Podcasts about alanin

Inhaltsstoffe, Einnahmeempfehlung, Dosierung und Effekte auf unsere Gesundheit - in diesem DEEP DIVE beantworten wir die wichtigsten Fragen zu Kollagen: Welche wichtige Rolle spielt es in unserem Körper? Wie wirkt sich Kollagen auf unsere Haut aus? Für wen ist das Supplementieren von Kollagen geeignet und in welchen Situationen oder Lebensphasen sollte ich es einnehmen? Und wir machen den Quick Check: Gibt es etwas zu beachten bei der Kombination von Kollagen mit anderen Supplements? Kann ich Kollagen überdosieren? Ist die Einnahme für Schwangere, Kinder oder Menschen mit Vorerkrankungen bedenkenlos? Und was sind die wichtigsten Qualitätskriterien? Antworten in diesem DEEP DIVE: Kollagen. -- artgerecht Kollagen hier direkt bestellen: https://bit.ly/4jyu8ih -- Spare als Neukunde 15% mit dem Code: HEALTHNERDS15 (im Warenkorb eingeben) -- Zutaten: Glycin, Prolin, Glutaminsäure, Hydroxyprolin, Arginin, Alanin, Asparaginsäure, Lysin -- Ein ALL EARS ON YOU Original Podcast.

I denna podcast pratar vi om beta-alanin, en aminosyra som bevisats kunna öka ens prestation signifikant. Vi diskuterar dess mekanismer, användning, säkerhet och effekter på träning med dietisten och bänkpressmästarinnan Malin Björklund. Lyssna på avsnittet för att lära dig mer om hur du ska göra för att maximera effekten av ditt intag av beta-alanin. Läs Malins artikel om beta-alanin på Certan ➡️ https://certan.se/blogg/sa-funkar-beta-alanin/ Se alla artiklar skrivna av Malin ➡️ https://certan.se/blogg/author/malin-bjorklund/ Följ Malin på Instagram ➡️ https://www.instagram.com/malinxb/ Kapitel (0:00)-Vi välkomnar dietisten Malin Björklund och pratar om elitidrott (5:43)-Vad är beta-alanin och karnosin (10:38)-Vad fyller beta-alanin för funktion och när kan man använda det? (18:03)-Att bygga upp sina beta-alanin-depåer över tid för maximal effekt (20:55)-Beta-alanin och stickningar i huden (27:22)-Varför inte bara ta karnosin? (28:24)-När ska man ta beta-alanin? (32:59)-Är det farligt att ta beta-alanin? (36:58)-Vid vilken träning kan beta-alanin vara fördelaktigt? (42:27)-Avslutning Följ oss även i andra kanaler! ⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://www.instagram.com/certan.se/⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠ ⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://www.tiktok.com/@certan.se⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠ ⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://www.facebook.com/certan.se/⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠ ⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://twitter.com/certan_se/

Join us on a journey of contemplation and enlightenment in this captivating introduction to Taoism.Discover the profound wisdom of Taoist philosophy with Alan Watts as he invites us to embrace the course of nature. Through insightful exploration, he delves into the timeless significance of Yin and Yang, illustrating their inseparable connection and guiding us toward a deeper understanding of harmony and balance in existence.Today's podcast is sponsored by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode, Alan Watts speaks about:Ancient Chinese philosophiesHow social institutions are mistaken for the real worldThe self, Confucianism, and the roles we play in lifeTaoism and the basic energy of the universeTao as the force of natureHow space and solid are two facets of one realityYang and Yin, positive and negative, male and femaleConscious dying and preparing to let goActing in accordance with natureThis series is brought to you by the Alan Watts Organization and Ram Dass' Love Serve Remember Foundation. Visit Alanwatts.org for full talks from Alan Watts.“It is the inner connection, or rather the inseparability of Yang and Yin, which is what is meant by Tao. That's why Tao cannot be explained. The reason again if I may put it in another way is that all thinking is classification. It's asking ‘is you is or is you aint'. Is it this or is it that. After all, if you want to say something is inside it requires an outside. You can't have an inside without an outside or an outside without an inside.” – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

In celebration of the waters that bring life to all things, Alan Watts reflects on the separation between human civilization and the natural world.This series is brought to you by the Alan Watts Organization and Ram Dass' Love Serve Remember Foundation. Visit play.alanwatts.org for full talks from Alan Watts.Today's podcast is sponsored by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this unique and experimental recording, Alan Watts discusses:The beauty of life on the waters in Sausalito, CaliforniaThe rhythms of natureTime and timelessnessThe transformation of one form into anotherThe separation of man from the natural worldObjecting and Objectifying the worldIdentity and being able to know knowingThe spacious environment of the ocean“Although the rhythm of the waves beats a kind of time, it's not clock or calendar time, it has no urgency. It's timeless time, because I know I am listening to a rhythm which has been just the same for millions of years.” – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

Bringing awareness to ecstatic grace, Alan Watts enlightens us on the sexual archetypes formed by religion.Two cultural icons. Two unique perspectives... One understanding of the presence of the way.Ram Dass' Love Serve Remember Foundation and the Alan Watts Organization invite you to open your mind, open your heart, and tap into the living truth of Alan Watts and Ram Dass. Learn more about this special 4-week Virtual Course:"The Presence of the Way: The Dharma of Alan Watts and Ram Dass" Today's podcast is sponsored by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this recording, Alan Watts lectures on:Baptism, confirmation, and religious initiationMasturbation and other supposedly sinful behaviorsDefiance and wickednessThe material world and sexualityThe Semitic vs. Greek perspective on sexSexual energy for reproduction rather than pleasureThe fall in the Garden of EdenThe institution of marriageWomen throughout western literatureLove and the illogical promises we makePrudism and extreme monogamySubtle eroticism in the Victorian eraHow repression may lead to being overcameLibido as a fundamental realitySexuality in religious iconographyThe function of sexual play beyond utilitarianismSex as a sacramental expression of loveSeeing the divine aspect in a loverThis series is brought to you by the Alan Watts Organization and Ram Dass' Love Serve Remember Foundation. Visit Alanwatts.org for full talks from Alan Watts.“The function of sexual play is not merely the survival and utilitarian function of reproducing the species as it is among animals to a very large extent. What peculiarly distinguishes human sexuality is that it brings the partners closer and closer to each other in an intense state of united feeling. In other words, it is a sacrament, the outward invisible sign of an inward and spiritual grace, bringing about love.” – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

This time on the Being in the Way Podcast, Alan Watts delves into questions of identity, purpose and buying into the ‘Myth of Myself'.Today's podcast is sponsored by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode, Alan Watts explores:The question of our own identity and our place in the worldMyths of the self handed down through historyViewing ourselves and the world with a “floodlight consciousness” – rather than the narrow “spotlight consciousness” we are taught to see the world throughHow we are not born into this world, but grow out of it – “In the same way an apple tree apples, the Earth peoples.”“The most fascinating problem in the world is who am I? What do you feel when you say the word I? I myself?This problem has fascinated me for many years. Most Western people locate their ego inside their heads. This is the ordinary average conception of what is oneself.” – Alan WattsThis series is brought to you by the Alan Watts Organization and Ram Dass' Love Serve Remember Foundation. Visit https://Alanwatts.org for full talks from Alan Watts.See Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

Genereller Nutzen? Für welche Sportler? In welcher Dosis? Der Artikel: https://fitnessrevolutionaere.de/die-nahrungsergaenzungsmittel-beta-alanin-und-natriumbicarbonat-auf-dem-pruefstand/ Weiteres: Fitnessrevolutionäre Maximilian Breboeck Bücher für die Sportfamilie Du möchtest deinen Podcast auch kostenlos hosten und damit Geld verdienen? Dann schaue auf www.kostenlos-hosten.de und informiere dich. Dort erhältst du alle Informationen zu unseren kostenlosen Podcast-Hosting-Angeboten. kostenlos-hosten.de ist ein Produkt der Podcastbude.Gern unterstützen wir dich bei deiner Podcast-Produktion.

Bei intensiver Aktivität übersäuern unsere Muskeln vorübergehend, was zur Ermüdung beiträgt. Nahrungsergänzungsmittel wie Beta-Alanin oder Natriumbikarbonat wirken diesem Effekt entgegen und können unsere sportliche Leistung leicht verbessern. In der heutigen Episode schauen wir uns beide näher an.

Delving into the historically complicated human relationship to divinity, Alan Watts describes the trap of separateness. Today's podcast is sponsored by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode, Alan Watts explores:The sensation of our own existence Jewish Christian mythology Identifying with the tribeUniversal law and the roots of justiceFreud and the energies of the psyche Man as a product of nature versus the supernaturalThe idea that we were all subjects of a divine king you might say was a political model based on the organization of the great city-states of the ancient near east. That image, you see, has absolutely haunted Western man throughout his whole development because he has felt that he is in the universe on probation and sufferance. He doesn't quite belong here." – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

Offering us the possibility of waking up, Alan Watts contemplates the joyous cosmology that we are God playing the roles of ordinary people.Today's podcast is sponsored by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode, Alan Watts explores:If there could be a theory of the world that justifies and makes worthwhile the difficulties and suffering that we undergoThe contemplation that an infinite omnipotent being would eventually get bored with being everything, so would begin to shield itself from this knowledge, and pretend to play the role of separate beings so it could experience the full thrill of waking up to itselfThe idea of reality as God playing a game of hide and seek with itself for it's own excitement and cosmic jokeThe difference or potential complete non-difference between the experience and the experiencerThat what you think of as outside yourself is actually just a hidden you“We have within us a higher self who is pretending to be the ordinary everyday person that we are, who's acting it. In other words, our everyday life is a dream from which we have the possibility of waking up.” – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

Alan Watts pulls back the veil of ‘the human game,' digging into language, ethics, finding balance, and the art of the controlled accident. Today's podcast is sponsored by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode, Mark Watts introduces Alan Watts in ‘Learning the Human Game' – originally recorded at a seminar at the University of Michigan. In this lecture, Alan explores the connection between language and ethics, helping us understand why the perfect balance between randomness and order is the optimal middle-ground for experiencing life.This series is brought to you by the Alan watts organization and Ram Dass' Love Serve Remember Foundation. Visit Alanwatts.org for full talks from Alan Watts.“Mental health is a good game—and a good game is what keeps a certain balance between randomness and order. And a healthy society, therefore, is one which keeps a proper balance between law and whimsy.” – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

PWE pääsi haastattelemaan LeffaMedian edustajana ikonista elokuvasäveltäjä Alan Silvestriä ja lauluntekijä Glen Ballardia, jotka loivat rakastettuun klassikkouudistukseen Pinocchio (ohj. Robert Zemeckis) viisi alkuperäistä laulua. Erityisesti kiinnosti Alanin vastaus, miltä tuntui tehdä yhteistyötä Tom Hanksin (Geppetto) ja Luke Evansin (Coach Rider) kanssa, jotka näyttelevät live-näytellyssä elokuvassa.  Molemmat taiteilijat tunnetaan monista kuuluisista teoksistaan ja yhteistöistään. Silvestri on säveltänyt yli 100 elokuvaan, joista ehkä tunnetuimmat ovat Paluu tulevaisuuteen trilogia, Forrest Gump, Avengers-trilogia, Cast Away, Captain America ja Abyss. Ballard tunnetaan elokuvista kuten Titan A.E. ja sadoista tutuista lauluista Michael Jacksonille (esim. Thriller, Bad, Dangerous) ja monille muille artisteille kuten  Katy Perry, Alanis Morisette, Van Halen, Aerosmith jne. Mukana myös muita toimittajia, joilta todella hyviä kyssäreitä - bongaatko PWEn kyssärin? :) #pinocchio #alansilvestri #glenballard Ugly Cookie Forever

Contemplating the coincidence of opposites within the 'human game,' Alan ponders the simple yet thought-provoking question: is existence serious?Today's podcast is brought to you by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode of Being in the Way, Mark introduces a lecture from his father Alan Watts called 'Coincidence of Opposites' – the first talk in a seminar called 'Learning the Human Game,' given in 1965 at the University of Michigan to a small group of psychology and philosophy grad students."One has to get used fundamentally to the notion that different things can be inseparable—that what is explicitly two, can at the same time be implicitly one." – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

Timothy Leary, Allen Ginsberg, Gary Snyder, & Allen Cohen join Alan Watts on his houseboat to discuss change, the evolution of society, and the practicality of 'dropping out.'Today's podcast is brought to you by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode of Being in the Way, Mark Watts introduces a truly legendary discussion featuring his father Alan Watts, Timothy Leary, Allen Ginsberg, Gary Snyder, and Allen Cohen. Beaming in from the summer of 1967 on Alan's infamous houseboat in Sausalito, CA, this stacked lineup of free-thinkers, beatniks, poets, environmentalists, psychedelicists, and spiritualists dive into heady and practical conversation around "dropping out" into a freer, more natural, tribe-focused society."What we need to realize is there can be a movement, a stirring among people, which can be organically designed instead of politically designed." – Alan WattsSee Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

Binding contrast into paradox, Alan takes us on a journey through the psychology of mystical experience in relation to life and death, followed by a jaunt through the power of nothingness.Today's podcast is brought to you by BetterHelp. Click to receive 10% off your first month with your own licensed professional therapist: betterhelp.com/alanIn this episode of Being in the Way, Mark Watts opens the door to the vault, introducing two rare recordings from his father, Alan Watts. The first lecture, entitled Psychology of Mystical Experience, stems from March 5th, 1972 at San Jose State exploring the paradox of life and death. Recorded on Alan's infamous houseboat in Sausalito, the second talk, Nothingness, highlights the inseparable oneness of contrasts, like form and formlessness.See Privacy Policy at https://art19.com/privacy and California Privacy Notice at https://art19.com/privacy#do-not-sell-my-info.

Özlem Serim , keyifli sohbetiyle Sema Baysal'ın sorularını yanıtlıyor... ❓ Spiritüel yaşam koçluğu nedir? ❓ Spiriütel alanın ilgilendiği sorunlar nelerdir? ❓ Bioenerji nedir? #bioenerji #nelermümkün #spiritüelyaşam

Özlem Serim , keyifli sohbetiyle Sema Baysal'ın sorularını yanıtlıyor... ❓ Spiritüel yaşam koçluğu nedir? ❓ Spiriütel alanın ilgilendiği sorunlar nelerdir? ❓ Bioenerji nedir? #bioenerji #nelermümkün #spiritüelyaşam

Ein Knall in der Wade bei Fabian und Dryneedling nach der Verletzung, die Wiedereröffnung bei Sankt Pauli Athletik und der Wiedereinstieg in das Training sind Thema in der neuen Folge. Auch über Knallerbsen, die Wichtigkeit des Snacks nach dem Training und Beta-Alanin sprechen die beiden Coaches!

Tento týden si podrobně rozebereme Beta Alanin, což je další z našich velice oblíbených suplementů. Pokud tě tato látka zajímá, tak je poslech této epizody správnou volbou! Spousta z vás ho jistě zná z pre-workoutů. Z našeho pohledu je ale jeho použití v tomto směru lehce nepochopené a omezené. V podcastu se dozvíte, jak ho správě dávkovat a časovat, abyste z jeho benefitů těžili opravdu na plno. Budeme se také věnovat tomu, jaký vliv má na sportovní výkon i naše zdraví. Prostě se dozvíte vše potřebné, co o tomto suplementu potřebujete vědět! Brainmarket.cz - 10% slevový kód "ZAHRANICI10" Odkazy na zmiňované studie najdete na našem webu. www.zahranicifitness.cz Díky za poslech a budeme rádi za případné sdílení či jakoukoliv zpětnou vazbu! Instagram - @zahranicifitness Facebook - Za Hranicí Fitness Web Podcastu - www.zahranicifitness.cz

Då var det dags för ett riktigt nördavsnitt igen. Vi går igenom det samlade forskningsläget kring tillskottet Beta-Alanin. Vad är det? Hur funkar det? När funkar det? Vi rekommenderar verkligen att ni läser artikeln Tommy har skrivit till detta avsnitt för att få en bra förståelse för ämnet på presteramera.com.      Tidsschema: 00:32 Avsnittets ämne: Beta-Alanin  02:07 Bakgrund kroppens energisystem 16:00 Vad är Beta-Alanin? Och varför fungerar det som tillskott?  31:00 Vilken duration fungerar Beta-Alanin bäst för och dosering 37:00 Beta-Alanin och Bikarbonat tillsammans  44:00 Partytrick  46:00 Summering Vill du hellre se oss på youtube klickar du här   Mer poddar och artiklar hittar du på Prestera Mera   Värdar  Tommy Ivarsson, Fil.mag Biomedicin (M.Sc.)–Specialisering mot mänsklig prestation.tommy@umara.se   Simon Gustavsson, Fil.kand Biomedicin (B.Sc.)–Specialisering mot områdena kost och träning. simon@umara.se    

Äntligen är de nya versionerna av vårt populäraste träningsprogram någonsin – Bänkpress Boogie – ute!   Eftersom vi älskar att snacka om just bänkpress, närmare bestämt hur man bryter igenom sin platå och blir ihågkommen som gymmets största legend, passar vi på att ägna en god portion av dagens avsnitt åt att snacka om hur vi tänkte när vi uppdaterade programmet.   Så även om just den delen innehåller sin beskärda del smygreklam för vår egen hybris, tror vi att du kan få med dig många matnyttiga tips som du kan applicera på din egen träning, utan att behöva betala en spänn för det.   Därefter visar Daniel att han grävt djupt och länge i ett av de populäraste kosttillskotten på marknaden: beta-alanin. Vilken effekt ger det? För vem passar det? Hur ska du i så fall dosera beta-alaninet? Och vilka bieffekter finns, om ens några?   Sist men inte minst svarar vi på en riktigt mysig lyssnarfråga: Hur gammal måste du egentligen vara innan du behöver ge upp hoppet om att slå nya PB:s på gymmet?   Hålltider: 00:00 - Försnack 05:05 - Dagens första ämne: Hur tänkte vi ned vi skrev nya Bänkpress Boogie och hur kan du använda det i din egen träning? 33:40 - Dagens andra ämne: Allt om kosttillskottet beta-alanin – effekter, dosering och biverkningar 47:10 - Lyssnarfråga: Vid vilken ålder kan man sluta drömma om progression i baslyften? Styrkelabbet sponsras av Gymgrossisten. För att se vilka produkter vi använder och rekommenderar, besök Gymgrossisten.com/styrkelabbet.   ***   Denna podcast produceras av Styrkelabbet. På Styrkelabbet.se hittar du artiklar om styrketräning, träningsprogram, styrkeövningar, kost och kosttillskott.

Beta-Alanin Guide – Wirkung, Nebenwirkungen und die richtige Einnahme Du willst länger Trainieren, mehr Wiederholungen schaffen und größere Trainingsreize setzen, um deine Muskeln zum Wachsen zu bringen? Beta-Alanin gehört zu den bekanntesten unter den Nahrungsergänzungen, es ist gut erforscht und steigert nachweislich deine Leistung. Es ist in vielen Trainingsboostern enthalten und bekannt für das kribbelt das nach der Einnahme auftritt. Wie wirkt Beta-Alanin? Beta-Alanin gehört zu den Beta-Aminosäuren und enthält biogenes Amin, das den Carnosinspiegel deiner Muskeln ansteigen lässt. Dadurch verändert sich der pH-Wert im Muskel langsamer, wodurch es länger dauert bis der Muskel übersäuert; wenn du es langfristig einnimmst, kannst du länger trainieren und schaffst mehr Wiederholungen. Du setzt größere Wachstumsreize und baust mehr Muskelmasse auf. Beta-Alanin wirkt hervorragend zusammen mit Kreatin-Monohydrat, beide kombiniert haben eine grandiose Wirkung. Hat es Nebenwirkungen? Zu den Nebenwirkungen kann man nicht viel sagen, denn es gibt keine; bekannt ist nur das Kribbeln unter der Haut, was man nach der Einnahme spürt, das ist allerdings völlig harmlos. Wie viel Beta Alanin soll ich einnehmen? Die richtige Dosis liegt bei 2 bis 5 Gramm täglich, wann du es einnimmst spiel dabei keine Rolle; die Meisten nehmen es vor dem Training, weil sie das Kribbeln als Motivationsschub empfinden. Welches Beta-Alanin Produkt ist das richtige für dich? Achte darauf das es aus möglichst reinen Rohstoffen besteht, es sollte keine Zusätze wie Siliziumdioxid enthalten; außerdem sind Hersteller die einen guten Ruf haben zu empfehlen. Idealerweise ein Produkt das in Europa oder besser noch in Deutschland hergestellt wurde. Am besten kaufst du es als Pulver und rührst es dir ins Wasser oder den Proteinshake; solltest du das schlecht organisieren können, kannst du dir auch Kapseln oder Tabletten kaufen, die sind aber deutlich teurer. Fazit Für mehr Muskeln empfiehlt es sich täglich 2 bis 5 Gramm einzunehmen, es ist absolut unbedenklich. Wenn dich das Kribbeln stört, verteile die Einnahme auf mehrere kleine Portionen am Tag. In Kombination mit Kreatin ist es absolut sinnvoll; solltest du einen Trainingsbooster mit Beta-Alanin verwenden, ziehe die enthaltene Menge von deiner Tagesdosis ab.

Die Familie A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und vielfältigste aller Transmembranrezeptorfamilien. Ihre Mitglieder spielen eine wesentliche Rolle in fast allen (patho)physiologischen Prozessen. Nach Agonistenbindung aktivieren GPCRs, wie ihr Name andeutet, heterotrimere G-Proteine aber auch G-Protein-unabhängige Signalwege. Die verschiedenen aktiven G-Proteinuntereinheiten (Gα-GTP und βγ) induzieren nach Dissoziation vom Rezeptor entsprechende Signalkaskaden z.B. über Phospholipase A und Cβ. Um eine Fehlregulation zellulärer Prozesse z.B. durch „Überstimulation“ zu verhindern, unterliegen GPCRs strengen Regulationsmechanismen, die ihre Fähigkeit zur Signaltransduktion und ihre Verfügbarkeit an der Zelloberfläche bestimmen. Die Bradykininrezeptoren B1 und B2 (B1R, B2R) gehören zur Familie A der GPCRs, also zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, und werden durch die pro-inflammatorischen Peptide desArg9-Bradykinin/desArg10-Kallidin (DABK/DAK) bzw. Bradykinin (BK)/Kallidin aktiviert. Im Gegensatz zum konstitutiv exprimierten B2R, der nach Stimulation schnell desensitisiert und internalisiert wird, erfolgt eine B1R-Expression fast ausschließlich unter pathophysiologischen Bedingungen über Induktion durch Zytokine. Nach Stimulation wird der B1R nicht internalisiert, sondern verbleibt an der Zelloberfläche. Beide Rezeptoren koppeln sowohl an Gαq/11 als auch an Gαi und aktivieren somit weitgehend identische Signalwege [vor allem Phospholipase Cβ (PLCβ) und „mitogen activated protein kinase“ (MAPK)-Kaskaden]. Durch ihre - besonders im Hinblick auf ihre Internalisierungs-eigenschaften - konträre Regulation, stellen die Bradykininrezeptoren ein interessantes Modell zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen und deren Einflüsse auf die Signalübertragung von GPCRs dar. Beide Bradykininrezeptoren spielen bei inflammatorischen Prozessen eine Rolle. Sie fördern die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine und rekrutieren Immunzellen. Während entzündlicher Ereignisse kommt es zu erhöhter Zytokinfreisetzung z.B. von Interleukin-1β (IL-1β) und dadurch zur de novo Synthese von B1R. Pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, die zur B1R-Expression führen, induzieren unter anderem aber auch einen Anstieg der Körpertemperatur (Fieber), eine häufige Begleiterscheinung inflammatorischer Vorgänge. Trotz des bekannten Zusammenhangs zwischen Inflammation und erhöhter Temperatur war über den Einfluss eines Temperaturanstiegs auf Membranrezeptoren und ihre Signalvermittlung auf zellulärer Ebene bisher nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde - unseres Wissens nach - erstmals auf die Temperatur als regulatorische Komponente für GPCR-vermittelte Signalübertragung eingegangen. Am Beispiel der Bradykininrezeptoren wurde gezeigt, dass die Stärke der Signalübertragung von GPCRs signifikant durch eine Temperaturerhöhung von 37°C auf 41°C beeinflusst werden kann. Hierbei war jedoch zwischen einer Temperaturabhängigkeit des Signalwegs selbst und einer rezeptorspezifischen Temperatursensitivität zu unterscheiden. So wurde die Aktivierung von ERK1/2 unter pathophysiologisch erhöhter Temperatur (41°C; normale Körpertemperatur: 37°C) signifikant gesteigert, unabhängig davon ob sie durch B1 oder B2 Rezeptoren stimuliert wurde. Die gesteigerte Aktivität PLCβ-vermittelter Signalkaskaden bei 41°C konnte hingegen auf eine nur für den B1R spezifische Temperaturabhängigkeit zurückgeführt werden. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass die B1R-Expression unter pathophysiologischen Bedingungen besonders induziert wird, deutet darauf hin, dass der B1R in Kombination mit Fieber eine verstärkte Wirkung im Organismus haben könnte. Ob diese Heilungs-fördernd oder -abträglich wirkt, müsste noch genauer untersucht werden. Neben dem Einfluss der Temperatur wird die Signalübertragung der GPCRs durch die jeweiligen Rezeptorkonformationen und die sich daraus ergebenden Funktionsunterschiede bestimmt. Die Familie A der GPCRs wird durch einige hoch konservierte Strukturmerkmale wie die E/DRY-Sequenz mit R3.50 in der dritten Transmembrandomäne (TM) oder die NPXXY-Sequenz am Ende der siebten TM charakterisiert. Publizierte Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovines Rhodopsin durch eine Salzbrücke zwischen R3.50135 (TM3) und E6.30247 (TM6), auch „ionic lock“ genannt, im inaktiven Zustand gehalten wird. Der B2R ist einer der wenigen Peptid-GPCRs, der ein Glutamat an Position 6.30 (E6.30238) trägt, und eignete sich daher zur Untersuchung der Anwesenheit und Funktion eines möglichen „ionic lock“ auch in „nicht-Rhodopsin“-GPCRs. Für alle bisher entsprechend untersuchten GPCRs ist bekannt, dass R3.50 für eine effiziente G-Protein-Aktivierung unabdingbar ist (selbiges wurde in der vorliegenden Arbeit auch für den B2R bestätigt). Die funktionelle Analyse eines „ionic lock“ anhand einer R3.50 Mutation und G-Protein-abhängiger Kaskaden ist deshalb nicht möglich. Die Rolle eines „ionic lock“ im Hinblick auf G-Protein-unabhängige Mechanismen wie die Rezeptorinternalisierung, einem wichtigen Regulationsschritt für die meisten GPCRs, wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass die Rezeptorendozytose durch Mutation von R3.50128 zu Alanin (R3.50128A), im Gegensatz zur G-Protein-Aktivierung, nicht zum Erliegen kommt. Die mutierten Rezeptorkonstrukte wiesen sogar ein konstitutives Internalisierungsverhalten auf. Dies verwies auf unterschiedliche Funktionen dieser Aminosäure bei der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und bei der Rezeptorinternalisierung. Ein Aufbrechen des möglichen „ionic lock“ durch Mutation von E6.30238 zu Alanin oder Arginin resultierte ebenfalls in konstitutiv internalisierenden Rezeptorkonstrukten. Im Gegensatz zur Endozytose zeigten diese Mutanten zwar keine konstitutive Signalübertragung, wurden aber auch durch prinzipiell als Antagonisten klassifizierte Verbindungen effizient aktiviert. Diese Ergebnisse legen einen mehrstufigen Aktivierungsprozess nahe, dessen Stufen sich durch verschiedene Rezeptorkonformationen mit unterschiedlichen Interaktionsmöglichkeiten für die G-Protein-Rekrutierung/Aktivierung oder mit der Internalisierungsmaschinerie [GPCR-Kinasen (GRKs), Arrestine] auszeichnen. Der wechselseitige Austausch der beiden hoch konservierten Aminosäuren R3.50128 und E6.30238 ermöglichte wahrscheinlich die Bildung eines inversen „ionic lock“, wodurch normales B2R-Verhalten wieder hergestellt wurde. Diese Arbeit zeigt somit erstmals, dass ein Aufbrechen eines möglichen „ionic lock“ in einem Peptidrezeptor unterschiedliche Auswirkungen für die Prozesse der G-Protein-Aktivierung und der Rezeptorendozytose haben kann. Dadurch wird die Annahme bestärkt, dass es bei einem GPCR mehrere aktive Konformationen geben kann, die unterschiedliche Affinitäten gegenüber regulatorischen Proteinen (GRKs, Arrestinen) oder Effektoren (G-Proteinen, Arrestinen) aufweisen und dadurch differenziert zelluläre Signale auslösen können. Die Aufklärung der unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von GPCRs in Kombination mit der Herstellung von Verbindungen z.B. sogenannten „small molecule compounds“, die bestimmte Rezeptorkonformationen mit ihren signalspezifischen Eigenschaften stabilisieren können, wäre möglicherweise für die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten, die nur ganz bestimmte Signalwege modulieren und so eine optimierte therapeutische Anwendung erlauben, hilfreich.

Etioplasten sind hochspezialisierte pflanzliche Organelle der Plastidenfamilie, die während der Skotomorphogenese von Pflanzen gebildet werden. Die Morphologie der Etioplasten unterscheidet sich grundlegend von Chloroplasten, die während der Photomorphogenese gebildet werden. Durch Belichtung von Pflanzen, die im Dunkeln angezogen worden sind, kommt es zur Induktion der Transformation von Etioplasten zu Chloroplasten. Die unmittelbar vor Induktion des biologischen Systems bestehende Zusammensetzung der Proteine und Proteinkomplexe des Etioplasten ist allerdings bislang kaum untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten mehrere spezifische Analysen von plastidären Subproteomen. Ausgewählte Subproteome der inneren Membranen von Etioplasten der Gerste wurden im Vergleich zum Proteom der Thylakoidmembran von Chloroplasten analysiert. Durch die Kombination verschiedener gelelektrophoretischer Trennmethoden für Einzelproteine und Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysemethoden gelangen sensitivste Nachweise niedrig konzentrierter Untereinheiten von Membranproteinkomplexen. Darüber hinaus gelangen der Nachweis niedermolekularer membranintegraler Proteine und die spezifische Charakterisierung von Einzelproteinen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die N-Termini von NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) A und B durch ein LC-MS basiertes Verfahren bestimmt. Es erfolgte die Entwicklung einer Methode zur selektiven Isolation N-terminaler Peptide mittels Höchstdruckflüssigkeitschromatographie (UPLC). Dazu wurden zwei chemische Reaktionsschritte auf Protein- und Peptidebene durchgeführt, wodurch das N-terminale Peptid nach einem tryptischen Verdau ausschließlich acetyliert vorlag und interne Peptide durch eine weitere Modifikation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure abgetrennt wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die N-Termini von PORA und PORB homolog zueinander sind und eine vergleichbare Erkennungssequenz für die prozessierende(n) Protease(n) vorliegt. Das Transitpeptid von PORA ist somit deutlich kürzer, als bislang vermutet, wodurch neue Rückschlüsse bezüglich einer möglichen Bindestelle von Protochlorophyllid gezogen werden konnten, da eine von Reinbothe et al. 2008 beschriebene Bindestelle nicht im Bereich des Transitpeptids, sondern in Bereich der maturen PORA liegt. Bei PORB konnten neben einem dominierenden N-terminalen Peptid zwei weitere um jeweils ein Alanin verkürzte N-terminale Peptide mit geringerer Signalintensität nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine unpräzise N-terminale Prozessierung hin. Im zweiten Teil der Arbeit gelang die bislang umfassendste massenspektrometrische Charakterisierung des NAD(P)H-Dehydrogenase-Komplexes aus einer C3-Pflanze. In Etioplasten konnten sechs plastidär kodierte und mindestens fünf kernkodierte Untereinheiten des NDH-Komplexes identifiziert werden. Dies gelang durch die Isolation des Komplexes mittels nativer PAGE als 1. Dimension und die anschließende Aufkonzentrierung der Untereinheiten in einer SDS-PAGE als konzentrierende 2. Dimension. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der NDH-Komplex bereits in Etioplasten neben dem membranintegralen Subkomplex aus mindestens zwei löslichen Subkomplexen aufgebaut ist. Aufgrund dieser umfangreichen Assemblierung ist eine physiologische Funktion wahrscheinlich und erste Versuche zur NAD(P)H-Dehydrogenase Aktivität lieferten Hinweise auf eine mögliche enzymatische Aktivität. Im dritten Teil der Arbeit gelang in Etioplasten erstmals der Nachweis aller bekannten membranintegralen, niedermolekularen Untereinheiten von Photosystem II, nicht aber von Photosystem I. Die Untereinheiten von PSI konnten ausschließlich in Chloroplasten nachgewiesen werden. Von PSII konnten 13 niedermolekulare Untereinheiten mit jeweils einer Transmembrandomäne nachgewiesen werden. Diese Untereinheiten konnten im Gegensatz zu Chloroplasten nicht in höhermolekularen Komplexen, sondern ausschließlich nahe der Lauffront einer BN-PAGE im Bereich der freien Proteine nachgewiesen werden. Der Nachweis von PsbN war ausschließlich in Etioplasten möglich. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ausschließlich nicht-chlorophyllbindende Untereinheiten von PSII in Etioplasten akkumuliert werden und die Anreicherung von chlorophyllbindenden Untereinheiten von PSI und PSII von der Anwesenheit von Chlorophyll abhängt. Darüber hinaus konnten die vier niedermolekularen, membranintegralen Untereinheiten des Cytochrom b6f-Komplexes in Etioplasten und in Chloroplasten sowohl in der monomeren, als auch dimeren Assemblierungsstufe nachgewiesen werden. Ermöglicht wurden diese Nachweise durch eine neu entwickelte Methode zur Extraktion von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel mit organischen Lösungsmitteln und der anschließenden massenspektrometrischen Charakterisierung mittels offline ESI-MS.

Das Cad-System von E. coli gehört zu den Säure-induzierbaren Aminosäure-Decarboxylase-Systemen und spielt eine wichtige Rolle bei der Säureschutzantwort. In diesem System erfolgt die Reizwahr-nehmung, Signaltranslokation über die Membran und Transkriptionsregulation durch ein einziges Protein, nämlich CadC. In Gegenwart von induzierenden Bedingungen (niedriger pH-Wert und Lysin) aktiviert CadC die Expression des cadBA-Operons, dadurch kommt es zur Decarboxylierung von Lysin zu Cadaverin und CO2 durch die Lysin-Decarboxylase CadA und zum Export von Cadaverin durch den Lysin/ Cadaverin-Antiporter CadB. Dabei werden Protonen aus dem Cytoplasma entfernt und der extrazelluläre pH-Wert durch das basische Cadaverin erhöht. Das Lysin-Transportprotein LysP inhibiert die cadBA-Expression bei nicht-induzierenden Bedingungen, das bei der Decarboxylierung gebildete Cadaverin übt einen negativen Rückkopplungseffekt auf die Expression von cadBA aus. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit wurden die Regulation des Cad-Systems durch CadC und die Lysin-spezifische Permease LysP, die Reizwahrnehmung durch CadC und die Struktur von CadC untersucht. Mittels Transkriptions- und Translationsanalysen wurde das Cad- System u. a. in E. coli MG1655 (Wildtyp) und E. coli MG1655-lysP211 (lysP-negativ) untersucht. Die cadBA- Expression war in E. coli MG1655-lysP211 deutlich höher als im Wildtyp, als Folge dessen war auch die relative Menge an CadA und die Konzentration an extrazellulärem Cadaverin erhöht. Des Weiteren war in dieser Mutante durch den Wegfall des Repressors LysP der Bedarf an extrazellulärem Lysin als Induktor der cadBA-Expression vollständig eliminiert. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Theoretische Physik der Universität zu Köln wurde anhand der für E. coli MG1655 (Wildtyp) gemessenen Daten ein mathematisches Modell erstellt und mit Hilfe dieser Daten die Dynamik des Cad-Systems in E. coli MG1655-lysP211 berechnet. Die in vivo bestimmten Ergebnisse wurden durch die in silico erhaltenen Daten sehr gut wiedergegeben. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass CadC kein Sensor für Lysin ist. In vitro Experimente (ITC-Messungen, Tryptophanfluoreszenz-Messungen) ergaben, dass CadC nur eine extrem niedrige Affinität für Lysin aufweist, in vivo war ein bestimmter Schwellenwert für die Induktion der cadBA-Expression nötig, ansonsten hatte die Lysin- Konzentration keinen Einfluss. Da Lysin somit nicht durch CadC wahrgenommen wird und deshalb die Interaktion zwischen CadC und dem Transportprotein LysP nicht über die Konkurrenz beider Proteine um das Substrat Lysin erfolgt, beruht die Lysin-Abhängigkeit der cadBA-Expression vermutlich auf einer direkten Interaktion zwischen CadC und LysP. In vitro konnten CadC und LysP in Proteoliposomen quervernetzt werden, dies indizierte eine Affinität beider Proteine zueinander. Das Vorhandensein von Lysin löst die Interaktion zwischen CadC und LysP auf und ist somit ein wichtiger Schritt für die Aktivierung von CadC. Durch Messungen der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz mit der periplasmatischen Domäne von CadC (CadC188-512) konnte gezeigt werden, dass diese eine Affinität für den Inhibitor Cadaverin aufweist, der KD-Wert hierfür betrug 96 µM. In vivo Experimente bestätigten, dass das Vorhandensein der periplasmatischen Domäne für die Hemmung der cadBA-Expression durch Cadaverin essentiell ist. Somit scheint die Inhibierung der cadBA-Expression durch Cadaverin über eine direkte Interaktion mit der periplasmatischen Domäne von CadC zu erfolgen In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Biologische Chemie der Technischen Universität München wurden Strukturuntersuchungen zu CadC188-512 und CadC mittels 3D-Kristallisation durchgeführt. CadC188-512 konnte sehr gut überproduziert und gereinigt werden, und es entstanden bereits Kristalle, von denen einer am Synchrotron vermessen werden konnte. Die Auflösung (2,5 Å) war jedoch für eine Strukturaufklärung noch zu gering. In der periplasmatischen Domäne von CadC befinden sich zwei Cysteinreste. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnte die Ausbildung einer Disulfidbrücke in CadC188-512 bestätigt werden. Durch die Reduktion der Disulfidbrücke war die Affinität für den Ligand Cadaverin geringfügig vermindert. Das Auflösen der Disulfidbrücke könnte ein wichtiger Mechanismus für die Aktivierung von CadC darstellen. Wurde die Ausbildung einer Disulfidbrücke durch die Substitution der Cysteinreste durch Alanin verhindert, so wurde die cadBA-Expression in vivo Lysin-unabhängig aktiviert. Möglicherweise repräsentieren diese CadC-Derivate ein „semi-aktives“ CadC, das für eine volle Aktivierung nur noch einen Reiz benötigt.

Die kongenitalen myasthenen Syndrome (CMS) bilden klinisch und pathogenetisch eine heterogene Gruppe von relativ seltenen hereditären Erkrankungen des Kindesalters. Sie werden durch unterschiedliche genetische Defekte im Bereich der neuromuskulären Endplatte verursacht und manifestieren sich mit variabler Symptomatik, bei der eine ermüdbare Muskelschwäche das herausragende Kennzeichen ist. Bisher sind zehn verschiedene Gene bekannt, deren Defekte CMS verursachen können. Dazu gehören die Gene, die für Acetylchoilinrezeptor (AChR)-Untereinheiten kodieren, das CHAT-Gen, welches für die Cholin-Acetyltransferase kodiert, das RAPSN-Gen, das SCN4A-Gen, das DOK7-Gen, sowie das COLQ-Gen und das MUSK-Gen. Der Hauptschwerpunkt dieser Arbeit lag auf der molekulargenetischen Untersuchung des COLQ-Gens und des MUSK-Gens. Im COLQ-Gen konnten wir bei 8 Patienten aus 7 unanhängigen Familien 7 verschiedene Mutationen identifizieren, 4 davon waren noch nicht beschrieben worden. Eine Missens-Mutation des COLQ-Gens (T441A) fand sich homozygot in drei unabhängigen deutschen CMS-Familien mit insgesamt vier betroffenen Personen. Dabei führt ein homozygoter Austausch (1321 A>G) im Exon 17 dazu, dass die Aminosäure Threonin, die an dieser Position innerhalb der C-terminalen Region des ColQ-Proteins über viele Speziesgrenzen konserviert ist, durch Alanin ersetzt wird. Da diese Region für die Trimerisierung von ColQ und für die Insertion der AChE/ColQ-Komplexe in der Basallamina essentiell ist, führt der Aminosäurenaustausch zu einem vollständigen Fehlen von der im synaptischen Spalt verankerten Esterase. Die Abwesenheit von AChE im synaptischen Spalt bei den Patienten mit ColQ-CMS führt dazu, dass die klinischen Symptome bei allen Erkrankten auf eine Therapie mit AChE-Hemmern nicht ansprechen oder sich sogar dramatisch verschlechtern können. Deswegen ist die genaue molekulargenetische Charakterisierung bei diesen Patienten für die richtige Therapie sehr wichtig. Das MUSK-Gen spielt eine wichtige Rolle für die Ausbildung der postsynaptischen Strukturen. Die Phosphorylierung von MuSK ist essentiell für die Aggregation der AChR an der posysynaptischen Membran. Aus diesen Gründen kam MUSK als potentielles CMS-Kandidatengen in Betracht. Wir untersuchten 10 Patienten, bei denen die übrigen bekannten CMS-Gene zuvor ausgeschlossen worden waren und konnten bei 5 von ihnen insgesamt 6 Sequenzveränderungen feststellen. Diese erwiesen sich jedoch als Polymorphismen. Eine pathogene Mutation ließ sich nicht nachweisen. Erst im Jahr 2004 wurden von einer französischen Arbeitsgruppe die ersten zwei compound heterozygoten und bis jetzt einzigen MUSK-Mutationen beschrieben. Es scheint, dass Mutationen im MUSK-Gen sehr selten ein CMS verursachen, was sich durch die essentielle Rolle der Tyrosinkinase erklären lässt. Da CMS durch unterschiedliche strukturelle oder funktionelle Veränderungen an der neuromuskulären Endplatte bedingt sind, ist eine präzise klinische und genetische Charakterisierung des CMS wichtig für alle Patienten. Genetische Beratung und pränatale Diagnostik können nur durchgeführt werden, wenn eine exakte Diagnostik auf molekularer Ebene verfügbar ist. Außerdem hat die exakte molekulargenetische Charakterisierung kongenitaler myasthener Syndrome für die betroffenen Patienten große Bedeutung, da sich daraus unterschiedliche Konsequenzen hinsichtlich Prognose, Vererbbarkeit und Behandlungsmöglichkeiten ergeben. Zusätzlich bietet die molekulargenetische Analyse die Möglichkeit, das Verständnis der pathophysiologischen Zusammenhänge der neuromuskulären Übertragung zu erweitern.

Einfluss der F1FO-ATP Synthase-Oligomerisierung auf den bioener-getischen Zustand von Mitochondrien Eine wichtige Funktion der Mitochondrien besteht in der Bereitstellung von ATP, dessen Synthese durch die OXPHOS-Komplexe der Innenmembran bewerkstelligt wird. Zusätzlich besitzt die F1FO-ATP Synthase eine strukturgebende Aufgabe. Dazu bildet diese Oligomere aus, die für die Ausbildung von Cristaestrukturen essentiell sind. Insbesondere die oligomer-spezifischen Untereinheiten Su e und Su g sind dafür, nicht jedoch für die enzymatische Aktivität der F1FO-ATP Synthase, notwendig. Der Einfluss der F1FO-ATP Synthase Assemblierung auf den bioenergetischen Zustand von Mitochondrien wurde in dieser Arbeit untersucht. Teildeletionen der C-terminalen ‚coiled-coil’-Domänen von Su e weisen eine verringerte Stabilität der Oligomere auf. Diese Destabilisierung geht mit einer Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und der Wachstumsrate einher, ist jedoch für die Ausbildung von Cristaestrukturen hinreichend. Des Weiteren sind die enzymatischen Aktivitäten der Atmungskettenkomplexe, die Integrität der Innenmembran sowie die Verlustrate der mtDNA in diesen Mutanten nicht beeinträchtigt. Der beobachtete Phänotyp ist daher nicht auf Sekundäreffekte zurückzuführen. Diese Arbeit unterstützt ein Modell, nach dem die Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu Oligomeren für die räumliche Anordnung auch von anderen Proteinkomplexen in Form von Mikrodomänen für einen effizienten Substratumsatz während der oxidativen Phosphorylierung oder für deren Regulation notwendig ist. Somit hat die Stabilität der F1FO-ATP Synthase-Oligomere einen Einfluss auf die bioenergetische Leistungsfähigkeit von Mitochondrien. Charakterisierung der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 Das Dynamin-ähnliche mitochondriale Protein Mgm1 kommt in zwei Isoformen vor, die möglicherweise an der Ausbildung von Cristaestrukturen beteiligt sind. Die kurze Isoform, s-Mgm1, entsteht in Abhängigkeit von der hochkonservierten Intramembran-Rhomboidprotease Pcp1. Zur genaueren Aufklärung dieser Prozessierung wurde die Topologie und Biogenese von Pcp1 ermittelt. Pcp1 durchspannt die mitochondriale Innenmembran mit sieben Transmembrandomänen und besitzt eine Nin-Cout-Topologie. Untersuchungen zum Import von Pcp1 zeigen, dass dessen Import in die innere Membran von der TIM23-Translokase vermittelt und die mitochondriale Signalsequenz schrittweise durch die zwei Proteasen MPP und MIP entfernt wird. Außerdem wird möglicherweise die C-terminale Transmembrandomäne von Pcp1, entsprechend einem ‚Stop-Transfer’-Mechanismus, in der TIM23-Translokase arretiert und anschließend lateral in die Innenmembran inseriert. Alternativ wird Pcp1 zunächst vollständig in die Matrix importiert und anschließend über den konservativen Sortierungsweg in die Innenmembran inseriert. Die bisherigen Ergebnisse lassen eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Möglichkeiten nicht zu. Aufgrund von Sequenzvergleichen verschiedener Rhomboidproteasen wurden wie in anderen Serinproteasen drei konservierte Aminosäurereste als mögliche katalytische Triade postuliert. Um dies zu untersuchen, wurden diese Aminosäurereste jeweils gegen Alanin ausgetauscht. Zwei dieser Punktmutationen, in Serin-256 oder Histidin-313, führen zur vollständigen Inaktivierung von Pcp1, während die Aminosäure Asparagin-202 für die Aktivität nur partiell notwendig ist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mitochondriale Rhomboidprotease Pcp1 mit einer katalytischen Diade eine besondere Stellung unter den Serinproteasen einnimmt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten Einzelmolekül-Messungen zur Bindung von myristoyliertem Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt werden. Die Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC) und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine Signal/Rausch-Analyse ermöglichte die Bestimmung der Sensitivität und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde für verschiedene prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso stärker, je höher der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten überein, die mit etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen, dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren Peptidkonzentrationen möglich sind. FCS stellt eine präzise Methode zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmembranen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Größenverteilung bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales System dar. Unter dem Einfluss eines natürlichen Surfactants (Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung von Alveofact unabhängig von der Ionenkonzentration ein stabiles Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten Plasmiden. Dagegen führte die Inkubation mit Alveofact zu einer langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in diesem Fall nach 60 min eine Größe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex. Mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die Größe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und höhere negative Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der makroskopischen Viskosität der Polymerlösung wurden die Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver Überschussladung wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen Komplexe ein ähnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe ermöglichte also einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.

Yersinien sind auf Grund ihres spezifischen Typ III-Proteinsekretionssystems (TTSS) in der Lage, nach Anlagerung an Zellen bakterielle Virulenzproteine in das Innere der Wirtszelle zu translozieren. Dies führt zu einer Zellparalyse und bei Makrophagen zum Zelltod. Eines der translozierten Virulenzproteine ist YopP/J, das die Signalwege der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) sowie des Transkriptionsfaktors NF-kB in der Wirtszelle inhibiert. Es wird angenommen, dass YopP/J zur Familie der Cystein-Proteasen zählt. Es zeigt Homologien zu AvrRXV/AvrBst von Xanthomonas campestris, welches eine dem apoptotischen Zelltod vergleichbare sogenannte „Hypersensitive Reaktion (HR)“ bei Pflanzen auslösen kann. Die Bakterien der enteropathogenen Spezies Yersinia enterocolitica, welche nach oraler Aufnahme im terminalen Ileum durch M-Zellen in die Lymphfollikel der Peyerschen Plagues wandern, werden anhand ihrer Oberflächen-(O)- und Geißel-(H)-Antigene in verschiedene Serotypen unterteilt. Unsere Studien haben gezeigt, dass sich einzelne Y. enterocolitica-Serotypen in der Apoptoseinduktion bei Makrophagen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde den Mechanismen der Apoptoseinduktion durch die verschiedenen Y. enterocolitica-Serotypen nachgegangen. Zunächst konnte YopP für die unterschiedlichen Apoptose-Effekte verantwortlich gemacht werden. Durch DNA-Austausch und der anschließenden Modifikation einzelner Aminosäuren zwischen YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O8 und Y. enterocolitica-Serotyp O9 konnte Arginin (R) an Position 143 als essentielle AS der Effektordomäne von YopPO8 definiert werden. YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O9 und Y. enterocolitica-Serotyp O3 besitzt an dieser AS-Position Serin (S). YopPO8 vermittelt deutlich stärker Apoptose als YopPO9 und YopPO3. Der erhöhten Apoptoseinduktion durch YopPO8 geht eine effiziente Unterdrückung der NF-kB-Aktivierung vorraus. Die Inhibition des antiapoptotischen NF-kB-Signalwegs durch YopP scheint Voraussetzung für die Apoptoseinduktion durch Yersinia zu sein. Des weiteren wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems nach neuen unbekannten intrazellulären YopP-Interaktionspartner gesucht. Aus einer Maus-Milz-cDNA-Genbank konnten 22 potentielle YopP-Interaktionspartner isoliert werden. In in vitro-Bindungsstudien konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt eine Interaktion von YopP mit vier Proteinen (PP2Ac, FWD2, eEf1bb, Smad1) bestätigt werden. Weiterführende Bindungs- und Funktionsanalysen werden noch durchgeführt. Die möglichen Auswirkungen dieser Interaktionen werden diskutiert. Die durchgeführten Studien erbrachten zudem Hinweise auf eine Modifikation von YopP in der Wirtszelle. Darüberhinaus konnte mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems der Interaktionsbereich von YopP mit seinem Zielprotein IKKb eingeschränkt werden. Die durchgeführten Bindungsanalysen mit IKKb-Deletionsmutationen weisen auf eine Bindung von YopP an den IKKb-N-Terminus hin. Das Ergebniss wurde durch in vitro-Bindungsstudien bestätigt. Unter anderem scheint Alanin an IKKb-Position 120 die Interaktion mit YopP zu bestimmen. So konnten im Rahmen dieser Doktorarbeit unterschiedliche Aspekte der Wechselwirkung von Y. enterocolitica YopP mit der Wirtszelle und Wirtszellproteinen analysiert werden. Diese Studien tragen zum besseren Verständnis der Immunmodulation durch pathogene Bakterien bei.