Podcasts about einzelmolek

Hier ist Folge 29 unserer Mandelbrot Talks! In dieser Folge präsentieren wir Euch unsere Diskussionsrunde vom 26. Januar 2019, die wir mit drei Gästen im Rahmen der Göttinger Nacht des Wissens geführt haben. Unser Oberthema waren dabei Biophysik und die Arbeit im Labor. Unsere Gäste waren: Jörg Enderlein: Professor Enderlein studierte an der Universität Odessa Physik und schloss an dieses Studium eine Promotion der Humboldt-Universität Berlin an. Nach Aufenthalten in Los Alamos, Regensburg, am Forschungzentrum Jülich und Tübingen ist er seit 2008 Professor am dritten physikalischen Institut an der Universität Göttingen. Er forscht mit seiner Gruppe an Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie und deren Bildgebung und an Protein Dynamik und der Faltung selbiger. In seiner Gruppe forschen Physiker, Biologen und Informatiker an Methodenverbesserung, in Zusammenarbeit mit dem Sonderforschungsbereich 937 und vielen weiteren auch internationalen Gruppen. Jan-David Nicolas: Jan-David studierte an der Universität Göttingen Physik und promovierte hier dann von 2015 bis 2018 am Institut für Röntgenphysik. Sein Thema war die Röntgenanalyse von biologischen Zellen und Gewebe durch Streuung, sowie kohärente Bildgebung auf verschiedenen Skalen. Nach der Promotion ist er in Göttingen geblieben und arbeitet weiter an diesen Themen. Michael Berger: Michael studierte an der Universität Bochum Physik und spezialisierte sich während seines Studiums auf dem Gebiet der Neuroinformatik. Anschließend promovierte er am Deutschen Primatenzentrum, DPZ, hier in Göttingen. Dabei untersucht er, wie das Gehirn Armbewegungen plant und ausführt. Nach seiner Promotion arbeitet er auch weiterhin am DPZ an diesem Thema. Mit diesen drei Gästen haben wir zunächst einzeln über ihre Forschung, bevor wir dann zu gemeinsamen Themen gekommen sind, darunter die Zeitskalen von Forschungsprojekten, die Bedeutung wissenschaftlicher Kooperationen, das Leben und die Karriereplanung im Wissenschaftsbetrieb sowie das Gelingen guter Wissenschaftskommunikation. Uns hat dieses etwas andere Format sehr viel Spaß gemacht, wir hoffen, euch gefällt diese Folge ebenfalls. Liebe Grüße, Jeanette und Christoph

Thu, 16 Jan 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16578/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16578/1/Mehle_Anja.pdf Mehle, Anja

In den zellulären Stoffwechsel- und Signalnetzwerken existiert eine Vielzahl von logischen Abhängigkeiten, die auf Prozesse auf molekularer Ebene zurückzuführen sind. So lässt sich beispielsweise die Effizienz einer biochemischen Reaktion über Enzyme regulieren, deren Aktivitätsgrad von äußeren Parametern abhängt. Kraft stellt eine dieser Einflussgrößen dar. Diese Arbeit befasst sich damit, das Verhalten mehrerer, logisch verknüpfter, molekularer Domänen unter Krafteinwirkung zu studieren und sich deren Eigenschaften für nanotechnologische Verfahren zu Nutze zu machen. Neben der Untersuchung von in der Natur vorkommenden Proteinen mit multiplen Domänen wurden artifizielle DNA- und proteinbasierte Systeme mit verschiedener Bindungsstärke konstruiert. Dies ermöglicht den gerichteten Transport einzelner, molekularer Bausteine mit der Präzision eines Rasterkraftmikroskopes im Nanometer-Bereich. Mithilfe dieser Single-Molecule Cut-and-Paste (SMCP) Technik können auf der Basis gerichteter, molekularer Erkennung räumliche Arrangements funktioneller Bausteine geschaffen werden. Diese lassen sich mittels Fluoreszenzmikroskopie als isoliertes System betrachten. Die Zielsetzung bei der Untersuchung der natürlichen Systeme war es, deren Abhängigkeiten zu verstehen und herauszufinden, wie sich diese mit ihrer Funktion und den an das Protein gestellten Umgebungsbedingungen in Einklang bringen lassen. Die dabei gewonnene Erkenntnis liefert nicht nur wichtige Beiträge zur biologischen und medizinischen Grundlagenforschung, sondern kann, wie am Beispiel der SMCP-Technik ersichtlich, auch hilfreich bei der Entwicklung neuartiger Messmethoden der molekularen Bio- und Nanotechnologie sein. Mittels Einzelmolekülkraftspektroskopie im „Konstante-Kraft“ (engl. Force-Clamp) Modus wurde die Kooperativität der fünf Proteindomänen des Enzyms Titinkinase untersucht. Dieses Muskelprotein wandelt in der Skelett- und Herzmuskulatur mechanische in biochemische Signale um und regelt dadurch den Umsatz weiterer Proteine und die Expression von Genen. Es wird gezeigt, dass sich die einzelnen mechanisch induzierten Entfaltungsschritte gegenseitig bedingen und dass dies inhärent durch die molekulare Faltung des Proteins vorgegeben wird. Da Kraft zum natürlichen Parameterraum dieses Moleküls gehört, muss seine Struktur an kraftinduzierte konformationelle Änderungen angepasst sein. Durch die Abhängigkeit der Energiebarrieren während der Entfaltung wird gewährleistet, dass stabilisierende und enzymatisch wirksame Domänen nicht vor regulatorischen Domänen entfalten. Myosin-Light-Chain Kinase (MLCK) ist ein weiteres Muskelenzym, bei dem es Hinweise auf eine mechanische Aktivierbarkeit gibt. Einzelmolekülexperimente dieser Dissertation zeigen, dass die Entfaltung der Kinase ebenfalls in mehreren Schritten vonstatten geht und dass einer der Zwischenzustände durch ATP-Bindung stabilisiert wird. Die absoluten Entfaltungskräfte liegen dabei unter denen der Titinkinase, was der Hypothese der mechanischen Aktivierbarkeit entgegenkommt. Als weiteres System wurde das Cellulosom des thermophilen Bakteriums Clostridium Thermocellum auf seine mechanische Stabilität überprüft. Cellulosome sind an der Außenseite von Bakterien und Pilzen verankerte Proteinkomplexe, die in der Lage sind Lignozellulose zu zersetzen. Bei der Prozessierung der Cellulose können im Cellulosom hohe Scherkräfte auftreten, da dieses das gesamte Bakterium mit dem makromolekularen Substrat verknüpft. Mittels AFM-basierter Kraftspektroskopie wurde die Wirkung von Kraft auf einen Verbund verschiedener Konstituenten eines Cellulosoms untersucht. Es wird gezeigt, dass sich der Komplex im Vergleich zu anderen Biomolekülen durch eine extrem hohe mechanische Stabilität auszeichnet. Innerhalb der hohen Entfaltungskräfte besteht eine Hierarchie für die verschiedenen Komponenten. Bei vergleichsweise niedrigen Kräften entfalten die enzymatischen Domänen gefolgt von mittleren Kräften für das Entkoppeln der Enzyme mit dem Bindungspartner Cohesin. Sehr hohen Kräften halten die intramolekularen Wechselwirkungen der Cohesine und der Cellulose bindenden Domänen stand. Die Abstufung hoher Stabilitäten stellt eine sehr gute Anpassung an die natürlichen Anforderungen des Proteinkomplexes dar. Für die durchgeführten Messungen wurde ein modulares Kraftmikroskop (AFM) entwickelt, das sich mit einem einzelmolekülsensitiven Fluoreszenzmikroskop kombinieren lässt. Die spezielle Konstruktion weist eine extrem hohe mechanische Stabilität auf. Mittels einer photothermischen Regelung kann das AFM darüber hinaus für sensitive Bildgebung weicher molekularer Oberflächen oder in einen extrem schnellen kraftspektroskopischen Messmodus mit konstanter Zugkraft verwendet werden. Die akkurate Arbeitsweise des Systems wurde in einem internationalen Vergleichsversuch bestätigt.

Thu, 23 Jul 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10529/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10529/1/Hoegen_Tobias.pdf Högen, Tobias ddc:610, ddc:600, Medizi

Mon, 6 Jul 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12701/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12701/1/Lewis_Robert.pdf Lewis, Robert Alexander

Fri, 19 Dec 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12924/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12924/1/Puchner_Elias.pdf Puchner, Elias M. ddc:530, ddc:500, Fakultät für Physik

Die Synucleinopathien sind eine Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen, die durch pathologische Ablagerungen des Alpha Synucleins charakterisiert sind. Sie umfassen unter anderem den Morbus Parkinson, die Demenz mit Lewy-Körperchen, die multiple Systematrophie und die Lewy Körperchen Variante des auch durch Ablagerungen des Tau Proteins gekennzeichneten Morbus Alzheimer. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse von Aggregationsprozessen des Alpha Synucleins durch einzelmolekülspektroskopische Verfahren und die Entwicklung neuer Techniken zur Analyse von Koaggregationsprozessen verschiedener Proteine. Hierzu wurden Synuclein und Tau Proteine rekombinant in E. coli hergestellt, aufgereinigt, durch Gelelektrophorese und Western Blot charakterisiert und Aggregationsprozesse unter in vitro Bedingungen untersucht. Rekombinantes Alpha Synuclein kann unter bestimmten Bedingungen in vitro zu fibrillären, amyloiden Strukturen aggregieren. Diese Aggregate ließen sich durch eine spezifische Änderung der Thioflavin T Fluoreszenz spektroskopisch nachweisen, mittels Elektronenmikroskopie darstellen, und zeichneten sich durch partielle Resistenz gegen die Einwirkung der Serin Protease Proteinase K aus. Durch Einbau von homologen Sondenmolekülen, die zuvor mit einer fluoreszenten Gruppe kovalent konjugiert wurden, ließ sich die Fibrillenbildung auch mit einzelmolekülbasierten, konfokalen, fluoreszenzspektroskopischen Analyseverfahren wie der Kreuzkorrelationsanalyse und der SIFT-Methode (engl. Scanning for Intensely Fluorescent Targets) darstellen. Der Nachweis der Fibrillenbildung war durch die fluoreszenzspektroskopischen Verfahren 100 fach sensitiver möglich. Im Vergleich mit nicht amyloidogenen Proteinen wie Beta Synuclein und Serum Albumin konnte zudem die Spezifität der Aggregation gezeigt werden. Bei neurodegenerativen Erkrankungen findet sich zum Teil die Beteiligung mehrerer amyloidogener Proteine am pathologischen Prozess. Durch die Möglichkeit der simultanen Anregung verschiedener Fluoreszenzsonden bei verschiedenen Wellenlängen und der Differenzierung des emittierten Fluoreszenzsignals konnten Koaggregationsprozesse in heterogenen Systemen mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie untersucht werden. Es zeigte sich, dass Alpha Synuclein sowohl mit seinem Maushomolog, als auch mit den beiden humanen Parkinson-assoziierten Mutanten A30P und A53T gemischte Fibrillen bildet, während Beta Synuclein einen hemmenden Einfluss auf die Alpha Synuclein Fibrillenbildung aufwies. Mit Hilfe des zweifarbigen Systems ließ sich auch der Anlagerungsprozeß von Alpha Synuclein Monomeren an vorbestehende, amyloide Alpha Synuclein Aggregate darstellen, was einen weiteren Einblick in die molekulare Pathophysiologie der Synucleinopathien bot. Es wird vermutet, dass bereits Oligomerformationen einen neurotoxischen Effekt besitzen. Die besondere Sensitivität der konfokalen Einzelmolekülspektroskopie erlaubte ebenfalls die Detektion von frühen oligomeren Aggregaten des Alpha Synucleins sowie des Tau Proteins. Es konnte gezeigt werden, dass Alpha Synuclein bereits auf Oligomerebene heterogene Aggregate mit dem Tau Protein bildet, was durch die Tatsache, dass es sich bei beiden um intrazelluläre Proteine handelt, eine potentielle pathophysiologische Relevanz besitzt. Im Rahmen von Versuchsreihen zum Einfluss von Liquor aus an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen leidenden Patienten, ließen sich Hinweise auf eine mögliche neuroprotektive Funktion des Liquors gewinnen. Dieser zeigte nach Gelfiltration in bestimmten Fraktionen deutlich aggregationshemmende Eigenschaften. Diese Fraktionen besitzen einen hohen Gehalt an Albumin. Zusammen mit in vitro gewonnenen Daten, die einen hemmenden Einfluss von Albumin auf die Aggregation des Alpha Synucleins zeigen, sind dies Hinweise, dass die protektive Eigenschaft an den Albumingehalt des Liquors gekoppelt ist. Das diagnostische Potential der entwickelten Messmethode verdeutlichten parallel durchgeführte Analysen von Influenza-Impfstoffpräparationen, in denen gezeigt werden konnte, dass sich Partikel mit unterschiedlichen Oberflächenepitopen auch in Mischungen differenzieren lassen. Durch den Einsatz von spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern ließen sich eindeutig bestimmte Influenzastämme anhand der Oberflächenepitop-Konfiguration identifizieren. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die konfokale Einzelmolekülspektroskopie eine äußerst sensitive und hochdurchsatzfähige Nachweismethode zur Untersuchung der molekularen Vorgänge im Rahmen der Alpha Synucleinopathien darstellt, deren Potential sich nicht allein auf die Grundlagenforschung beschränkt, sondern auch diagnostische Möglichkeiten beinhaltet und eine neue Methode zur Suche von bisher noch nicht beschriebenen, pharmakologisch interessanten Strukturen bietet.

Fri, 27 Jul 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7659/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7659/1/Schluesche_Peter.pdf Schlüsche, Peter ddc:500, d

Die konfokale Fluoreszenzspektroskopie ermöglicht die Untersuchung der Struktur und Dynamik von Biomolekülen. In den letzten Jahren konnte sie sich zunemend im Bereich der Einzelmolekülspektroskopie etablieren, jedoch besteht gerade im Hinblick auf die zunehmende Zahl der in vivo-Anwendungen Potential, die Sensitivität und die Information, die aus einem einzelnen Datensatz herausgefiltert werden kann , zu erhöhen. In dieser Arbeit konnte die Methode der gepulsten alternierenden Anregung (Pulsed Interleaved Excitation, PIE) entwickelt werden, bei der die zusätzliche Information zugänglich ist, mit welcher Anregungsquelle das jeweilige Photon erzeugt wurde.

Biologische molekulare Maschinen erfüllen in der Natur zentrale Aufgaben und erstrecken sich über alle Bereiche des Lebens. Ihren Aufbau und ihre Funktionsweise im Detail zu untersuchen und zu verstehen, ist ein großes Feld der aktuellen Forschung. Inspiriert durch die biologischen molekularen Maschinen wurde in den letzten Jahren versucht, künstliche molekulare Maschinen aufzubauen. Einer dieser Ansätze verwendet ein photoaktives Polymer, das durch das Bestrahlen mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge kontrahiert oder relaxiert werden kann. Wird dieses photoaktive Polymer an ein Kraftspektroskop gekoppelt und über Totale Interne Reflexion (TIR) angeregt, so lässt sich damit eine künstliche molekulare Maschine realisieren, die aus einem einzelnen Polymer besteht. Bestandteil dieses photoaktiven Polymers sind Azobenzoleinheiten, die reversibel zwischen der cis- und der trans-Konformation geschaltet werden können. Dadurch wird das Polymer (Azobenzolpolypeptid) kontrahiert oder relaxiert und kann Arbeit an der Cantileverspitze des Kraftspektroskops verrichten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein detailliertes Verständnis dieser künstlichen molekularen Maschine zu erlangen. Dazu wurde zuerst das Schalten der Azobenzoleinheiten im Polymer bei niedriger Kraft demonstriert. Anschließend wurde eine externe Kraft angelegt und beobachtet, dass sich das Schaltverhalten erst bei sehr hohen Kräften verändert. Das zweite Ziel war die Entwicklung eines theoretischen Modells, zur Beschreibung der Kraft-Abstandskurve des Azobenzolpolypeptid über den gesamten Kraftbereich. Dazu wurden ab-initio quantenmechanische Rechnungen für das Azobenzol durchgeführt und mit dem Modell der „Frei-Rotierenden-Kette“ kombiniert. Dieses Modell hat den Vorteil, dass es mit der Segmentlänge und der Anzahl der Monomere als Fittparameter auskommt. Es ist nun möglich die Kraft-Abstandskurven des Azobenzolpolypeptid direkt durch die Anzahl der Azobenzoleinheiten in der trans- und in der cis-Konformation über den ganzen Kraftbereich (0 bis 1000pN) zu beschreiben. Das Schaltverhalten des Polymers wird damit durch das Verhältnis der Anteile im cis- bzw. trans-Zustand ausgedrückt. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung eines Rezeptor-Ligand-Systems. Am Beispiel des anti-Digoxigenin Antikörpers gegen Digoxigenin wurden Experimente über einen großen Bereich von Kraftladungsraten durchgeführt. Dadurch zeigte sich, dass die bisherige Analysemethode nur grobe Einblicke in die Energielandschaft der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zulässt. Es konnte beispielsweise eine natürliche Dissoziationsrate von koff=0.015s-1 aus den kraftspektroskopischen Experimenten bestimmt werden, die mit Messungen an Fv-Fragmenten am Ensemble gut übereinstimmen (koff=0.023s-1). Aussagen bezüglich der Energielandschaft gestalteten sich schwieriger. Zuerst wurde das Maximum der Krafthistogramme als Funktion der Maxima der Ladungsratenhistogramme in einem Diagramm dargestellt. Dieses Diagramm wurde nach der Methode von Evans ausgewertet. Daraus ergab sich für den niedrigen Ladungsratenbereich die obige Dissoziationsrate von koff=0.015s-1 und eine Potentialweite von Dx=1.15nm. Für den hohen Ladungsratenbereich ergab sich eine Dissoziationsrate von koff=4.56s-1 und eine Potentialweite von Dx=0.35nm. Mit diesen Werten wurde nun versucht, die einzelnen Krafthistogramme für alle Ladungsraten zu fitten. Es hatte sich gezeigt, dass es bei niedrigen und bei hohen Ladungsraten eine Übereinstimmung zwischen dem gemessenen Krafthistogramm und der berechneten Wahrscheinlichkeitsverteilung gab. Allerdings konnte bei sehr hohen Ladungsraten und in dem Übergansbereich zwischen den beiden Bereichen keine Übereinstimmung erzielt werden. Daher sind Aussagen über die Energielandschaft nur beschränkt möglich. Um eine vollständige Auswertung der experimentellen Daten zu erreichen, werden weitere Entwicklungen bezüglich des theoretischen Modells nötig sein. Ein Ansatz besteht darin, ein mögliches Potential anzunehmen und darauf die Theorie von Kramers anwenden. Das Ergebnis wäre dann eine kraftabhängige Dissoziationskonstante koff für ein spezielles Potential. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Mehrkanal-Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (SPR)-Spektrometer aufgebaut und charakterisiert.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten Einzelmolekül-Messungen zur Bindung von myristoyliertem Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt werden. Die Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC) und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine Signal/Rausch-Analyse ermöglichte die Bestimmung der Sensitivität und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde für verschiedene prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso stärker, je höher der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten überein, die mit etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen, dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren Peptidkonzentrationen möglich sind. FCS stellt eine präzise Methode zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmembranen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Größenverteilung bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales System dar. Unter dem Einfluss eines natürlichen Surfactants (Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung von Alveofact unabhängig von der Ionenkonzentration ein stabiles Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten Plasmiden. Dagegen führte die Inkubation mit Alveofact zu einer langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in diesem Fall nach 60 min eine Größe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex. Mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die Größe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und höhere negative Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der makroskopischen Viskosität der Polymerlösung wurden die Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver Überschussladung wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen Komplexe ein ähnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe ermöglichte also einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.

In der vorliegenden Arbeit werden mittels der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie und einer neuartigen Ultrakurzzeit-Photostromkorrelationstechnik der Energietransfer und die Ladungsträgererzeugung in konjugierten Polymeren untersucht. Aufgrund ihrer großen Flexibilität sowohl in Bezug auf die elektronischen und optischen Eigenschaften als auch im Hinblick auf die Verarbeitungsmöglichkeiten erschließen diese molekularen Halbleiter zahlreiche Anwendungsfelder aus der Optoelektronik. Hierzu gehören insbesondere die organischen Leuchtdioden und Photodetektoren, aber auch Laser und Transistoren. Der Energietransfer zwischen einzelnen Untergruppen eines konjugierten Polymermoleküls, sogenannten Chromophoren, wird erstmals durch zeitaufgelöste Einzelmolekülspektroskopie direkt verfolgt. So wird der Transfer von Anregungsenergie zwischen zwei energetisch verschiedenen Chromophoren zeitlich aufgelöst und mit theoretischen Modellen verglichen. Durch die Messung der homogenen Linienbreite der Einzelmolekül-Photolumineszenz bei Temperaturen zwischen T = 5K und T = 300K und deren Auswirkung auf die Mobilität der Anregungen wird in dieser Arbeit der mikroskopische Mechanismus des Energietransfers direkt zugänglich. Es zeigt sich, daß der Energietransfer über die stark temperaturabhängige Linienbreite der Absorption und Emission der einzelnen Chromophore kontrolliert wird. Die Messung der Polarisations-Anisotropie des konjugierten Polymers gibt Aufschluß über die relative Orientierung der Chromophore zueinander. Es zeigt sich, daß eine geeignete Molekülgeometrie in Verbindung mit dem Energietransfer zu einer hochgradig polarisierten Emission von Photolumineszenz selbst bei unpolarisierter Anregung führt. Mit einer neuartigen Kombination von optischer Ultrakurzzeitspektroskopie und Photostrommessungen wird die Photoerzeugung von Ladungsträgern in Polymer-Dünnschichtdioden mit einer Zeitauflösung im sub-Pikosekunden Bereich verfolgt. Erstmals gelingt damit der direkte Nachweis, daß alle freien Ladungsträger durch zeitverzögerte Dissoziation von optisch generierten Exzitonen auf der Zeitskala der Exzitonenlebensdauer von 100 ps erzeugt werden. Darüberhinaus wird die ultraschnelle Dissoziation ”heißer“ Exzitonen binnen 0.1 Pikosekunden beobachtet, die jedoch nicht freie Ladungsträger erzeugt, sondern schwach Coulomb-gebundene Paare von Ladungsträgern, sogenannte Polaronenpaare. Die Polaronenpaare weisen eine verschwindende Lumineszenzausbeute auf, tragen aber auch nicht zum Photostrom bei und stellen daher einen Verlustkanal für Polymer-Leuchtdioden und für organische Solarzellen dar. Der quantitative Vergleich mehrerer ultrakurzzeitspektroskopischer Signale erlaubt erstmals eine quantitative Bestimmung der Erzeugung von Polaronenpaaren ohne die Annahme weiterer Materialparameter. An zwei Modellsystemen effizienter organischer Polymer-Photodioden, nämlich Mischsystemen aus einem konjugierten Polymer mit dem Elektronenakzeptor C60, wird die Bedeutung der Polaronenpaare für organische Photodetektoren nachgewiesen. Wiederum durch die Kombination der Ultrakurzzeitspektroskopie mit Photostrommessungen kann eindeutig zwischen freien Ladungsträgern und Polaronenpaaren unterschieden und deren Population getrennt verfolgt werden. Die zentrale Rolle der Polaronenpaare für die Photostrom-Quantenausbeute in verschiedenen organischen Nanokompositen wird herausgearbeitet. Es zeigt sich, daß die makroskopisch beobachtete Diskrepanz zwischen der Zahl dissoziierter Anregungen und der Zahl detektierter freier Ladungsträger auf der Tendenz einiger Materialien beruht, die Erzeugung von Polaronenpaaren mit einer hohen Rekombinationswahrscheinlichkeit zu begünstigen.

DNA ist als Trägermolekül der Erbinformation von zentraler biologischer Bedeutung. Die vielfältigen Strukturen, die DNA bildet, werden dabei durch molekulare Erkennungsmechanismen gesteuert, die für jede Sequenz einzigartig sind. So bietet DNA auch die Möglichkeit gezielt und selbstorganisiert Strukturen aufzubauen, die als Grundlage für nanotechnologische Systeme dienen können. Um die Funktion einer Zelle sicher zu stellen treten viele verschiedene Moleküle mit DNA in Wechselwirkung. Dabei wird die DNA kompaktiert, entwunden, aufgetrennt und komplexiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Kraftmessungen an einzelnen DNA-Molekülen durchgeführt. Dabei wurde sowohl das Entfalten (Unzipping), als auch das Überstrecken und kraftinduzierte Schmelzen untersucht. Insbesondere wurden die mechanischen Aspekte der Wirkung DNA-bindender Pharmaka auf molekularer Ebene studiert.

Die Eph-Familie von Rezeptortyrosinkinasen und ihre Liganden, die Ephrine, sind die größte Gruppe von axonalen Zielführungsmolekülen. Die membrangebundenen Ephrine und ihre Rezeptoren sind jedoch nicht ausschließlich für die Etablierung neuronaler Konnektivität, sondern auch für Entwicklungsvorgänge außerhalb des Nervensystems wie die Ausbildung des Blutgefäßsystems und die Steuerung von Zellmigration von Bedeutung. Als charakteristisches Merkmal dieser Molekülfamilie kann jeder einzelne Rezeptor durch eine Vielzahl verschiedener Ephrine aktiviert werden, was eine starke funktionelle Redundanz zur Folge hat. Konventionelle knock-out Experimente liefern daher nur ein unvollständiges Bild von der Funktion dieser Proteine, da eine genetische Deletion von Einzelmolekülen zumindest partiell von anderen Vertretern der Eph-Familie kompensiert werden kann. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine transgene Mauslinie etabliert, welche im gesamten Nervensystem ein sezerniertes, Antikörper-ähnliches Fusionsprotein, einen sog. Rezeptorkörper, exprimiert. In dieser Mauslinie sollte der Rezeptorkörper alle Ephrine der sog. A-Subfamilie zugleich binden und neutralisieren, und damit die funktionelle Redundanz der A-Ephrine überwinden. Hierzu wurde in einem ersten Schritt der Rezeptorkörper kloniert, in Zellinien exprimiert und hinsichtlich seiner Funktionalität charakterisiert. In einem zweiten Schritt wurde nun das Mikrotubuli bindende Protein Tau gegen die cDNA des Rezeptorkörpers ersetzt (sog. knock-in), und nach Keimbahntransmission des rekombinanten Allels wurde durch Rückkreuzung gegen den Inzuchtstamm C57BL/6 eine congenische Mauslinie erzeugt. In dieser Mauslinie wurde der Rezeptorkörper mit dem räumlich-zeitlichen Expressionsmuster von tau exprimiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden einige Eigenschaften der knock-in Mauslinie charakterisiert. Die vollständige Deletion des Tau-Proteins sowie die pan-neuronale Expression des Rezeptorkörpers wurden mit Hilfe von Northern-Transfer, mRNA in-situ Hybridisierung, RT-PCR sowie mit Western-Transfer und immunhistochemischen Experimenten belegt. Tiere mit dem rekombinanten Allel waren fertil, zeigten keine Hinweise für eine erhöhte prä- oder postnatale Letalität, und das äußere Erscheinungsbild der Mäuse war weitgehend unauffällig. Eine erste Analyse der Hirnanatomie mit Hilfe klassischer histologischer Färbemethoden lieferte keine Hinweise auf starke, offensichtliche morphologische Veränderungen. Mit einem Immunassay wurde die Gewebekonzentration des Rezeptorkörpers zu verschiedenen embryonalen und postnatalen Entwicklungsstufen quantifiziert. Auf subzellulärer Ebene wurde mittels immuncytochemischer Färbungen dissoziierter Neuronen demonstriert, daß der Rezeptorkörper nicht auf das Soma der Zellen beschränkt, sondern auch in Nervenfortsätzen lokalisiert war. Die Analyse der Mauslinie auf spezifische Veränderungen im dritten Teil der Arbeit konzentrierte sich auf sensorische Projektionen in Peripherie und Rückenmark, sowie auf physiologische Aspekte des visuellen Systems und Blutgefäße. In neugeborenen Tieren wurden keine offensichtlichen Veränderungen der topographischen Projektionen von Spinalganglien in das Rückenmark detektiert. In der Peripherie wurde in dem knock-in hingegen eine signifikante Zunahme von Nervenverzweigungen in verschiedenen Strukturen beobachtet, die bei der Innervierung von Extremitäten sowie bei Interkostalnerven zwischen dem 12. und dem 14. Tag der Embryonalentwicklung (E12-14) besonders ausgeprägt war. Die Untersuchung der Blutgefäße im zentralen Nervensystem adulter Mäuse mit Hilfe von Korrosionsausgüssen ließ in der Mutante keine offensichtlichen Veränderungen erkennen. Mit Hilfe der in Anwendung auf Mäuse neuartigen Technik „Intrinsic Signal Optical Imaging“ wurde die Repräsentation der Retina im Primären Visuellen Cortex juveniler und adulter Mäuse untersucht. Zentraler Befund dieser Experimente war eine Verzerrung der retinotopen Karte in dem knock-in, die in jungen Mäusen erheblich stärker war als in adulten Tieren.

Die Anwendung der Einzelmolekülspektroskopie auf poröse Festkörper wird erstmals in dieser Arbeit beschrieben. Um diese relativ neue Methode auf die Untersuchung von Farbstoffen in porösen Festkörpern anzuwenden, wurde ein konfokales Mikroskop so umgebaut, daß es zur Detektion und Spektroskopie einzelner Moleküle einsatzfähig ist. Dafür wurden verschiedene optische Detektionssysteme aufgebaut, um alle im Fluoreszenzlicht enthaltenen Informationen zu erhalten. Mit einer Avalanche Photodiode wurde die Empfindlichkeit des Mikroskops auf die Detektion einzelner Lichtquanten gesteigert. Mit einem gepulsten Laser wurde der ZeitbereichObwohl die Einzelmolekülspektroskopie im Vordergrund der Arbeit steht, sind auch einige interessante Beobachtungen an porösen Materialien mit vielen Farbstoffmolekülen (Ensemblemessungen) durchgeführt worden. Aufgrund des hohen dreidimensionalen Auflösungsvermögen des konfokalen Mikroskopes war es möglich, auch an nur wenige Mikrometer großen Kristallen ortsaufgelöste Untersuchungen durchzuführen. Bisher war es oft nicht möglich, zwischen Oberflächeneffekten und Eigenschaften, die in der Porenstruktur hervorgerufen werden, zu unterscheiden. Untersuchungen mit vielen Farbstoffmolekülen (Ensemblemessungen) zeigten, daß auch scheinbar perfekte Kristalle im Inneren oft unregelmäßig aufgebaut sind. So wurde eine Methode entwickelt, um Defektstrukturen in Kristallen mit Fluoreszenzfarbstoff anzufärben und dreidimensional mit dem konfokalen Mikroskop darzustellen. Große kalzinierte MFI Kristalle besitzen Defektstrukturen, die sich im Inneren entlang der langen Kristallachse ausbreiten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß scheinbar homogen mit Farbstoff beladene Kristalle oft eine sehr ungleichmäßige Farbstoffverteilung besitzen. Auch Kristalle, die schon während der Synthese mit Farbstoff beladen werden, sind oft nicht gleichmäßig beladen. Dreidimensionale Fluoreszenzbilder von großen und regelmäßig aufgebauten AlPO4-5 Kristallen, die mit dem Farbstoff DCM beladen wurden, zeigten verschiedene geordnete und ungeordnete Strukturen. Durch die Analyse der Polarisation kann die Orientierung der Farbstoffmoleküle untersucht werden. Untersuchungen an verschieden großen Oxazin Farbstoffen, die während der Synthese in AlPO4-5 eingebaut wurden, zeigten, daß die Ausrichtung entlang der Porenrichtung mit steigender Molekülgröße abnimmt. Das kleine Oxazin 1 ist noch relativ gut orientiert, während das große Oxazin 750 ohne Vorzugsrichtung eingebaut wird. In verschiedenen M41S Materialien wurde die Diffusion von Farbstoff untersucht. Fluoreszenzbilder von M41S Monolithen zeigten das Eindiffundieren verschiedener Farbstoffe in den Festkörper. Über die zeitabhängige Analyse der Eindringtiefe konnten dadurch die Diffusionskonstanten ermittelt werden. Es zeigte sich, daß die Diffusion jeweils bei geladenen Molekülen, größeren Molekülen und bei kalziniertem Monolithen verlangsamt wird. Die Untersuchung des Diffusionsverhaltens in einer M41S Nadel zeigte eine etwa doppelt so schnelle Diffusion quer zur Nadel. Dies steht in Übereinstimmung zu elektronenmikroskopischen Bildern, die zeigen, daß die Nadeln aus zirkularen Poren besteht, die quer zur Nadelrichtung orientiert sind. Im Verlauf dieser Arbeit wurden erstmals einzelne Farbstoffmoleküle innerhalb von porösen Festkörpern detektiert. Im Vergleich zu Referenzproben, bei denen der Farbstoff in einer dünnen Polymerschicht eingebettet wird, ist das Signal zu Untergrund Verhältnis der Einzelmoleküluntersuchungen in den porösen Festkörpern etwas geringer. Auch an der Photostabilität der Fluoreszenzfarbstoffe konnte durch die Einlagerung in die Porenstrukturen keine Verbesserung beobachtet werden. Die Moleküle können nicht nur detektiert, sondern auch spektroskopiert werden. Dabei konnten durch die Analyse der Fluoreszenz verschiedene Parameter bestimmt werden, wie folgende Tabelle zeigt: der Detektion bis hinab in den Nanosekundenbereich erweitert. Durch den Einbau einer Lambda-Halbe Platte wurde die Polarisation des Laserlichtes beeinflußt, um die Orientierung eines einzelnen Moleküls zu bestimmen. Schließlich wurde durch den Einsatz eines Prismas und einer empfindlichen CCD-Kamera die spektrale Aufspaltung ermöglicht, um damit die Fluoreszenzspektren zu bestimmen. Mit allen Experimenten war es nicht nur möglich statische Eigenschaften der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe zu bestimmen, sondern auch deren dynamische Veränderungen. Eine der wichtigsten Anforderungen an organische Farbstoffmoleküle für Einzelmolekülspektroskopie ist die Photostabilität. Um geeignete Farbstoff für den Einbau in die Porenstrukturen zu erhalten, wurden die Photostabilitäten verschiedener Farbstoffe untersucht. Dazu wurden von einigen ausgewählten Farbstoffen die detektierbaren Fluoreszenzphotonen gezählt. Es stellte sich heraus, daß das Farbstoffmolekül TDI in einer dünnern PMMA Schicht eine außergewöhnlich hohe Photostabilität besitzt. Einige TDI-Molekülen emittieren sogar 10 11 Fluoreszenzphotonen bis zum irreversiblen Photobleichen. Zum anderen wurde für sehr instabile Farbstoffmoleküle eine Methode entwickelt, um durch Bleichexperimente an einem Ensemble von Molekülen mit dem konfokalen Mikroskop die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen zu ermitteln. Für den Einbau in poröse Festkörper wurden daraufhin einige Oxazinfarbstoffe und das in biologischen Untersuchungen häufig verwendete Cy5 ausgewählt. Diese Farbstoffe können im roten Spektralbereich anreget werden und besitzen mit etwa 10 7 emittierten Fluoreszenzphotonen eine relativ gute Photostabilität. Als Porenstruktur wurden besonders zwei Materialien untersucht. Die Porenstruktur AFI, die im Material AlPO4-5 vorkommt, besitzt eindimensionale Kanäle, die hexagonal wie in einer Bienenwabe angeordnet sind. Von diesem Material können auch regelmäßige Kristalle hergestellt werden, die bis zu einem Millimeter lang sind. Leider sind die Poren des AlPO4-5 mit 0,73 nm Innendurchmesser sehr eng. Alle geeigneten Fluoreszenzfarbstoffe sind etwas größer und werden daher in mehr oder weniger großen Deformationen in dem Kristall eingelagert. Größere Poren besitzen die mesoporösen M41S Materialien. In diese passen alle Farbstoffe ohne Deformation hinein. Jedoch ist die Kristallgröße der M41S Materialien auf wenige µm beschränkt. Mit der Methode der homogenen Fällung können die bisher größten hexagonal geordneten MCM-41 Kristalle hergestellt werden. Zentimeter große hexagonale M41S Festkörper (Monolithe), die durch eine Synthese mit einem Flüssigkristall hergestellt werden, verlieren, wie hier gezeigt wird, während der Synthese ihre eindimensionale Ausrichtung der Poren.Beobachtete Eigenschaft des Lichtes Information aus statischen Bestimmungen Information aus zeitabhängigen Bestimmungen Intensität immer Notwendig Raten (Singulett, Triplett, etc.) Ort Position Diffusion, Transport Polarisation Orientierung Drehung, Rotation Energie Fluoreszenzspektren spektrale Diffusion Diese verschiedenen Untersuchungsmöglichkeiten wurden aufgebaut und an einer Referenzprobe (TDI in PMMA) getestet. Für die Datenanalyse konnte zum Teil auf Methoden in der Literatur zurückgegriffen werden. Es wurde darauf geachtet, daß immer eine Fehlerabschätzung oder eine Simulation durchgeführt wurde, damit die Ergebnisse sinnvoll interpretiert werden konnten. Oft konnten schon an der Referenzprobe (TDI in PMMA) sehr interessante Ergebnisse erhalten werden. So wurden z.B. neben der extrem hohen Photostabilität zwei verschiedene Populationen der Triplettlebensdauer gemessen. Die Position eines einzelnen TDI Moleküls konnte durch die Detektion vieler Photonen auf besser als 1 nm bestimmt werden. Die Analyse von zeitabhängigen Orientierungswinkeln deutet darauf hin, daß ein TDI Molekül in PMMA noch eine sehr geringe Wackelbewegung (~1°) ausführen kann. Bei der Analyse mehrerer 10000 Fluoreszenzspektren von einem TDI Molekül konnten spontane Änderungen der Fluoreszenzwellenlänge und der Schwingungskopplung beobachtet werden. Obwohl die Messungen in den Porenstrukturen aufgrund der geringeren Photostabilität nicht so präzise Ergebnisse liefern, konnten auch hier interessante Beobachtungen gemacht werden. Durch die Analyse der Orientierungswinkel vieler individueller Farbstoffmoleküle konnte gezeigt werden, daß die einzelnen Oxazinfarbstoffe in AlPO4-5 eine gaußförmige Verteilungsfunktion bezüglich ihres Tiltwinkels zur Porenrichtung aufweisen. Die zuvor erwähnten Messungen an einem Ensemble von Molekülen können die Form der Verteilungsfunktion nicht bestimmen. Aufgrund der Kenntnis einer gaußförmige Verteilungsfunktion kann auf ein statistisches Einbauverhalten der Farbstoffmoleküle in Defektstrukturen während der Synthese geschlossen werden. Auch in einem MCM-41 Kristall, dessen große Poren jeden beliebigen Einbauwinkel des Farbstoffes Cy5 erlauben würden, wird eine bevorzugte Orientierung beobachtet. Der Orientierungswinkel zur Porenrichtung zeigt auch hier eine gaußförmige Verteilungsfunktion. Interessanterweise wird bei der frontalen Ansicht auf die hexagonale Struktur (entlang der Bienenwabenstruktur) eine bevorzugte Orientierung auf die Flächen des Sechsecks beobachtet. Eine Ensemblemessung kann unmöglich diese bevorzugte Orientierung detektieren. Neben diesem statischen Verhalten zeigen einige wenige Moleküle auch eine Änderung der Molekülorientierung. Zwei individuelle Oxazin 1 Moleküle änderten ihre Orientierung in AlPO4-5 während der Messung spontan. Im Vergleich zu den anderen Oxazin 1 Molekülen besaßen diese beiden einen ungewöhnlich großen Orientierungswinkel gegen die Porenrichtung. Vermutlich wird die Bewegung durch einen größeren Defekt der Porenstruktur ermöglicht. Ein TDI Molekül im Inneren eines M41S Monolithen zeigte sogar eine mehrfache Drehung zwischen 3 verschiedenen Orientierungen.Eine Dynamik bezüglich des Ortes zeigten einzelne TDI Moleküle im M41S Monolith. Aufgrund der starken hydrophoben Eigenschaften des TDI kann davon ausgegangen werden, daß sich der Farbstoff immer noch im Inneren der Mizelle des Flüssigkristalls befindet, aus dem der Festkörper synthetisiert wurde. Die Diffusionsbewegung kann durch eine Serie von Fluoreszenzbilden mit dem konfokalen Mikroskop direkt verfolgt werden. Entgegen der erwarteten eindimensionalen Diffusion, die die hexagonale Struktur des Monolithen eigentlich erwarten läßt, wird eine isotrope Diffusion ohne Vorzugsrichtung beobachtet (D ~ 0,04 µm 2 /s). Im reinen Flüssigkristall dagegen ist die eindimensionale Diffusion vorhanden. Vermutlich werden die eindimensionalen Poren bei der Synthese der festen Silikatwand so stark verknäult, daß auf der beobachteten Längenskala ein Festkörper ohne Vorzugsrichtung entsteht. Auch die viel langsamere Diffusion im Vergleich zum reinen Flüssigkristall (D ~ 2 µm 2 /s) kann über diese Verknäulung der Poren erklärt werden. Schließlich wurden noch Messungen durchgeführt, um simultane Änderungen der Orientierung, Fluoreszenzspektren oder Triplettraten an einem einzelnen Farbstoffmolekül zu beobachten. Besonders die gleichzeitige Detektion von Fluoreszenzspektren und der Orientierung lassen sich experimentell gut durchführen. Zur Interpretation der Ergebnisse muß hier zwischen einer starken und einer schwachen Kopplung zwischen Gast und Wirt unterschieden werden. Bei einer polaren Probe wird eine starke Wechselwirkung zwischen Gast und Wirt erwartet. Diese müßte dazu führen, daß sich Änderungen in der Orientierung auch in geänderten Fluoreszenzspektren und umgekehrt bemerkbar machen. Bei einem geladenen Molekül wie Oxazin 1 wird solch eine starke Kopplung des elektronischen Systems an die polare AlPO4-5 Umgebung erwartet. Eine starke Änderung des Fluoreszenzspektrums könnte daher von einer Umorientierung des Farbstoffes herrühren. Bei den durchgeführten gleichzeitigen Messungen konnte aber nur spektrale Diffusion (±1-20 nm), aber keine gleichzeitige signifikante Umorientierung (>3°) beobachtet werden. Eine Erklärung für dieses Verhalten könnte die Bewegung des Gegenions des Farbstoffmoleküls sein, dessen Lage einen großen Einfluß auf die Fluoreszenzeichenschaften hat. Eine Umorientierung mit gleichzeitiger Detektion der Fluoreszenzspektren konnte jedoch nicht gemessen werden. Beide Ereignisse, Umorientierungen und spektrale Änderungen, konnten an TDI im M41S Monolith detektiert werden. Dabei zeigte sich aber, daß es sich hier um zwei unabhängige Prozesse handelt. Deutliche spektrale Sprünge (> 3 nm) korrelieren nicht mit deutlichen Umorientierungen (~60°). Eine geometrische Änderung des Farbstoffmoleküls oder der näheren Umgebung scheidet daher als Ursache für die spektrale Diffusion aus. Da hier aber eine schwache Wechselwirkung zwischen dem unpolaren TDI und der unpolaren Tensidumgebung vorliegt, werden auch keine starke Änderungen der Fluoreszenzspektren während der Umorientierung erwartet. Die spektrale Diffusion wird hier vermutlich von kleinen diffundierenden Teilchen (z.B. O2 oder Ionen) verursacht, die sich unabhängig von den Farbstoffmolekül bewegen können. Die Methode der Einzelmolekülspektroskopie liefert neue Einblicke in poröse Festkörper. Besonders durch die zeitabhängigen Untersuchungen können Informationen erhalten werden, die zuvor unter dem Mittelwert verborgen blieben. Ein kleiner Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Tieftemperaturfluoreszenz-spektroskopie an dem grün fluoreszierendem Protein (GFP). Dafür wurden der Wildtyp und verschiedene Varianten mit Mutationen in der Umgebung des zentralen Chromophors bei 2 K untersucht. Im Vergleich zur Raumtemperatur zeigten die Spektren bei tiefen Temperaturen deutlich mehr Struktur. Dadurch konnten verschiedene Sub-Zustände in den Varianten identifiziert werden. Bei fast allen Varianten konnten durch intensive Bestrahlung langwellig absorbierende Photoprodukte erzeugt werden, die erst bei etwa 50 bis 100 K wieder zerfallen. Obwohl eine relativ starke Elektron-Phonon-Kopplung beobachtet wird, ist an einigen ausgewählten Stellen auch hochaufgelöste Tieftemperaturspektroskopie wie spektrales Lochbrennen und Fluoreszenzlinienverschmälerung möglich. Durch Temperatur-Ableitungs-Spektroskopie werden an Wildtyp-GFP die Energien und Verteilungsfunktionen der Zerfallsbarrieren der metastabilen Photoprodukte bestimmt. Schließlich wurde durch temperaturabhängige Kurzzeitspektroskopie an Wildtyp-GFP der 'Excited state proton transfer' (ESPT) charakterisiert. Für diesen wird bis etwa 50 K eine thermische Barriere nach Arrhenius mit einer Aktivierungsenergie von ~2,3 kJ/mol gefunden. Unterhalb von etwa 50 K dominiert vermutlich ein Tunnelprozeß.

1. Durch eine basenfreie Variante der Suzuki-Reaktion gelingt es neue Aryl und Heteroaryl substituierte Pyrrolopyrrol-1,4-dione herzustellen, die durch N-Butylgruppen in vielen organischen Lösungsmitteln löslich sind. 1.1. Die neuen Farbstoffe zeichnen sich im Vergleich zum methylierten DPP-Grundkörper 24 durch höhere Stokes-Shifts (26-51%) bei guten Fluoreszenzquantenausbeuten (78- 89%) aus. 1.2. Anhand von Röntgen-Kristallstrukturanalysen der Verbindungen 38 und 41 kann der Einfluss von Packungseffekten auf die Festkörperfluoreszenz untersucht werden. Dabei zeigt sich, dass in der Packung von 41 die DPP-Chromophore relativ isoliert vorliegen. Die Anordnung in parallelen Doppelschichten in der Packung von 38 macht π-π- Wechselwirkungen zwischen den Chromophoren möglich, die zu einer bathochromen Verschiebung der Festkörperfluoreszenz führen. 2. In einer Eintopf-Reaktion kann durch Stannylierung mit Hexabutyldizinn und anschließende Stille-Reaktion die dichromophore Verbindung 45 in kleinen Ausbeuten hergestellt werden. Als Vergleichsverbindung wird die dichromphore Verbindung 47 durch Suzuki-Reaktion von 30 mit 4,4‘-Biphenylbisboronsäure synthetisiert. 2.1. Das unerwartete Absorptions- und Emissionsverhalten des Dichromophors 45 kann durch das Modell der Excitonenkopplung erklärt werden. 3. Durch die Verwendung von stöchiometrischen Mengen Tetrabutylammoniumbromid als Halogenidquelle zur Stabilisierung des Palladium-Katalysators gelingt die Umsetzung des Brom substituierten Pyrrolopyrrols 30 mit verschiedenen Styrolderivaten zu trans-Alkenyl substituierten DPP-Farbstoffen (Heck-Reaktion). 3.1. Die um eine Phenylvinyl-Einheit erweiterten Pyrrolopyrrole 55-57 zeigen große Stokes- Shifts bei mäßigen bis guten Fluoreszenzquantenausbeuten (47-78%). 3.2. Durch die freie Aminfunktion ist Verbindung 57 grundsätzlich als Fluoreszenzmarker für Immunoassays geeignet. 4. Alkinyltrialkylstannane reagieren mit 30 oder 31 unter Palladium-Katalyse zu Alkinyl substituierten DPP-Farbstoffen (Stille-Reaktion). 4.1. Das durch Desilylierung von 60 zugängliche Alkin 63 kann oxidativ zum Dichromophor 64 dimerisiert werden oder mit Dimethylaminotrimethylzinn stannyliert werden. Das Stannan 71 ermöglicht die Verknüpfung des DPP-Chromophors über eine Alkin-Brücke mit vielen Halogenaryl-Verbindungen unter sehr milden Bedingungen. 4.2. Die Alkinyl substituierten Pyrrolopyrrole zeigen große Stokes-Shifts bei mäßigen bis sehr guten Fluoreszenzquantenausbeuten (52-92%). 74 weist mit 81 nm den größten Stokes-Shift aller für diese Arbeit hergestellten und auch aller literaturbekannten Pyrrolopyrrol-1,4-dione auf. 4.3. Die über verschieden lange Alkin-Brücken verknüpften Dichromophore 64 und 70 zeichnen sich durch große langwellige Verschiebung der Absorption und der Emission gegenüber dem methylierten DPP-Grundkörper 24 aus. 4.4. Unter dem Aspekt der verminderten Aggregations- und Kristallisationsneigung wird der Tetraphenylmethan-Rest mit dem Pyrrolopyrrol-Chromophor verknüpft. Während das symmetrisch aufgebaute vierfach DPP substituierte Tetraphenylmethan 81 gut kristallisiert, zeigt die einfach DPP substituierte Verbindung 80 die erwartete schlechte Kristallisation. 4.5. Es wurde eine Zweischicht-OLED mit 59 als Emitter gebaut, die eine intensive orangefarbene Emission aufweist. 5. Durch die Palladium-katalysierte Aminierung nach Buchwald und Hartwig können verschiedene aliphatische und aromatische Amine mit dem Pyrrolopyrrol-1,4-dion- Chromophor verknüpft werden. Als effektivstes Katalysator/Basen-System erweist sich Pd2(dba)3/P(t-Bu)3 und Kaliumphosphat. 5.1. Die Cyclovoltammogramme der Verbindungen 83, 85 und 86 zeigen, dass diese Amine im selben Bereich oxidiert werden wie die im OLED-Bereich häufig verwendeten Lochleiter NPD und β-TPD. Die Reduzierbarkeit liegt in einem Bereich, der den Einsatz einer Aluminium- statt einer empfindlichen Calciumkathode in OLEDs möglich erscheinen lässt. 5.2. Aufgrund der Donorstärke der Aminsubstituenten weisen die Amine 83-87 in der Absorption und Emission große bathochrome Verschiebungen gegenüber dem methylierten DPP-Grundkörper 24 auf. 5.3. Mit 95% zeigt das zweifach Carbazol substituierte Pyrrolopyrrol 87 die höchste Fluoreszenzquantenausbeute aller für diese Arbeit hergestellten Verbindungen. 5.4. Die niedrige Fluoreszenzquantenausbeute des Phenothiazinyl substituierten Pyrrolopyrrols 85 von 12% in Chloroform, die im polareren Lösungsmittel Methylenchlorid auf 6% abnimmt, weist auf einen Photoelektronentransfer (PET) vom elektronenreichen Phenothiazin auf den Elektronenakzeptor Pyrrolopyrrol-1,4-dion hin. 5.5. Das aliphatisch substituierte Amin 86 wird in einem Essigsäure/2 N Schwefelsäure- Gemisch protoniert. Dadurch verschieben sich Absorption und Emission hypsochrom um ca. 40 nm. 5.6. 84 und 87 bilden in Essigsäure H-Aggregate aus. Darauf deuten die in Essigsäure um ca. 20 nm hypsochrom gegenüber den Messungen in Chloroform verschobenen Absorptionswellenlängen bei unveränderter Fluoreszenz hin. Die in Essigsäure unveränderte Fluoreszenz kann durch die Emission isolierter Einzelmoleküle erklärt werden. H-aggregierte Moleküle zeigen keine Fluoreszenz. 6. Unter den Bedingungen der Suzuki-Reaktion kann das Dichlor substituierte 1,4- Dimethylaminopyrrolopyrrol 94 mit Arylboronsäuren zu den Aryl substituierten Dimethylaminopyrrolopyrrolen 99-104 umgesetzt werden. 6.1. Die unterschiedlichen Absorptions- und Emissionseigenschaften von 99-104 können durch den Donor/Akzeptor-Einfluss der Arylreste auf die Grenzorbitale des Dimethylaminopyrrolopyrrols nicht vollständig erklärt werden. Erst durch die Berücksichtigung der Verdrillung der Arylreste gegenüber dem Pyrrolopyrrol-Chromophor (aus AM1- optimierten Strukturberechnungen) können die spektroskopischen Daten gedeutet werden. 7. Phenylacetylen und TMS-Acetylen reagieren unter Palladium-Katalyse in Gegenwart von Kupfer(I)iodid und Triethylamin zu den Alkinyl substituierten Dimethylaminopyrrolopyrrolen 105 und 106 (Sonogashira-Reaktion). 7.1. Die geringen Stokes-Shifts von 105 und 106 können auf die – nach AM1-Rechung – planare Geometrie dieser Verbindungen im Grundzustand zurückgeführt werden.

Das Kraftmikroskop hat sich in vieler Hinsicht als effizientes Gerät für Untersuchungen und Manipulationen auf molekularer Ebene erwiesen. Dabei wird selbst unter physiologischen Bedingungen eine Auflösung erreicht, die Proteinsubstrukturen erkennen läßt. Als Kraftspektroskop kann es mechanische Eigenschaften wie Dehnungsverhalten und Reißfestigkeit einzelner Moleküle, die zwischen der Sensorfeder und der Unterlage eingespannt werden, untersuchen. Sogar die Bindungskräfte zwischen einem Molekül am Kraftsensor und einem anderen am Substrat können mittels Kraftspektroskopie mit etwa 3 pN Genauigkeit ermittelt werden. Von besonderem Interesse solcher Untersuchungen sind Moleküle mit spezifischer Affinität nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip, wie Rezeptor-Ligand- Systeme und Adhäsionsmoleküle. Bisher waren hauptsächlich wasserlösliche Moleküle solchen Messungen zugänglich. Bindungen zwischen amphiphilen Proteinen oder Membranproteinen zu messen, die durch hydrophobe Wechselwirkungen in der Membran verankert sind, erfordert neue Konzepte. Diesen Molekülen gilt das Augenmerk dieser Arbeit. Da die Verankerung in sogenanten „supported bi-layern“ und Vesikeln nicht immer zum gewünschten Erfolg führt, wird hier eine ungewöhnliche, aber sehr natürliche Alternative vorgestellt: Das Adhäsionsmolekül wird nicht aufwendig isoliert und der Meßmethode zugänglich gemacht, sondern bleibt in seiner natürlichen Umgebung, der Zelle, wohingegen die Methode angepasst wird. Dies ist durch die Befestigung einer Zelle am Kraftsensor eines Kraftspektroskopes geglückt und es gelang damit erstmals die Adhäsionskraft eines einzelnen Adhäsionsmoleküls in einer lebenden Zelle zu messen. So einfach diese Methode beschrieben ist, so viele Unwägbarkeiten treten dabei durch die hohe Komplexität der Zelle und der Zelloberfläche im Besonderen auf. Daher wird einleitend eine grobe Einführung in die Funktionen und den Aufbau einer Zelle und die üblichen Meßmethoden im Bereich der Zelladhäsionsmessung vorgestellt. Die Beschreibung der Meßmethode und der Umrüstung des Kraftmikroskopes zum Zelladhäsionskraftspektroskop sind durch technische Details im Anhang vervollständigt. Etwas aufwendig ist die Zusammenstellung der Daten, Theorien und Annahmen zum Aufbau eines semi-empirischen Modells zur Beschreibung der Adhäsionskraftmeßkurven beim Trennen adhärierender Zellen, auf der Basis vieler unabhängiger Einzelmolekülbindungen. Mit dem Zelladhäsionkraftspektroskop wurden dafür die Youngs-Moduli und die viskoelastischen Kelvin-Modell-Parameter verschiedener Zellen in dem eigens entwickelten „visko-elastic-response-mode“ vermessen. Ebenso wurden die Einflüsse der Zellkontaktkraft und der Kontaktzeit, sowie der Zuggeschwindigkeit auf die Zelladhäsionsantwort studiert und in Formeln gefaßt. Das Modell simuliert diese Meßdaten in guter Übereinstimmung und gibt dadurch einen Einblick in die physikalischen Randbedingungen für das einzelne Adhäsionsmolekül während solcher Experimente unter Berücksichtigung des zelltypischen Phänomens der Tetherbildung. Insbesondere kann damit die Bindungsdichte bei Adhäsionen auf verschiedenen Oberflächen berechnet werden. Demnach schließt eine Epithelzelle etwa vier Bindungen pro Quadratmikrometer mit einer Glasoberfläche, zwei mit einer anderen Epithelzelle und nur 0,8 mit einer passivierten Oberfläche. Mit kraftspektroskopischen Messungen der Adhäsionskräfte bei der Einnistung eines Trophoblasten in die Gebärmutter an einem naturnahen Laborsystem kann eine andersartige - mit dem Modell unabhängiger Bindungen nicht beschreibbare - Wechselwirkung identifiziert werden. Die Meßergebnisse deuten auf einen kooperativen Prozeß der molekularen Adhäsionsinselbildung hin. Kontrollmessungen an funktionalisierten Oberflächen erhärten diese Hypothese. Mit ersten Ergebnissen von Adhäsionsmessungen zwischen Knochenzellen und potentiellen Implantatoberflächen wird neben dem Einfluß der Oberflächenbeschaffenheit auch der des Meßmediums nachweisbar, wodurch die Generalität dieser Methode verdeutlicht wird. Im letzten Kapitel über die Interaktionen einzelner Zellen wird anhand der induzierten Lektinwechselwirkung zwischen roten Blutkörperchen die prinzipielle Möglichkeit der Zelladhäsionskraftspektroskopie Einzelmolekülereignisse zu vermessen nachgewiesen. Die dafür nötigen geringsten Kontaktkräfte von unter 40 pN, konnten durch extrem weiche Kraftsensoren (

In dieser Arbeit wurde die in den letzten Jahren entwickelte Technik der auf dem Kraftmikroskop basierenden Einzelmolekül-Kraftspektroskopie auf zwei spezielle Systeme angewendet: Poly(ethylen Glycol) (PEG) und das Membranprotein Bakteriorhodopsin. Im Vordergrund stand dabei die Analyse der mechanischen Stabilität von Sekundärstrukturen. PEG ist aufgrund seiner ungewöhnlich hohen Wasserlöslichkeit eines der wichtigsten Polymere mit einer Vielzahl von technischen Anwendungen. Es wurden Messungen zur Elastizität einzelner PEG in Abhängigkeit des Lösungsmittels durchgeführt. Mit diesen Messungen konnte der genaue molekulare Mechanismus nachvollzogen werden, der zu der hohen Wasserlöslichkeit führt. Zudem konnte gezeigt werden, wie mit einem einfachen Modell neben Konformationsänderungen auch Konformationsenergien des Polymers quantitativ bestimmt werden können. Die Kraftspektroskopie als Instrument zur Untersuchung von mechanisch induzierten Strukturänderungen, z.B. der Proteinentfaltung, wurde bisher immer nur auf polymere Strukturen angewendet. Ziel der Messungen an Bakteriorhodopsin war es zu zeigen, dass sich diese Technik auch auf Moleküle anwenden lässt, die nicht aus sich wiederholenden Einheiten aufgebaut sind. Es konnte der genaue Entfaltungsweg von Bakteriorhodopsin mit all seinen stabilen Zwischenstrukturen bestimmt werden. Mechanismen der Stabilisierung wie die Nachbarschaft von Helices, hydrophobe Wechselwirkung und der Einfluss räumlicher Einschränkung konnten dabei in ihren Auswirkungen auf die Stabilität der Proteinstruktur beobachtet werden.

Im Rahmen dieser Arbeit werden Nanostrukturen aus biologischen Molekülen untersucht, sowie neue Methoden zur Strukturierung biologischer Systeme im nanoskaligen Bereich entwickelt und vorgestellt. Neben selbstorganisierten und enzymatischen Prozessen, wie sie bei der Strukturbildung biologischer Systeme eine wesentliche Rolle spielen, wird insbesondere auch eine neuartige Methode der gerichteten enzymatischen Hydrolyse biologischer Membranen, die eine gezielte Strukturierung im Nanometerbereich ermöglicht, vorgestellt. Vor dem Hintergrund, daß die Natur mit Polynucleinsäuren extrem vielseitige, universell einsetzbare und chemisch sowie molekularbiologisch sehr gut handhabbare molekulare Bausteine für den selbstorganisierten Aufbau hochintegrierter Nanoarchitekturen zur Verfügung stellt, werden ferner die grundlegenden Mechanismen und Kräfte der molekularen Erkennung bei der DNA-Basenpaarung sowie die mechanische Stabilität der DNA- Doppelhelix untersucht. - Durch kraftmikroskopische Untersuchungen an einer binären Mischung aus Dipalmitoyl- Phosphatidylcholin (DPPC) und Diarachidoyl-Phosphatidylcholin (DAPC) konnte erstmals die laterale Struktur von binären Lipidmischungen in Lipiddoppelschichten direkt bestimmt werden. Es konnte gezeigt werden, daß diese biologisch wichtigen Lipide in Lipiddoppelschichten spontan Domänen mit einer chrakteristischen Größe von etwa 10 nm bilden. Ein Vergleich der Ergebnisse der kraftmikroskopischen Untersuchungen mit denen von Neutronendiffraktionsexperimenten zeigte eine hervorragende Übereinstimmung der mit diesen beiden komplementären Techniken bestimmten mittleren Domänenabstände. - Untersuchungen des enzymatischen Abbaus von Lipidmembranen durch das lipolytische Enzym Phospholipase A2 (PLA2) erlaubten erstmals Einblicke in die Aktivität dieser Enzyme auf der Einzelmolekülebene. Es konnte gezeigt werden, daß die Enzymaktivität stark von den physikalischen Eigenschaften der Membran abhängig ist und daß Membranen in der Gel-Phase ausschließlich von Membrandefekten her und entlang der Hauptachsen des Molekülkristalls hydrolysiert werden, während die Hydrolyse flüssigkristalliner Membranen im wesentlichen isotrop verläuft. Die am freien Enzym gewonnenen Erkenntnisse konnten dann in einem nächsten Schritt zur Entwicklung einer neuartigen gerichteten Hydrolyse von Lipidmembranen genutzt werden, bei der mit der Spitze eines Rasterkraftmikroskops gezielt Defekte in kristallin gepackten Membranen induziert werden, und die Membranen dann durch das Enzym an Stellen mit diesen künstlichen Packungsdefekten hydrolysiert wird. Auf diese Weise konnten künstliche Strukturen in festkörpergestützten Membranen mit minimalen Strukturdurchmessern von bis zu 10 nm erzeugt werden. - Mit Hilfe von kraftspektroskopischen Untersuchungen an einzelnen DNA-Molekülen konnte erstmals ein neuartiger kraftinduzierter Schmelzübergang, der je nach Kraftladungsrate, Umgebungsbedingungen und DNA-Sequenz und Topologie zwischen einigen Piconewton (pN) und etwa 300 pN stattfindet, nachgewiesen werden. Durch Variation von Kraftladungsrate, Ionenstärke, Umgebungstemperatur und DNA-Sequenz konnte gezeigt werden, daß die mechanische Energie die unter Gleichgewichtsbedingungen bis zum kraftinduzierten Schmelzen in der DNA-Doppelhelix deponiert werden kann, hervorragend mit der freien Basenpaarungsenthalpie ∆Gbp der entsprechenden DNA- Sequenz unter den jeweiligen Umgebungsbedingungen übereinstimmt. Es konnte gezeigt werden, daß sich mit Hilfe der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Stabilität von DNA die thermodynamischen Größen ∆Hbp und ∆Sbp von DNA direkt aus Kraftexperimenten an einzelnen Molekülen bestimmen lassen. Schließlich konnten die Basenpaarungskräfte von DNA erstmals sequenzspezifisch bestimmt werden. Die zum reißverschlußartigen Aufbrechen einer GC-Basenpaarung nötigen Kräfte betragen demnach 20±3 pN, die zum Aufbrechen einer AT-Basenpaarung nötigen Kräfte 9±3 pN. Auch hier konnte eine sehr gute Übereinstimmung der zum Aufbrechen der Basenpaarungen nötigen mechanischen Energie mit der freien Basenpaarungsenthalpie ∆Gbp festgestellt werden.

Die spektroskopische Untersuchung einzelner Moleküle in kondensierter Phase erstreckt sich erst über einen Zeitraum von zehn Jahren. In dieser verhältnismäßig kurzen Zeit vollzog sich eine rasante Entwicklung mit einer Vielzahl von Ergebnissen. Dies findet seinen Ausdruck in eigenen Tagungen und Zeitschriften und nicht zuletzt auch in einer Nobelkonferenz im Jahre 1999. Während sich anfangs die Untersuchungen auf eine Reihe faszinierender Tieftemperaturexperimente mit spektraler Selektion der einzelnen Moleküle beschränkten, verschob sich seit Mitte der 90er Jahre der Schwerpunkt der Forschung auf diesem Gebiet hin zu Experimenten mit räumlicher Selektion bei Raumtemperatur, die seit kurzer Zeit auch relativ uneingeschränkt bei Tieftemperatur möglich sind. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in dieser Dissertation wider. Zu Beginn dieser Arbeit stand eine spektral hochauflösende Apparatur zur Einzelmolekülspektroskopie bei kryogenen Temperaturen zur Verfügung. Mit dieser wurden Einzelmoleküluntersuchungen an dem neu synthetisierten Farbstoff Terrylendiimid (TDI) durchgeführt. TDI ist kein reiner Kohlenwasserstoff, wie die bis dahin üblicherweise verwendeten Chromophore, und lässt sich durch seine Seitengruppen an andere Systeme anbinden. Er zeigt neben exzellenten Fluoreszenzeigenschaften die zur spektralen Selektion nötigen schmalen Absorptionslinien. Wegen seiner Struktur lässt sich TDI nicht in einen Kristall einlagern. Mit Polyethylen und Hexadecan wurden jedoch zwei Matrizen gefunden, die es erlauben, Fluoreszenzanregungsspektren von einzelnen Molekülen zu detektieren. In Hexadecan konnte bei Sättigungsuntersuchungen das theoretisch vorhergesagte Verhalten nachgewiesen werden. Dabei wurden Zählraten von fast 500 000 Counts pro Sekunde von einem einzelnen Molekül erreicht. Durch die Aufnahme und Auswertung der Fluoreszenzintensitäts-Autokorrelationsfunktion konnten die Populations- und Depopulationsraten der Triplett-Subniveaus bestimmt werden. Dabei wurde auch spektrale Diffusion der Moleküle beobachtet, die mit Hilfe von Two-Level Systems (TLS) erklärt werden konnte. Mit einem komplexen theoretischen Modell und aufwendigen numerischen Berechnungen konnte die bei 2,5 K auftretende Verteilung von Linienbreiten der beobachteten Moleküle simuliert werden. Damit konnte den beiden Matrizen über die Analyse ihrer TLS-Dichte ein unterschiedlicher Grad an Unordnung zugeordnet werden. In temperaturabhängigen Untersuchungen der Linienform konnte der Unterschied im Ordnungsgrad der Matrizen bestimmt werden. Ferner konnten die Theorie von Hsu und Skinner in der Tieftemperaturnäherung bestätigt werden und ein tieferer Einblick in die auftretende Dynamik gewonnen werden. In der Auswertung der temperaturabhängigen Linienverschiebung wurde erstmals der Einfluss von Matrixexpansion berücksichtigt und als unverzichtbar für eine gute Beschreibung des Systems erkannt. Parallel zu den ersten Experimenten wurde eine aktive Stabilisierung des Farbsto?asers aufgebaut. Damit konnte eine Verfälschung der Ergebnisse durch Laserdrift ausgeschlossen werden. Weitere Tieftemperaturuntersuchungen hatten die Beobachtung von Förster Energietransfer (oder FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) an einem individuellen Donor-Akzeptor-Paar in seiner speziellen Konformation zum Ziel. Als Farbstoffmolekül stand ein Bichromophor aus Perylen und kovalent angebundenem TDI zur Verfügung. Obwohl beide Chromophore sich für Einzelmoleküluntersuchungen eignen und inzwischen schon mehrfach verwendet wurden, gelang es nicht, ein bezüglich Linienbreite und Frequenzposition identisches Fluoreszenzanregungsspektrum sowohl über Perylen-Fluoreszenz als auch über TDI-Fluoreszenz (nach Energietransfer) zu detektieren. Der Energietransferprozess scheint mit einem Linienverbreiterungsmechanismus verknüpft zu sein, so dass eine Beobachtung mit dem Aufbau in der Anfangsphase der Dissertation nicht möglich war. Eine Wiederaufnahme dieser Untersuchungen mit der neuen Apparatur ist zukünftigen Doktoranden vorbehalten. Um allgemein temperaturabhängige Untersuchungen an fluoreszierenden Molekülen durchführen zu können, wurde ein Tieftemperaturmikroskop aufgebaut. Dafür wurde die Rastertechnik gewählt. Um die bekannten Probleme des Probenscannens im Kryostaten, wie kleiner Scanbereich und fehlender Zugang im abgekühlten Zustand, zu vermeiden, wurde ein konfokales Laserscanning-Mikroskop entworfen und aufgebaut. Zur Strahlablenkung wurden zwei Galvanometerspiegel gewählt und der Drehpunkt über ein telezentrisches System in das Objektiv abgebildet, das gemeinsam mit der Probe im Kryostaten sitzt. Die Detektion des Fluoreszenzlichts wird von einer hochempfindlichen Avalanche-Photodiode mit geringer Dunkelzählrate übernommen. Die Funktion des Scanners und des gesamten optischen Aufbaus konnte an Testmustern und Testproben erfolgreich demonstriert werden. Einschränkend muss jedoch erwähnt werden, dass die erreichte DetektionseŽzienz die Erwartungen nicht erfüllte. Das liegt im Wesentlichen am Objektiv, aber auch an den Abbildungsfehlern und Reflexionen der zahlreichen Elemente im Strahlengang. Die maximal erreichten Zählraten lagen bei 50 000 Counts pro Sekunde am System Terrylen in Polyethylen. Für Systeme mit einer ausreichend hohen Fluoreszenzrate ist es mit dieser Apparatur möglich, Fluoreszenzbilder, Zeitspuren, spektral hochauflösende Fluoreszenzanregungsspektren, Fluoreszenzspektren und Fluoreszenzkorrelationsfunktionen von einzelnen Molekülen aufzunehmen, um damit spektrale und dynamische Eigenschaften der Moleküle zu bestimmen. Durch Variation der Temperatur können die Temperaturabhängigkeit der Messgrößen und Barrierenhöhen ermittelt werden. Mit der neuen Apparatur wurden Untersuchungen in zwei neuen Themenbereichenbegonnen, nämlich an einzelnen Sondenmolekülen in Nanoporen und an den fluoreszierenden Proteinen GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) und PEC (Phycoerythrocyanin). Erste Fluoreszenzanregungsspektren einzelner Terrylen-Moleküle in den Kanalstrukturen von mesoporösen Systemen der M41S-Klasse konnten beobachtet werden. Dabei ist die hohe spektrale Auflösung von großem Vorteil bei der Untersuchung der spektralen Dynamik der Sondenmoleküle. Im Bereich biologischer Proben konnten einzelne Moleküle des Grün Fluoreszierenden Proteins isoliert beobachtet werden. Die Anzahl an Fluoreszenzphotonen pro Molekül, die vor dem ¨Ubergang in einen Dunkelzustand an diesem System detektiert werden konnten, war allerdings sehr gering. Deshalb wurden Untersuchungen an einzelnen Proteinen aus dem Lichtsammelkomplex von Cyanobakterien begonnen, die in einer laufenden Doktorarbeit von P. Zehetmayer fortgeführt werden. Bei den Proteinproben handelt sich um Untereinheiten von Phycoerythrocyanin: die ‹-Untereinheit und das Trimer bzw. Monomer, in denen offenkettige Tetrapyrrhol-Moleküle als Farbstoffe an die Proteinmatrix angebunden sind. Neben Fluoreszenzbildern und Zeitspuren konnten bereits Anregungsspektren detektiert werden, die starke spektrale Dynamik zeigen und weitere Untersuchungen herausfordern. Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden bereits in internationalen Zeitschriften und auf Tagungen veröffentlicht. Eine Übersicht befindet sich am Ende unter Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge.