Podcasts about magnetofektion

Sat, 30 Jul 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13785/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13785/1/Haas_Miriam_Sophia.pdf Haas, Miriam Sophia

Sat, 12 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12978/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12978/1/Hoeksma_Antje.pdf Hoeksma, Antje

Sat, 24 Jul 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14771/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14771/1/Walsch_Florian.pdf Walsch, Florian Markus

In der vorliegenden Arbeit wurden A549 Zellen, als Modell für Epithelzellen der Lunge, mittels nicht-viralen Gentransfers mit pDNA bzw. mRNA kodierend für das sekretorische Protein mSEAP transfiziert. Die höchste Transgen-Expression konnte durch den mRNA-vermittelten Gentransfer erreicht werden, unabhängig von dem verwendeten Genvektor. Die Messung der Aktivität von mSEAP im Medium nach mRNA Transfektion mit Liposomen ergab eine Konzentration von maximal 1 ng/50 µl nach 24h, 5 ng/50 µl nach 48h und 7,5 ng/50 µl nach 72h. Für die pDNA Transfektion ergaben sich Konzentrationen für mSEAP von 400 pg/50µl nach 24 h, 700 pg/50 µl nach 48 h und 800pg/50 µl nach 72 h. Es konnte gezeigt werden, dass es bei der Verwendung von mRNA - vor allem nach Transfektion mit dem kationischen Lipid DMRIE-C - zu einer 9-fachen Steigerung der Proteinsekretion in das Medium der kultivierten Zellen kommt. Weiterhin waren ca. 45% der Zellen bei Verwendung von Lipoplexen mit DMRIE-C/mRNA im Gegensatz zu 15% nach Transfektion von pDNA positiv für mSEAP. Nach Transfektion der mRNA mit dem kationische Polymer b-PEI konnten Konzentrationen von mSEAP im Medium von 10pg, 15pg und 50pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h gemessen werden. Für die Magnetofektion von mRNA ergeben sich Mengen von ca. 150pg, 250pg und 400pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h. Dies entspricht im Vergleich zur Verwendung von pDNA einer 3,3-fachen Steigerung nach Transfektion von mRNA/b-PEI Komplexen, mit der Methode der Magnetofektion einer 4-fachen Steigerung der Proteinexpression. Die erhöhte Proteinexpression kann auf die intrazelluläre Barriere des nukleären Imports von pDNA, welche bei der Verwendung von mRNA nicht notwendig ist, zurückgeführt werden. Die Unterschiede des endosomalen „Escape“ - und dem daraus resultierenden Verhältnis freier mRNA zu komplexierter mRNA im Zytoplasma - könnte eine Erklärung für die geringere Effizienz von Polyethyleniminen im Vergleich zu kationischen Lipiden bei dem Transfer von mRNA sein. Weiterhin konnte mit diesem Modell gezeigt werden, dass humane alveolare Epithelzellen des Adenokarzinoms (A549) - als Modell für humane Lungenepithelzellen - imstande sind, zellfremde Proteine nach Transfer genetischen Materials zu translatieren und zu sezernieren. Eine pulmonale Applikation von therapeutischen Genen kodierend für sekretorische Proteine mittels Vernebelung könnte als nicht-invasive Methode z.B. für die Therapie von Hämophilie A oder B eine Rolle spielen. Weiterführende in vivo Versuche könnten Aufschluss über Serumkonzentrationen des sekretorischen Proteins nach pulmonaler Applikation bringen. Die Verwendung von mRNA als therapeutischem genetischem Material zeigt hierbei Vorteile gegenüber von pDNA, aufgrund der gesteigerten Transgen -Expression, der verminderten Dosis an Transferreagenz, sowie dem fast gänzlich ausgeschlossenen Risiko der insertionellen Mutagenese.

Trotz verbesserter Therapiemöglichkeiten ist die Prognose beim Fibrosarkom der Katze noch immer ungünstig. In der vorliegenden Arbeit sollte die Verträglichkeit eines neuen Therapieansatzes zur Behandlung des felinen Fibrosarkoms untersucht werden. Verwendet wurde ein nonviraler Gentransfer mittels Magnetofektion, um eine Transfektion mit dem felinen Zytokingen GM-CSF zu erreichen. Ziel der durchgeführten Phase-I-Studie war die Festlegung einer maximalen tolerierten Dosis. In die prospektive Dosis-Eskalations-Studie wurden Katzen, die definierte Einschlusskriterien erfüllten, aufgenommen. Die Steigerung der Dosis des Plasmids, das für feGM-CSF kodiert, erfolgte in vier festgelegten Schritten (50, 250, 750 und 1250 µg Plasmid). Jeweils vier Katzen wurden in eine Dosisgruppe aufgenommen. Die Plasmide wurden in wässriger Lösung in einem 1:1-Verhältnis mit magnetischen Nanopartikeln gemischt, die zur besseren Bindung an die DNA mit Polyethylenimin beschichtet waren. Die Plasmidlösung mit einem Volumen von 500 µl wurde intratumoral injiziert. Danach wurde durch Applikation eines Neodymium-Eisen-Bor-Magneten auf das Tumorgebiet ein Magnetfeld für die Dauer einer Stunde angelegt. Durch diese Magnetofektion wurde die Transfektion auf das Tumorgebiet beschränkt, sowie die Effektivität des Gentransfers verbessert. Das Behandlungsprotokoll umfasste zwei intratumorale Injektionen an den Tagen -14 und -7 sowie die großräumige en-bloc-Resektion des Fibrosarkoms an Tag 1. Eine Kontrollgruppe bestehend aus vier Katzen wurde ohne Zusatztherapie einer Operation unterzogen. Aus ethischen Gründen wurde dabei auf eine Verzögerung der chirurgischen Entfernung durch Placebo-Applikationen im Zeitraum von 14 Tagen verzichtet. Eine Untersuchung auf mögliche auftretende Toxizitäten erfolgte an den Tagen -7, 0, 14, 45, 90 und 180. Zwei weitere Untersuchungen an den Tagen 270 und 360 dienten zur Kontrolle auf Rezidiv- und Metastasenbildung. Aufgetretene klinische oder hämatologische Toxizitäten wurden anhand eines speziellen Nebenwirkungskatalogs (VCOG-CTCAE-Tabelle) erfasst und in Korrelation zur durchgeführten Therapie gestellt, um über eine Zuordnung als Nebenwirkung entscheiden zu können. Ein statistischer Vergleich erfolgte für die Parameter Körpergewicht, Leukozytenzahl und das Differentialblutbild zwischen Kontrollkatzen, behandelten Katzen und den Katzen der verschiedenen Dosisgruppen. Sieben weitere Katzen wurden mit derselben Gentherapie mit humanem GM-CSF behandelt, bei denen der Expressionsachweis von huGM-CSF mittels ELISA in den Zellkulturüberständen der angezüchteten Tumore gelang. In den ersten drei Dosisgruppen traten keine schwerwiegenden Nebenwirkungen auf. Da bei drei der vier Katzen der höchsten Dosis leichte Nebenwirkungen beobachtet wurden, wurden zwei weitere Katzen mit der höchsten Dosis behandelt. Dabei traten jedoch keine Toxizitäten auf, so dass die Dosis von 1250 µg für feGM-CSF kodierendes Plasmid als sichere, gut verträgliche Dosis für nachfolgende Phase-II-Studien festgelegt werden konnte. Auch die beobachteten Ergebnisse bezüglich Rezidivrate sind als sehr viel versprechend einzustufen.

The prognosis for cats with fibrosarcoma is still poor as the treatment options existing to date do not lead to satisfying results. After sole surgical removal of the tumor, up to 70 % of the cats develop local recurrences. Even with adjuvant radiation and/or chemotherapy, the recurrence rate can just be reduced to at most 40 %. In the present work an alternative treatment method in terms of neoadjuvant immunostimulatory gene therapy should be established. Via plasmids, three feline cytokine genes were transferred into the tumor. The plasmids coded for feIL-2, feIFN-γ and feGM-CSF. Using magnetofection, gene transfer should be optimized. The aim of this clinical dose escalation study was to define a well tolerated dose, which can be tested for its efficacy in a subsequent phase-II trial. Therefore the cats were examined at defined time points for treatment-related toxicity up to 180 days after surgery. Two more check-ups on day 270 and 360 after surgery were performed to elongate the observation period for local recurrences. Prerequisite for a cat’s admission to the study was the localization of the fibrosarcoma (primary tumor or recurrence) on the trunk. The tumor had to be excised in one setting without limb amputation. Affected cats were neither allowed to be pretreated with chemo-, radiation- or gene therapy nor with corticosteroids within the past six weeks. Further exclusion criteria were hints for metastases or other severe illnesses which reduce life expectancy to less than one year. Due to the potential teratogenic effect of the expressed cytokines, pregnancy had to be ruled out. Only cats with histopathologically confirmed fibrosarcoma continued the study after surgery. As this was a scientific study with a drug not registered yet, written informed consent from the owners was a prerequisite for the participation of each cat. Four treatment groups with defined dose escalation were prospectively fixed. The dose of the feline cytokines was 15, 50, 150 and 450 µg per plasmid in group I, II, III and IV. The initial dose (3 x 15 µg) was oriented to the total dose for small oral melanomas in dogs (400 µg) established by DOW et al. and is 1/10 of it. Plasmids as non-viral vectors were chosen for several reasons. Their handling is not liable to such strict regulations as the potentially more dangerous viral vectors. Their production is simple and affordable. They induce fewer side effects than viral vectors. Therefore plasmids are more suitable for application in veterinary clinical practice. Equal amounts of the plasmids were brought into 0.9 % saline. The positively charged magnetic nanoparticles were brought into solution with aqua for injections and were mixed with the plasmid formulation in a 1:1 ratio. This formulation had a total volume of 500 µl and was injected twice intratumorally in weekly intervals. Transfection was enhanced and targeted to the tumor area by the application of a neodymium-iron-boron magnet for the duration of 60 minutes. One week after the second application, wide en-bloc resection of the tumor was performed. Four cats were assigned to each treatment group. As questionable toxicity occured in group IV, four more cats were added to this group. A control group also consisting of four cats received surgery without neoadjuvant therapy. For ethical reasons, the application of empty plasmids was avoided so that in this group surgery could be performed without delay. Medical care of all the cats was carried out by the same team of internists, anesthetists and surgeons. Clinical and laboratory parameters were evaluated according to the VCOG-CTCAE system. All adverse events were registered, classified with severity grades and correlated to treatment. Plasma samples of all cats up to 14 days after surgery were examined for the existence of feGM-CSF and feIFN-γ with commercially available ELISA kits. Statistical analyses were performed comparing the treatment groups themselves as well as treatment groups and the control group regarding body weight, white blood cells and differential blood counts. Only one cat out of group IV showed adverse events during the neoadjuvant treatment period, which were classified as grade 3 and which were probably correlated to treatment (correlation grade 4). For this reason four more cats were treated with the highest dose. None of these cats showed side effects that could be correlate to treatment. The occurrence of early recurrences in four cats of group IV was outstanding, but of course, the expressiveness of this statement is low regarding the small group sizes. However it is known that biological drugs, especially IL-2, often do not have a linear dose-response profile. Therefore the optimal effective dose lies within a strictly defined area and is probably lower than the maximal tolerated dose. The highest applied dose which is 450 µg per plasmid was defined as a well tolerated dose. It can be safely tested for its efficacy in a subsequent phase-II trial. Because of the reflections mentioned above it would undoubtedly be convenient to test the third dose (150 µg per plasmid) in parallel for its effectiveness.

Besonders Zytostatika-vielfachresistente Tumorzellen stellen bei der Chemotherapie ein großes Problem dar. Mit der Entwicklung der Gentherapie ergibt sich eine neue erfolgversprechende Perspektive für die Bekämpfung von malignen Tumorerkrankungen. Sehr viel versprechend ist die Entdeckung von E1A-deletierten Adenoviren, die in vielfachresistenten Tumorzellen, welche häufig den humanen Transkriptionsfaktor YB-1 im Kern enthalten, eine E1A-unabhängige adenovirale Replikation und virale Tumorzelllyse durchführen können. In der vorliegenden Arbeit sollte durch den Einsatz einer in der Gentherapie erst neuen Technologie - der Magnetofektion - eine gezielte lokoregionäre Applikation dieser onkolytischen adenoviralen Vektoren in die vielfachresisten Tumorzellen erreicht werden. Bei der Magnetofektion werden die adenoviralen Vektoren durch elektrostatische Wechselwirkungen an nanokristalline Eisenoxidpartikel gebunden und mit Hilfe eines externen magnetischen Feldes in den Zielzellen angereichert. Die Studien wurden in der Zellkultur an vielfachresistenten und nicht resistenten Tumorzellen durchgeführt. Zur Feststellung der zielgerichteten adenoviralen Infektion wurde das Reportergen LacZ eingesetzt; mit Hilfe der x-Gal Färbung konnte durch Blaufärbung der infizierten Zellen nachgewiesen werden, dass im Einflussgebiet des Magnetfeldes eine effiziente Infektion stattgefunden hat, sowohl in CAR-positiven wie auch in CAR-negativen vielfachresisten Tumorzellen. Um den Grad der adenoviralen Replikation abschätzen zu können, wurden Southern-Blot-Analysen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass E1A-deletierte adenovirale Vektoren in den vielfachresistenten Tumorzellen eine sehr effiziente E1A-unabhängige Replikation durchführen können. Weiterhin konnte der Nachweis der adenoviralen Replikation und der darauf folgenden Tumorzelllyse anhand des Virus-assoziierten cytopathogenen Effektes in den vielfachresistenten Tumorzellen mit der Kristallviolettfärbung erbracht werden. Die adenovirale Replikation und Partikelzahlbildung in vielfachresistenten Tumorzellen konnte anhand eines Plaque-Assay bestimmt werden. Dazu wurden E1A-deletierte Adenoviren nach Infektion von resistenten und nicht resistenten Tumorzellen getrennt aus dem Einflussbereich und außerhalb des Einflussbereiches des Magnetfeldes isoliert. Es zeigte sich, dass die adenovirale Replikation/Partikelbildung im Wirkungsbereich des Magneten deutlich erhöht war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass durch die Magnetofektion eine zielgerichtete adenovirale Infektion und eine Erhöhung der Transfereffizienz im Wirkungsbereich des Magnetfeldes erreicht werden kann. Somit können E1A-deletierte Adenoviren im Einflussgebiet des Magneten vielfachresistente Tumorzellen, die YB-1 im Kern enthalten sehr effizient infizieren und eine gezielte Tumorzelllyse durchführen.

In den vergangenen zehn Jahren wurden große Fortschritte hinsichtlich einer möglichen Gentherapie angeborener Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose oder a1-Antitrypsinmangel erzielt. Dabei spielt die Gentherapie mittels nichtviraler Genvektoren zunehmend eine größere Rolle. Doch trotz ermutigender Ergebnisse aus einer Reihe von klinischen Studien ist die Effizienz des nichtviralen Gentransfers über eine topische Applikation in die Atemwege bis heute zu gering. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, welchen Wechselwirkungen nichtvirale Genvektorkomplexe im Milieu der Atemwege unterliegen. Dabei konnten Veränderungen der inneren Struktur nichtviraler Genvektorkomplexe unter Einfluss von Surfactant bzw. bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit mit Hilfe von Fluoreszenz-Quenching-Assays und Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) nachgewiesen werden. Auch die Oberflächenladung der kationischen Genvektorkomplexe wurde beeinflusst, wobei in Anwesenheit hoher Konzentrationen von Surfactant eine Ladungsumkehr hin zu negativen Werten gemessen wurde. In Bezug auf die äußere Struktur der kationischen Genvektorkomplexe konnte gezeigt werden, dass in Anwesenheit von Surfactant bei Lipoplexen eine starke Zunahme der Größe beobachtet wurde, während die Größe von Polyplexen sogar leicht abnahm. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass die An- oder Abwesenheit von Salz in physiologischen Konzentrationen bei der Herstellung der Genvektorkomplexe einen Einfluss hat auf die Interaktion von Surfactant mit den Genvektorkomplexen. Um zu ermitteln, inwieweit die Veränderung biophysikalischer Parameter die Funktion der Genvektorkomplexe beeinflusst, wurden das Adhäsionsverhalten der Genvektorkomplexe an der Zelloberfläche und ihre Transfektionseffizienz untersucht. Auch hier waren die Folgen der Interaktion mit Surfactant sehr unterschiedlich ausgeprägt, je nach dem, ob kationische Liposomen oder kationische Polymere als Genvektorsystem verwendet wurden. Um die Effizienz des nichtviralen Gentransfers in die Lunge zu erhöhen, gibt es eine Reihe unterschiedlicher Ansätze. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Anwendbarkeit der Magnetofektion auf die Transfektion von Atemwegsepithelien untersucht. Die Magnetofektion beruht auf dem Prinzip der Anreicherung von Genvektorkomplexen am Zielgewebe mit Hilfe magnetischer Anziehungskräfte. Es konnte eine deutlich bessere Dosis-Wirkungs-Beziehung der über kationische Polymere vermittelten Magnetofektion verglichen mit dem konventionellen über kationische Polymere vermittelten Gentransfer nachgewiesen werden. Hierfür waren sowohl eine stärkere als auch eine schnellere Anreicherung der Genvektorkomplexe an der Zelloberfläche verantwortlich. Die Effizienz der Magnetofektion war bei gegebener Inkubationszeit der Transfektionseffizienz konventioneller nichtviraler Gentransfersysteme deutlich überlegen. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte eine Aufnahme der Genvektorkomplexe in Zellen intakter Atemwegsepithelien mit Hilfe der Magnetofektion nachgewiesen werden.