und für längere Zeit festlegen. Aus Drosophila-Kernextrakten gelang es weiterhin, den E(Z)/ESC-Komplex über Säulenchromatographie aufzureinigen. Dieser enthält neben E(Z), ESC, p55 und Rpd3 auch Su(z)12. E(Z), ESC und Su(z)12 gehören der Polycomb-Gruppe an. Deren Funktion ist die dauerhafte Repression der homöotischen Gene. Sie spielen daher eine wichtige Rolle im „Zellgedächtnis“ während der frühen Entwicklung von Drosophila. Es konnte gezeigt werden, dass der E(Z)/ESC-Komplex Lysin 9 sowie Lysin 27 im Histon H3 methyliert. Außerdem wurde in vitro ein Teilkomplex aus rekombinantem E(Z), p55 und ESC rekonstituiert, der das Histon H3 methylieren kann. Ein Teilkomplex, der E(Z) mit mutierter SET-Domäne enthält, ist nicht in der Lage, H3 zu methylieren. Die Vorhersage, dass E(Z) aufgrund seiner SET-Domäne eine Methyltransferase sein müsse, konnte durch vorliegende Untersuchungen bestätigt werden. Polycomb ist ein weiteres Protein aus der Polycomb-Gruppe. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses Protein spezifisch an das Histon H3 bindet, das an K27 trimethyliert ist. Polycomb besitzt wie HP1 eine Chromodomäne. Aus den vorliegenden Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Nach der Methylierung von H3-K9 sowie H3-K27 durch den E(Z)/ESC-Komplex in homöotischen Genen, die schon abgeschaltet sind und weiterhin reprimiert werden müssen, bindet Polycomb an dieses Methylierungsmuster. Polycomb befindet sich in einem großen Komplex mit weiteren Polycomb-Gruppen-Proteinen. Die Bindung dieses Komplexes an Chromatin könnte ein denkbarer Mechanismus sein, wie die dauerhafte Repression der homöotischen Gene vermittelt wird. Um den E(Z)/ESC-Komplex genauer untersuchen zu können, wurden Viren für das Baculosystem hergestellt, so dass eine Einzel- oder auch Coexpression der Proteine möglich ist. Die Aktivität von E(Z), das im Baculosystem exprimiert wurde, ist nicht besonders hoch. Es bindet unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen weder an DNA, noch an Histone noch an H3-Peptide, die methyliert sind. Innerhalb des E(Z)/ESC-Komplexes bindet E(Z) an p55, Rpd3, ESC sowie Su(z)12. Su(z)12 interagiert mit p55, Rpd3 und E(Z). Die weiteren Interaktionen werden am besten durch eine bildliche Darstellung (siehe Abb. 86) vermittelt. In einem Luciferase-Assay wurde eine repressive Wirkung von E(Z) festgestellt. Dieses Experiment bedarf allerdings eines aktivierten Systems. Ferner muss durch Mutationsanalysen sichergestellt werden, dass die repressive Wirkung auf die Methyltransferase-Aktivität von E(Z) zurückzuführen ist. Kürzlich wurde entdeckt, dass E(Z) sowie Su(z)12 in verschiedenen Tumoren überexprimiert sind. Noch ist weder deren Funktion in den Tumorzellen klar, noch weiss man, ob die Überexpression der Grund oder eine Folge der Tumorbildung ist, noch kennt man alle Zielgene, die durch eine Überexpression von E(Z) und Su(z)12 beeinflusst werden. In nächster Zeit sind hier Einsichten in die Wirkungsweise von E(Z), Su(z)12 und anderen Polycomb-Gruppen-Proteinen zu erwarten.

Die Arbeit liefert neue Beiträge zu zwei wichtigen biophysikalischen Fragestellungen der Peptid-/Proteinfaltung: 1. Welchen Einfluss hat das Lösungsmittel auf die initiale Konformationsdynamik? Das Molekül Azobenzol dient dazu, gezielt in einem ringförmigen Oktapeptid getriebene Konformationsänderungen auszulösen. Azobenzol isomerisiert nach Lichtanregung innerhalb weniger Pikosekunden. Es werden neue Ergebnisse zum Isomerisierungsmechanismus präsentiert, die wichtige Hintergrundinformationen zum Verständnis der Moleküldynamik liefern. Durch die Isomerisation ändert sich die Länge des Azobenzols um fast den Faktor zwei, wodurch in den Azobenzol-Peptiden konformationelle Umorganisationen ausgelöst werden. Bereits früher durchgeführte Messungen an DMSO-löslichen Azobenzol-Peptiden zeigten, dass kinetische Prozesse, die mit Zeitkonstanten von ~10ps und ~100ps ablaufen, der Bewegung des Peptid-Teils zugeordnet werden können. Die hier präsentierten Ergebnisse an Azobenzol-Peptiden, die in Wasser löslich sind zeigen, dass Prozesse auf Zeitskalen >5 ps in Wasser um den Faktor 1.5-2 beschleunigt ablaufen. Man sieht in diesen ultraschnellen Kinetiken echte Umorganisationen des Peptid-Rückgrats, deren Geschwindigkeit durch die Viskositat des Lösungsmittels bestimmt sind 2. Wie schnell ist die Kontaktbildung in Peptiden? Fur ein Verständnis der Proteinfaltung ist wichtig zu wissen, wie lange es dauert, bis zwei (räumlich entfernte) Aminosäuren innerhalb eines Peptids einen Kontakt ausbilden. Zur Bestimmung dieser Kontaktbildungsrate werden Experimente an Xanthon-Peptiden präsentiert, die zwei Marker-Moleküle enthalten. Messungen ergeben, dass der durch einen kurzen Lichtimpuls angeregte Donor Xanthon innerhalb weniger Pikosekunden einen langlebigen Triplett-Zustand besetzt. Weiterhin wird gezeigt, dass bei direktem Kontakt zum Akzeptor Naphthalin ein Triplett-Triplett Energietransfer innerhalb

Das nicht polymorphe HLA-Klasse-I-Antigen HLA-G wird hauptsächlich in der Plazenta exprimiert, wo es vermutlich den semiallogenen Fötus vor Angriff des mütterlichen Immunsystems schützt. Eine Besonderheit von HLA-G ist das Auftreten von mehreren verkürzten Isoformen, die von alternativ gespleißten Transkripten translatiert werden. Neben dem kompletten membranständigen HLA-G1 mit den extrazellulären Domänen a1, a2 und a3 existieren die verkürzten Isoformen HLA-G2 (∆a2), HLA-G3 (∆a2, ∆a3) und HLA-G4 (∆a3). Außerdem wurden die löslichen Isoformen HLA-G5 (HLA-G1s), HLA-G6 (HLA-G2s, ∆a2) und HLA-G7 (HLA-G3s, ∆a2, ∆a3) beschrieben. Um die Expression und Funktion einzelner Isoformen getrennt voneinander und ohne Beeinflussung durch andere MHC-Klasse-I-Moleküle untersuchen zu können, wurden Transfektanten für die Isoformen HLA-G1, HLA-G2, HLA-G4 und HLA-G5 in der HLA-Klasse-I-negativen humanen Zellinie K-562 generiert. HLA-G kann mit inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren auf NK- und T-Zellen in Wechselwirkung treten und so Effektorfunktionen beeinflussen. Die Expression von HLA-G kann außerdem indirekt über HLA-E auf die Zytotoxizität von NK-Zellen und T-Zellen einwirken. Die HLA-E-Expression ist abhängig von Peptiden aus den Signalsequenzen von HLA-Klasse-I-schweren Ketten. Zum Ausschluß der Koexpression des HLA-Klasse-I-Antigens HLA-E auf der Zelloberfläche wurden HLA-G1mut- und HLA-G4mut-cDNA-Vektoren eingesetzt, deren Exon 1 so verändert ist, daß kein Ligand für HLA-E zur Verfügung gestellt wird. Während in der Zellinie K-562 HLA-G1 und HLA-G5 auf der Zelloberfläche exprimiert bzw. sezerniert werden, waren die verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 mittels FACS-Analyse mit einer Reihe HLA-Klasse-I- und HLA-G-spezifischer Ak nicht auf der Zelloberfläche nachweisbar. Diese Ergebnisse korrelieren mit der Sensitivität dieser verkürzten Isoformen gegenüber Endo H. Aus der fehlenden Resistenz der HLA-G2- und HLA-G4-Polypeptide gegenüber Endo H ergibt sich kein Hinweis auf ihren Transport zur Zelloberfläche. Diese fehlende Oberflächenexpression von HLA-G2 und HLA-G4 könnte auf einer gestörten Assoziation mit b2m oder Bestandteilen der MHC-Klasse-I-Prozessierungsmaschinerie beruhen. Kopräzipitationsexperimente ergaben, daß nur die HLA-G1-schwere Kette mit b2m und TAP assoziiert ist. HLA-G2 ließ sich zwar mit TAP, jedoch nicht mit b2m kopräzipitieren und HLA-G4 ließ sich weder in Assoziation mit b2m noch mit TAP nachweisen, so daß diesen Isoformen ein wichtiger Bestandteil der vollständigen HLA-I-Komplexe fehlt und bei HLA-G4 außerdem die Beladung mit Peptiden gestört ist. Diese Daten sprechen gegen eine Zelloberflächenexpression der verkürzten HLA-G-Isoformen. Im Unterschied zu HLA-G1 war HLA-G5 nicht in Kopräzipitaten mit TAP zu finden. Daher scheint für diese Isoform eine stabile Assoziation mit TAP für die Peptidbeladung nicht essentiell zu sein. Zum funktionellen Nachweis von HLA-G wurden Zytotoxizitätstests mit der Zellinie NKL sowie mit PBL, NK-Zellen und LAK-Zellen aus dem peripheren Blut mehrerer Donoren durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die Expression der verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 die Zytotoxizität der verschiedenen Effektorzellen nicht beeinflußte. HLA-G1 inhibierte die Lyse von K-562 in Abhängigkeit von der HLA-G1-Expressionsstärke und wirkte sich weniger deutlich als eine entsprechende HLA-E-Expression auf die Zytotoxizität aus. Neben der Plazenta wird HLA-G auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert und kann in Tumoren induziert oder hochreguliert werden. Da bei verschiedenen Tumoren die MHC-Klasse-I-Expression aufgrund von Mutationen im b2m-Gen gestört ist, wurden HLA-G1-Transfektanten in der b2m-negativen humanen Zellinie Daudi etabliert. Daudi HLA-G1-Transfektanten weisen gegenüber K-562 HLA-G1-Transfektanten eine reduzierte HLA-G-Proteinmenge auf. In Abwesenheit von b2m ist HLA-G1 außerdem nicht resistent gegenüber Endo H und kann auch nach Inkubation der Zellen bei niedrigen Temperaturen und Zugabe von b2m oder Ligand nicht auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Da von HLA-B27 bekannt war, daß b2m-freie Homodimere auf der Zelloberfläche exprimiert werden können und eine Dimerisierung von HLA-G über ungepaarte Cysteinreste möglich ist, wurden die Daudi HLA-G1-Transfektanten auf Anwesenheit von HLA-G1-Dimeren untersucht. In Abwesenheit von b2m waren jedoch keine Dimere nachweisbar. Auch in funktionellen Experimenten mit LAK oder gd T-Zellen hatte die HLA-G-Expression in Daudi HLA?G1-Transfektanten keine Auswirkung auf die Zytotoxizität oder Proliferation der Effektorzellen. Die HLA-G1-Expression in b2m-negativen Tumoren trägt daher nicht zur Tumorprogression bei. Eine Analyse der Unterschiede in der Expression und der Auswirkungen der HLA-G-Isoformen in verschiedenen Zellinien könnte Hinweise auf die Regulation und die Funktion der HLA-G-Expression liefern.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, das es erlaubt, von in silico Sequenzdaten ausgehend einzelne Proteine in Proteomen direkt zu adressieren. Diese gezielte, quantitative Detektion einzelner Proteine im Proteom ist mit den klassischen Methoden der Proteomanalyse (2D Gelelektrophorese mit anschließender proteinchemischer Identifizierung einzelner Spots) nicht möglich, da das Laufverhalten des „gesuchten“ Proteins, aufgrund potentieller posttranslationaler prinzipiell nicht hinreichend genau vorhergesagt werden kann. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Verfahren beruht auf der Generierung von Peptid-Antikörpern, die sensitiv und spezifisch einzelne Proteine in Proteomen detektieren können. Die benötigten Peptid-Antigene werden hierfür ausschließlich von in silico Sequenzinformationen des Zielproteins abgeleitet und vollsynthetisch hergestellt. Zunächst wurde Entwicklungsarbeit bezüglich der effizienten Titration Peptid-induzierter Antiseren geleistet. Die ELISA-Analyse Peptid-induzierter Antikörper ist nicht trivial, weil Standard-Mikrotiterplatten mit kurzen synthetischen Peptiden nur mangelhaft beschichtet werden können, was geringe Sensitivität der Analyse zur Folge hat. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Kopplung von biotinylierten Peptiden an Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten die Sensitivität der ELISA-Analyse deutlich gesteigert werden konnte und das System hervorragend für die Titration Peptid-induzierter Seren geeignet ist. Wesentliche Entwicklungsarbeit wurde hinsichtlich geeigneter Carrier-Systeme zur Steigerung der Immunantwort gegen das Peptid-Antigen geleistet. Hierfür wurden verschiedene Carrier auf Kunststoffbasis, verschiedene klassische Protein-Carrier und kurze peptidische T-Zell-Epitope getestet. Mit einem vollsynthetischen, 15 AS langen Masernvirus-Fusions-Protein-T-Zell-Epitop konnte die Immunantwort am effektivsten gesteigert werden. Mit diesem Peptid-Carrier gelangen höhere Raten erfolgreicher Immunisierungen als mit den klassischen Carrier-Proteinen. Der wesentliche Vorteil dieses vollsynthetischen Carrier-Systems ist, dass die Induktion unerwünschter Kreuzreaktivität durch das Carrier-Protein und der daraus folgende Verlust an Spezifität der Seren a priori vermieden wird. Außerdem können diese Konstrukte, ohne chemische „Crosslinker“, vollsynthetisch und in hoher Reinheit hergestellt und deren Identität, im Gegensatz zu Protein-gekoppelten Peptiden, mittels MS verifiziert werden. Als anspruchsvoller Sensitivitäts- bzw. Spezifitätstest, wurden mit Peptid-induzierten Antikörpern im 2D-Western-Blot, Proteine diverser Funktionsklassen nachgewiesen. Alle Zusammenfassung 165 nachzuweisenden Proteine wurden im 2D-Western-Blot gezielt und hintergrundfrei detektiert. Die Detektionsgrenze der Peptid-induzierten Seren lag zwischen 313 fmol und 4 fmol Einzelprotein, was sensitiver ist als die routinemäßig verwendeten MS-basierten Proteinidentifizierungs-Verfahren. Mit Peptid-Arrays, die mit der Technik der Spot-Synthese hergestellt wurden, ist das Bindungsverhalten der Peptid-induzierten Antikörper weiter untersucht worden. Dabei konnte festgestellt werden, dass überraschenderweise die überwiegende Zahl der generierten Peptid-induzierten Antikörper an definierte ca. 5-9 AS lange Teilsequenzen der bis zu 20 AS langen Peptid-Antigene binden. Diese besonders bemerkenswerte Eigenschaft, die bislang nur in Zusammenhang mit monoklonalen Antikörpern bekannt ist, gab den Anlass, das Verfahren zum Patent anzumelden. Ferner wurde ein Verfahren entwickelt, das unter Verwendung von Peptid-induzierten Antiseren die Produktion von Antikörper-basierten Chips ermöglicht. Mit Protein A Partikeln als feste Phase ist es im Unterschied zu anderen häufig verwendeten Trägermaterialien gelungen, eine ausreichende Menge an Antikörpern direkt aus dem Rohserum zu binden, um einzelne Proteine in komplexen Proteingemischen (z.B. eukaryontischen Zell-Lysate) zu detektieren. Das Verfahren hat den Vorteil, dass einfach und schnell größere Mengen von Partikeln beschichtet und asserviert werden können. Mit den Partikeln können z.B. Antikörperchips individuell, für spezifische Fragestellungen angefertigt werden (sog. „custom designed“ Antikörperchips). Dadurch wird es möglich, ein Set von Proteinen in einer Vielzahl von Proben schnell, parallel und quantitativ zu detektieren.

= u Beginn dieser Arbeit wurde den Hinweisen nachgegangen, daß Pd(II)-Zentren in der Lage sind, die Bildung von Peptidbindungen aus nicht aktivierten Aminosäureestern zu vermitteln. Dies führte zu der Charakterisierung der Verbindungen 1-5, die sich durch die Koordination der Ester-Carbonylgruppe am Metallzentrum auszeichnen. Die Aktivierung der Carbonyl-Gruppen läßt sich durch die starke Verschiebung der C=O-Banden nach kleineren Wellenzahlen im IR-Spektrum belegen.In einer Folgereaktion kann durch Umsatz mit einem Überschuß an Wasser das Hydrolyse-Produkt 6 isoliert werden. Bei Versuchen mit Butylamin als Reaktionspartner bleibt die Carbonsäureester-Gruppe im Molekül erhalten. Die Bildung einer Amid-Bindung wird nicht beobachtet. Beim Umsatz von Glycinester mit der Komplex-Verbindung (en)PdCl2, die von Kostic zur sequenzspezifischen Hydrolyse von Peptiden eingesetzt wurde, konnte Verbindung 7 erthalten werden. Die Bildung eines Peptids am Komplex wird nicht beobachtet. Die Reihe von Metallionen für die bekannt ist, daß sie Aminosäureester aktivieren können, und damit eine katalytische Peptidbildung ermöglichen, konnte in dieser Arbeit wesentlich erweitert werden. Neu untersucht wurden die Metallverbindungen aus der Gruppe der Seltenen Erden, aber auch andere starke Lewis-Säuren, wie die Chloride der Metalle der vierten, fünften, und sechsten Nebengruppe in ihren jeweils höchsten Oxidationsstufen. Der Schlüssel hierfür ist die Verwendung des wenig koordinierenden Lösungsmittels Dichlormethan. In der Reihe der dreiwertigen Metallionen ergibt sich mit geringen Abweichungen eine Abhängigkeit der Peptidausbeute von dem effektiven Ionenradius. Je kleiner der Ionenradius, desto höher ist das Verhältnis Z/r (Ladung/Radius), und desto effektiver ist die Aktivierung der Aminosäureester. Hier ragen vor allem die „klassischen“ Lewis-Säuren Al 3+ und Fe 3+ heraus. Das Resultat, das für Fe 3+ -Ionen (Umsatz von Glycinester zu 82 %) erzielt wurde, ist höher als jedes andere, das unter diesen Reaktionsbedingungen bisher verzeichnet wurde. Die Ausbeuten der Metallionen aus der Gruppe der Seltenen Erden litten unter einer im Laufe der Zeit zunehmenden Vergiftung des Katalysators durch Komplexbildung. Kinetische und analytische Untersuchungen belegen dies. In der Gruppe der vierwertigen Metallionen wurden mit HfCl4 und ZrCl4 hohe Ausbeuten (um 60 %) erzielt. Dieses Ergebnis zeigt die Verwandtschaft zu der katalytischen Veresterung von Carbonsäuren, für die in einem Screening vor allem Hf 4+ hervorragende Ergebnisse erbrachte. Übergangsmetallchloride mit den Oxidationsstufen V und VI konnten diese Resultate nicht erreichen. Probleme bereiten hier beispielsweise Redox-Instabilitäten der höchsten Oxidationsstufe. Betrachtet man die Ergebnisse innerhalb der Gruppen, so ist eine Abhängigkeit der Ausbeute von der thermodynamischen Stärke der M-N-Bindung zu beobachten. Schließlich konnte die Abhängigkeit der Ausbeute von dem sterischen Anspruch der Aminosäure-Seitenkette, die schon für die Cu 2+ -Katalyse bekannt war, auch für das Zr 4+ nachgewiesen werden. Selbst funktionelle Seitenketten, wie im Histidin vorhanden, konnten die Peptidbildung im Fall der Zr 4+ -Katalyse nicht unterdrücken. Die Erweiterung des Konzeptes der templat-gesteuerten Cyclotetrapeptid-Synthesen führte zur Darstellung der Asparaginsäure enthaltenden makrocyclischen Komplexen 8 und 9. In dieser Synthese wird der Templat-Effekt in doppelter Weise ausgenutzt. Das Metallion schafft nicht nur die räumliche Nähe und die Aktivierung der zunächst nicht reaktiven Edukt-Peptidester, sondern legt auch die Ringgröße auf die begünstigte Zahl von 14 Gliedern fest. Verbindung 8 konnte erfolgreich zum vierfach geladenen Komplexanion 10 hydrolysiert werden. 10 sollte sich nach Austausch der PPN + -Kationen gegen Na + durch eine verbesserte Wasserlöslichkeit auszeichnen, die wichtig ist für potentielle Anwendungen (z.B. als Röntgenkontrastmittel). Mit Verbindung 11 konnte ein Cyclopeptidkomplex mit Glutaminsäure-Komponenten dargestellt werden. Unter Vermeidung des zu gespannten 12-gliedrigen Rings bildet sich ein größerer Zyklus mit 16 Atomen um das Pd(II)-Ion. Positioniert man den funktionellen Aminosäureester am Amino-Terminus des Edukt- Dipeptids in Kombination mit einer ß-Aminosäure-Einheit, so erhält man mit 12 und 13 Cyclopeptidkomplexe, deren Seitenketten im Vergleich zu denen von 8 und 9 um eine Methylen-Gruppe verlängert sind. Werden ungeschützte, Stickstoff-enthaltende Aminosäuren als Komponenten in der Cyclotetrapeptid-Synthese eingesetzt, können nur offenkettige Peptidkomplexe wie 14 isoliert werden. Das starke Koordinationsvermögen der Seitenkette verhindert die Ausbildung der Cyclopeptid-Vorläufer-Komplexe. Schützt man hingegen das Amino-Ende von Ornithin oder Lysin, so ist der Ringschluß möglich und es können die Komplexe 15-17 isoliert werden. Aus 17 kann in einem weiteren Schritt durch Einwirkung von HCl das freie Cyclotetrapeptid von dem Metallion abgespalten werden. Aufgrund der geringen Löslichkeit des noch Boc-geschützten cyclischen Peptids 18 gelingt die Freisetzung der Amino-Gruppe der Seitenkette erst unter Einwirkung von TFA. Ausgehend von Verbindung 9 konnte ein weiteres Beispiel für die -C-Hydroxylierung der Glycinkomponente in Ni-Cyclotetrapeptidkomplexen unter Lufteinwirkung gesichert werden, die stufenweise erfolgt (21b und 22b). Von 21a konnte nach vielen Versuchen ein Kristall gewonnen werden, dessen Qualität für die Röntgen- strukturanalyse hinreichend war. Mit Verbindung 24 wurde erstmals ein ungeladener Cyclopeptid-Komplex isoliert, dessen Ligand teilweise protoniert ist.

Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte, dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der 4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde, während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an 6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der 3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und 28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte, enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen. Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann.

Ziel dieser Arbeit sollte die Entwicklung einer automatisierten, hochparallelen und nachweis-starken Sequenzierungsmethode für Proteine im Rahmen der Proteomanalytik sein. Zur Kon-zeption der Methodik sollte dabei mit der sogenannten Leitersequenzierung eine Kopplung aus enzymatischem Aminosäureabbau und MALDI-Massenspektrometrie zum Einsatz kom-men. Die experimentellen Grundparameter für die Leitersequenzierung im Bezug auf die nasschemischen Sequenzierungsschritte und die massenspektrometrischen Messung wurden dabei im ersten Teil der Arbeit zunächst manuell ausgearbeitet. Im zweiten Abschnitt wurden dann die Möglichkeiten einer Automatisierung der so erarbeiteten Methode zur Leitersequen-zierung auf verschiedenen Ebenen evaluiert. Da der enzymatische Abbau eines Gesamtproteins durch dessen intrinsische Eigenschaften wie Sekundärstruktur, Tertiärstruktur (Zugänglichkeit der Proteintermini für die Exopepti-dase) oder Lösungsverhalten erschwert ist, wurden die Sequenzierungsprotokolle der Leiter-sequenzierung für proteolytisch erzeugte, RP-HPLC-gereinigte Spaltfragmente von Proteinen optimiert. Zudem besitzt die MALDI-MS, wie auch andere gängige massenspektrometrische Verfahren, im Massenbereich über ca. 5-10 kDa eine zu geringe Auflösung und Genauigkeit, um eine eindeutige Zuordnung der Massendifferenzen in den Leiterpeptidspektren zu den durch Exopeptidase abgespaltenen Aminosäure zu erlauben. Bei Versuchen mit verschiede-nen Endopeptidasen stellte sich – entgegen theoretischen Erwartungen – heraus, dass vor allem auch Proteinspaltungen mit Endoproteinase GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin, neben Spaltungen mit Endoproteinase LysC, gute Voraussetzungen für die nachfolgende enzymatische Sequenzierung liefern. Mit den Proteinfragmenten aus Spaltungen der Endoproteinasen GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin wurden bei den enzymatischen Sequenzierungen die höchsten Sequenzabdeckungen erzielt. In der technischen Ausführung wurden alle Experimente im Hinblick auf eine Sequenzierung direkt auf dem Target (on-target) optimiert. Geringfügige Anpassungen der erarbeiteten Methoden erlaubten jedoch auch eine Sequenzierung von Peptiden, die zuvor auf PVDF-Membran (Immobilon PSQ) aufgetragen wurden. Ein relativ kontrollierter und reproduzierba-rer Abbau war in einem Temperaturbereich von ca. 25-35°C möglich. Die enzymatischen Sequenzierungen erfolgten ausschließlich mit kommerziell erhältlichen Exopeptidasepräpara-tionen. Eine zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Enzyme erwies sich als nicht notwen-dig. Um eine einfache Interpretation der massenspektrometrischen Resultate zu gewährleisten, wurden nur Monopeptidylpeptidasen eingesetzt. Für C-terminale Sequenzierungen wurden mit CPY, CPP, CPW, CPA und CPB Carboxypeptidasen unterschiedlicher Spezifität einzeln und in verschiedenen Kombinationen untersucht. Von der N-terminal Seite aus wurden Sequenzierungen mit APM, LAP, API und AAP durchgeführt. Eine Betrachtung der Sequen-zierungen zeigt dabei, dass zumeist nur aus kombinierten Resultaten der Anwendung verschiedener Carboxy- beziehungsweise Aminopeptidasen eine ausreichende Sequenzinfor-mation erhalten werden kann. C-terminal ist der Anteil sequenzliefernder Fragmente bei der Verwendung von CPY, sowie bei den sequenziellen Peptidasenkombinationen sb(CP-I) und den Peptidasenmischungen pb(CP) mit maximal 42% am höchsten. Hier treten auch vermehrt längere Teilsequenzen mit bis zu 12 AS auf. N-terminal hebt sich APM als Einzelpeptidase mit überdurchschnittlich guten Sequenzresultaten gegenüber den anderen Aminopeptidasen ab. Bis zu 34% der getes-teten Peptide liefern allein schon mit diesem Enzym eine Sequenzinformation. Zudem wurden längere Teilsequenzen mit bis zu 9 AS im Vergleich zu anderen Aminopeptidasen häufiger erhalten. Sequenzierungen mit Aminopeptidasenmischungen bei N-terminaler Sequenzierung brachten im Gegensatz zu Carboxypeptidasenmischungen bei C-terminaler Sequenzierung kaum deutliche Vorteile. Auch sehr lange Sequenzabschnitte mit bis zu 16 AS N-terminal und bis zu 25 AS C-terminal wurden in Einzelfällen erhalten. C- und N-terminal am häufigsten wurden jedoch aus den Leiterspektren Teilsequenzen mit bis zu 6 AS erhalten (85% aller sequenzliefernden Proteinfragmente). Der größte Teil der Sequenzabdeckung stammt mit 70% aus Teilsequenzen mit 3-9 AS. Unter dem Hauptaspekt einer möglichen Steigerung der Sequenzinformation bei den Leiter-sequenzierung wurden unterschiedliche Peptidderivatisierungen untersucht. Die gezielte N-terminale Modifizierungen brachte in vielen Fällen durch die resultierende Massenverschie-bung des derivatisierten Peptids einen Gewinn an C-terminaler Sequenzinformation. Gegen-über entsprechend nicht-modifizierten Peptiden konnten durch die Massenverschiebung auch Leiterpeptide beobachtet werden, die sonst mit Signalen der MALDI-Matrix interferieren. Bei Modifikationsreagenzien, die eine fixierte positive Ladung oder ein ausgedehntes, delokali-siertes Elektronensystem ins Peptid einbrachten, wie z.B. Sulforhodamin B oder FMOC-NHS wurde dabei zusätzlich auch eine sehr gute Response im Massenspektrum beobachtet. Die Empfindlichkeiten lagen selbst bei der Sequenzierung der Rohprodukte solcher Derivate im unteren fmol-Bereich. Das charakteristische Isotopenmuster Brom-haltiger Peptidderivate erlaubte weiterhin ein stark vereinfachtes Auslesen der Leitersequenz aus dem Massenspekt-rum. Während die Leitersequenzierung allgemein keine Unterscheidung der isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin erlaubt, gelang die Unterscheidung der ebenfalls isobaren Aminosäuren Lysin und Glutamin nach einer schnellen und selektiven Acetylierung des Lysins mit anschließender C-terminaler Sequenzierung.Im Hinblick auf die Analyse post-translationaler Modifikationen wurden insbesondere Phosphorylierungen eingehender untersucht. Dabei war sowohl bei der N-terminalen, als auch bei der C-terminalen Leitersequenzierung ein enzymatischer Abbau der phosphorylierten Aminosäuren zu beobachten und damit die entsprechende Phosphorylierungsstelle schnell und eindeutig zu identifizieren. Die N-terminale Sequenzierung mit APM lieferte die besten Resultate und ermöglichte sowohl den Abbau von Phosphotyrosin wie auch Phosphoserin, während der C-terminale Abbau sich auf Phosphotyrosin beschränkt zeigte. Aus der Summe der erhaltenen Resultate (Sequenzen) folgt, dass die Leitersequenzierung unter den gegebenen Voraussetzungen – insbesondere der limitierenden Verfügbarkeit zusätzlicher Exopeptidasen mit ergänzenden Spaltungsspezifitäten – im wesentlichen als Instrument zur schnellen Generierung kurzer Sequenztags geeignet ist. Auf diesem Gebiet stellt die erarbeitete Leitersequenzierung im Vergleich zur Edman-Sequenzierung eine wesentlich schnellere Alternative dar. Im Gegensatz zu rein massenspektrometrischen Sequenzierungen ist die Interpretation der Sequenzen im Massenspektrum stark vereinfacht und daher zumeist eindeutig. Die Empfindlichkeit der Methode ist stark von der untersuchten Peptidsequenz abhängig. Generelle Werte für die Empfindlichkeit lassen sich somit nicht angeben, die Resultate lassen jedoch für eine Peptidausgangsmenge im oberen fmol-Bereich (1000-500fmol) eine Leitersequenzierung ausnahmslos möglich erscheinen. Die Ergebnisse von Verdünnungsreihen zeigen zudem, dass auch nach Sequenzierung von Peptidmengen im mittleren bis unteren fmol-Bereich (50-10fmol) ein Auslesen der Peptidsequenz aus dem Massenspektrum zumeist möglich ist. Zum Erreichen solcher Empfindlichkeiten ist die weit-gehende Minimierung von Suppressionseffekten und damit die Verwendung von DHB als MALDI-Matrix eine notwendige Voraussetzung. Eine Evaluierungsstudie mit vier verschiedenen Proteinen führt zum Schluss, dass die Metho-dik auch für die de novo Sequenzierung unbekannter Proteine ein hohes Potential birgt. Die ermittelte Sequenzabdeckung der überlappenden Spaltfragmente lag bei maximal 80%. Im Bereich prolinhaltiger Sequenzabschnitte fehlen Überlappungen dabei am häufigsten, da auf Seiten der N-terminalen Sequenzierung geeignete Exopeptidasen zu Spaltung der Iminbindung nicht verfügbar waren. Zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen, die dann als Hybridisierungssonden in der Nucleinsäureanalytik eingesetzt werden, ist die Länge der erhaltenen Sequenzabschnitte jedoch in fast allen Fällen ausreichend. Die Methoden „MALDI-LS 1.42s“ für die Probenpräparation mit dem Pipettierroboter MultiPROBE II, sowie „multiprobe_5“ für die MALDI-MS Messung mittels AutoXecute auf dem Bruker Reflex III Massenspektrometer, erlauben eine Umsetzung der manuell ausgear-beiteten Methodik auf ein vollständig automatisiertes System. Eine Excel-Tabellenvorlage, die in konvertierter Form von beiden beteiligten Geräten gelesen werden kann, ermöglicht eine zentrale und einfache Dateneingabe für die Proben. Diese Art der Dateneingabe erlaubt im Zusammenspiel mit dem ausgearbeitetem Automatisierungspro-gramm eine vollkommen flexible, individuelle Behandlung der einzelnen Proben. Die erfor-derliche „Ortspräzision“ bei der Abgabe der Flüssigleiten auf dem MALDI-Target konnte durch eine entsprechenden ausgelegte Performance-Datei für den Pipettiervorgang erreicht werden. Querkontaminationen beim Pipettieren wurden durch organische Spülschritte in der Methode eliminiert. In der Summe lieferten die auf dem automatischen Pipettiersystem mit der Methode MALDI-LS 1.42s präparierten Proben im Massenspektrum vergleichbare Abbauspektren und somit auch die gleiche Sequenzinformation, wie entsprechend manuell präparierte Proben. Bei den automatischen MALDI-MS Messungen war eine Anpassung der Parameter insbeson-dere aufgrund der bevorzugten Verwendung der DHB-Matrix notwendig. Ein erhöhter Aceto-nitrilgehalt von 50% im Lösungsmittel der DHB sorgte für eine Verbesserung der Präparation im Bezug auf die automatische AutoXecute Messung. Mit speziellen Rasterkoordinaten, die bei der Laserabtastung der einzelnen Probenspots auf die besonderen Kristallisationseigen-schaften der DHB-Matrix zugeschnitten wurden, konnten gute Ergebnisse erzielt werden. Vorteile zeigten die DHB-Präparationen, im Vergleich zu CHCA-Präparationen, in der Toleranz gegenüber geringfügigen Mengen von Puffersalzen, wie sie bei der enzymatischen Sequenzierung üblich sind. Die Toleranzschwelle für den Abbruch der automatischen Messung musste jedoch bei den enzymatisch sequenzierten Proben und Verwendung von DHB-Matrix im Vergleich zu Messungen salzfreier Peptidproben in CHCA-Matrix erhöht werden, was im Durchschnitt zu etwas längeren Messzeiten führte. Die in dieser Arbeit weiterentwickelten Methoden zur enzymatischen on-target Sequenzie-rung von Peptiden erlauben somit, in Verbindung mit den beschriebenen Hard- und Software-komponenten zur automatischen Probenpräparation und MALDI-MS Messung, deren Einsatz für eine schnelle Sequenzierung in der Proteinanalytik. Zusätzliche Verbesserungen könnten jedoch, bei entsprechender Verfügbarkeit, noch durch Exopeptidasen mit ergänzender Spaltungsspezifität (z.B. X-Pro Aminopeptidase, EC 3.4.11.9) erzielt werden. Auf Seiten der Automatisierung ergäben sich durch die ausschließliche Ver-wendung eines 96er oder 384er Mikrotiterplattenformat auf allen Geräten (Pipettierrobot und MALDI-MS) deutliche Vereinfachungen in der Methode, bei gleichzeitig noch höherem Probendurchsatz.

Sat, 1 Jan 1994 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/6178/1/6178.pdf Lehnert, Peter; Karbach, U.; Veith, K.; Hundegger, K.; Riepl, Rudolf L.